We beschrijven hier de werking van een microfluïdische apparaat dat continue en hoge-resolutie microscopische beeldvorming van enkele ontluikende gistcellen kunnen gedurende hun volledige replicatie en / of chronologische levensduur.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
We demonstreren het gebruik van een eenvoudige microfluïdische setup, waarbij enkele gist cellen gedurende hun gehele levensduur kan worden gevolgd. De microfluïdische chip maakt gebruik van het verschil in grootte tussen moeder en dochter cellen met behulp van een array van micropads. Bij laden, worden de cellen gevangen onder deze micropads, omdat de afstand tussen de micropad en dekglas is vergelijkbaar met de diameter van een gistcel (3-4 um). Na het laden wordt kweekmedium continu doorgespoeld chip, die niet alleen zorgt voor een constante en gedefinieerde milieu gedurende het gehele experiment, maar ook spoelt de nieuwe dochtercellen, die niet onder de elektroden vanwege hun kleinere afmetingen behouden. De setup behoudt moedercellen zo efficiënt dat in een experiment tot 50 individuele cellen kunnen worden gecontroleerd op volledig geautomatiseerde wijze gedurende 5 dagen of eventueel langer. Bovendien, de uitstekende optische eigenschappen van de chip mogelijk highResolutie beeldvorming van cellen tijdens het hele verouderingsproces.
Inleiding
Ontluikende gist is een belangrijk modelorganisme voor veroudering onderzoek 1. Tot voor kort studeren replicatieve veroudering in gistcellen een bewerkelijk proces waarbij een uitsnijmethode, waarbij elke top handmatig werd uit de moedercel 2,3. Om dit probleem op te lossen, hebben we onlangs een nieuwe microfluïdische setup staat om individuele moeder cellen te volgen gedurende hun hele levensduur 4.
In onze microfluïdische chip, worden gistcellen gevangen onder zacht elastomeer gebaseerde micropads (zie figuur 1). Een continue stroom van medium spoelt nieuw gevormde dochtercellen dat de cellen met verse voeding. In een experiment, kan tot 50 moedercellen worden gecontroleerd op volledig geautomatiseerde wijze gedurende de gehele replicatieve levensduur. Door de uitstekende optische eigenschappen van de microfluïdische chip, is het mogelijk om verschillende aspecten van gist celbiologie (bijv. gelijktijdig controleren met behulp van fluorescerende eiwitten).
Vergeleken met de klassieke uitsnijmethode, de microfluïdische opstart biedt aanzienlijke voordelen. Het zorgt voor een gedefinieerde en constante milieu gedurende de hele veroudering experiment. Het vereist geen dure gespecialiseerde apparatuur en kan worden uitgevoerd op elke microscoop uitgerust met automatische scherpstelling en time-lapse vaardigheden en temperatuur-controle voor celkweek. De productie en exploitatie van de microfluïdische chips geleerd kan worden binnen een paar dagen. Daarnaast kunnen cellen direct worden geladen van een exponentieel groeiende kweek, een voordeel boven andere onlangs microfluïdische wijze 5 dat biotinylering van moedercellen vereist. Een combinatie met hoge-resolutie afbeelding, de hier beschreven werkwijze kan worden gebruikt om geleidelijke veranderingen te meten in cellulaire morfologie, eiwit expressie en lokalisatie tijdens gist veroudering op een ongekende manier. De mogelijkheid omlangdurige bewaking van de afzonderlijke cellen biedt ook unieke mogelijkheden voor gist celcyclus studies.
Deze methode is een onlangs geoptimaliseerd om de biotinylering van het protocol 16, dat werd gepubliceerd terwijl dit manuscript in beoordeling verwijderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Productie en bereiding van een silicium wafer Mold
Microfluïdische chips zijn gemaakt van een silicium wafer mal geproduceerd door zachte lithografie. Deze wafers kunnen vele malen worden hergebruikt om microfluïdische chips te produceren. Het is raadzaam dat de productie van een respectievelijke wafer wordt uitgevoerd door een groep gespecialiseerd in microfluïdische 6.
De wafel wordt in twee stappen fotolithografische proces gebruikmakend van twee verschillende lagen van negatieve fotolak SU-8 7. De onderste laag wordt gebruikt om de cel trapping gebied (SU-8 2002, hoogte 3-4 urn) te genereren, terwijl de kanalen zijn gemaakt met de toplaag (SU-8 2010, hoogte 10 urn). Een impressie van de wafer productie-proces kan worden gevonden in Huang et al. 8. De tekeningen van de microfluïdische chips kunnen worden verkregen van de auteurs, alsmede advies over hoe je een respectievelijke wafer te verkrijgen.
- Zodra de wafer wordt verkregen, snijd een stuk van Tough-Tag into dunne stroken van ongeveer 0,5 mm bij 3 mm met een scalpel en plaats ze voorzichtig op de schijf enigszins boven de kanaalstructuur tussen de inlaatkanalen en micropad matrix (figuur 2A). Dit resulteert in de vorming van een grote extra kanaal in elke chip, die niet alleen tijdens de celdeling laden worden, maar is ook belangrijk voor de stabiele werking van het microfluïdische apparaat.
- Dek de glazen petrischaal met een dubbele laag aluminiumfolie en zet de wafer in de petrischaal. De aluminiumfolie voorkomt PDMS wordt uitgevoerd tussen de wafer en de petrischaal. Als PDMS doet kruipen tussen de wafer en de glazen petrischaal, zal de wafer worden definitief vastgesteld in de petrischaal. Hoewel de wafer nog bruikbaar, zal het niet mogelijk zijn de glazen petrischaal vervangen als het breekt en PDMS moet daarna worden weggesneden.
2. Productie van Microfluïdische Chips
- Plaats een lege plastickop op de balans en de tarra van de balans. Giet 40 g PDMS base in de plastic beker (voor een 12 cm diameter glazen petrischaal). Voeg PDMS verharder met een disposable pipet in een w / w verhouding van 01:10, dat wil zeggen ongeveer 4 ml.
- Meng de PDMS en verharder grondig gedurende enkele minuten. Dit kan de plastic wegwerp pipet die werd gebruikt om het uithardingsmiddel pipetteren. Het is belangrijk dat het mengsel goed gemengd voor het gieten bovenop de wafer. Slechte menging zal deel uitmaken van de PDMS niet te polymeriseren veroorzaken.
- Giet de PDMS bovenop de wafer in de glazen petrischaal.
- Mengen van PDMS met verharder leidt tot belvorming in het PDMS mengsel. Deze belletjes moeten worden verwijderd voordat het PDMS polymeriseert. De PDMS kan worden ontgast na gieten bovenop de wafer door het plaatsen van de petrischaal in een exsiccator verbonden met een vacuümpomp. Met deze opstelling, het duurt ongeveer 30 minuten om alle luchtbellen uit het mengsel te verwijderen.
- Polymeriseren the PDMS door het plaatsen van de Petri schaal met de wafer op een hete plaat bij 120 ° C gedurende 1 uur en daarna bij 65 ° C gedurende een uur.
- Verwijder de aluminium folie met de wafel en gepolymeriseerde PDMS de glazen petrischaal. Trek het aluminiumfolie en de resterende dunne laag van gepolymeriseerde PDMS van de achterkant van de wafer. De laag PDMS bovenop de wafer kan dan van de wafer gescheiden door tillen voorzichtig.
- Plaats de PDMS-laag ondersteboven (met de kanalen naar boven) op de bank en knip de enkele chip ontwerpen afgedrukt op de PDMS voorzichtig met een scalpel. Probeer ongeveer 3 mm van PDMS behouden rond de randen van de kanalen om bevestiging van de chip later verbeteren om de dekglas.
- Perforeren de PDMS aan de uiteinden van de inlaat, uitlaat en zijkanaal (Figuur 2A) door op een 20 Gauge Luer stub helemaal door de PDMS op een rechte wijze.
Zorg ervoor dat de PDMS-chipwordt nog steeds ligt ondersteboven op de bank terwijl het ponsen van de gaten. Dit voorkomt PDMS plakken aan de binnenkant van het kanaal, dat verstopping van het kanaal kunnen veroorzaken.
- Na het ponsen elk gat, verwijder de kolom van PDMS in de Luer stub met een pincet voordat de stub trekken weer. De kolom PDMS zou anders blijven achter en blokkeert het gewoon gaatje.
- Reinig het oppervlak van de chip van stofdeeltjes en overblijvende PDMS door het plaatsen van plakband op en onmiddellijk verwijderen van de tape weer. Zo ook het reinigen van de dekking van glas waarop de chip zal worden gehecht.
- Leg de schoongemaakte chip en dekking van glas onder de UV-lamp van het tafelmodel UV-Ozon Cleaner. De partijen die samen moeten worden gebonden voor de lamp.
- Expose de PDMS en dekglaasjes het UV-licht gedurende 6-8 min en vlak daarop zetten de chip op het dekglas door het plaatsen van de blootgestelde oppervlakken elkaar.
- Tik voorzichtig rond de zijkanten van de chiptot bevestiging van de PDMS bevorderen om de dekking van glas en om eventuele luchtbellen te verwijderen. Druk niet op de top van de channel-structuur, omdat dit kan leiden tot de micropads om gehecht te raken aan de dekking van glas ook.
- Plaats de nieuw gemaakte microfluïdische opstelling op een hete plaat bij 100 ° C gedurende 60 minuten. Test de sterkte van de binding tussen het dekglaasje en PDMS chip door te proberen iets omhoog de randen van de chip PDMS. Wanneer de PDMS blok niet kan worden opgetrokken glazen oppervlak, de hechting is succesvol en de chip is klaar voor gebruik.
3. Voorbereiden van de Spaander voor Cell Laden
Falen van een microfluïdische apparaat kan mogelijk lekkage van medium veroorzaken in de microscoop. Om dit te vermijden, is het advies om een metalen houder gebruiken en / of zegel van de zijden van de chip waar het PDMS voldoet het glas met nagellak of epoxy lijm. Dit voorkomt lekkage van medium bij het PDMS chip is niet goed genoeg gebonden aan het dekglas. Ook de buisverbindingen kunnen worden vastgezet rond de insertie in het op vergelijkbare wijze lekkage van medium te voorkomen. Een zelfgemaakte water sensor die schakelt de spuit pomp in geval van lekkage kan gebruikt worden als een extra veiligheidsmaatregel. Tekeningen van de metalen houder speciaal ontworpen voor de microfluïdische chip kan worden verkregen van de auteurs.
- Plaats de microfluïdische chip in de metalen houder, met siliconengel tussen het glas van de chip en de metalen delen van de houder om een waterdichte afdichting te creëren. Schroef de moeren voorzichtig, niet om het glas te breken.
- Sluit dunne buisjes (ca. 5-15 cm lang) aan het zijkanaal en het afvoerkanaal van de chip. Het gebruik van een pincet vergemakkelijkt de slang voegen in de gaten.
- Vul een 50 ml Luer-Lok spuit met kweekmedium, verwijdert de lucht uit de spuit en sluit deze achtereenvolgens aan een spuit filter, een 20 Gauge Luer stub, een korte dikke buis (ca. 2 cm lang) en een dunne buis. Zorg ervoor dat de dunne bade is lang genoeg om de afstand tussen de spuitpomp en de microscooptafel overspannen.
- Plaats de spuit in de spuit pomp, snel vooruit de pomp totdat de dunne buis wordt volledig gevuld met medium.
- Duw de dunne buis verbonden met de spuit in het inlaatkanaal van de chip en laat de mediumstroom door de chip in 10 gl / min (Figuur 2B). Verzamel het medium waardoor de chip (bijv. in een petrischaal). Het medium zal opraken via het zijkanaal vanwege de weerstand verschil tussen de Tough-label maakte grote nevengeul en de uitlaat kanaal.
- Plaats de chip op de microscoop podium en zet de focus van de microscoop op de pads.
Het gebruik van immersie doelstellingen olie heeft de voorkeur boven die van onderdompeling doelstellingen water omdat olie zal niet uitdrogen over de tijd-verloop van het experiment.
Afhankelijk van de microscoop kunnen er problemen met het behoud van de fOcus tijdens de eerste uren van het experiment. Het is daarom raadzaam om de chip te verlaten voor een tot twee uur in de microscoop podium, zodat het naar beneden kan regelen voordat cellen en het starten van het experiment.
4. Laden van de gistcellen in de Microfluidic Chip
- Sluit een 5 ml Luer spuit met een 20 Gauge Luer stub en een dikke buis (ca. 3 cm).
- Neem een monster van de celcultuur in de chip worden geladen.
De aangewezen celgetal voor het laden is tussen 1-5 x 10 6 cellen per ml. Culturen met een hogere cel tellingen moeten worden verdund vóór het laden. Bij het kweken van cellen op YPD, kan cel laden efficiency worden verbeterd vele malen als de cellen eerst worden gewassen met en gesuspendeerd in minimaal medium met een vergelijkbare glucose percentage vóór het laden. Tijdens de werking van de chip, YPD medium kan weer veilig gebruikt worden.
- Laad ongeveer 1 ml van de celsuspensie in ee spuit en verwijder alle lucht uit de spuit.
- Verlaag de stroomsnelheid van de spuitpomp tot 0,5 gl / min. De lage en aanhoudende stroom afgedwongen door de injectiepomp tijdens het laden (in stap 4.5) zal aandringen niet-ingeschrevenen cellen uit via het zijkanaal (figuur 2C).
- Verbind de spuit met de celsuspensie aan de buis van het uitlaatkanaal. Plaats de cellen door op de plunjer van de injectiespuit zachtjes. Let op de cellen die in en afwikkeling onder de micropads via de oculaire of via het computerscherm.
- Handhaaf de druk op de zuiger totdat voldoende cellen te regelen onder de pads. De optimale belasting is 1-3 cellen per blok. Zoals cellen vestigen onder de pads willekeurig, is het vrij normaal dat een paar pads bevatten geen cellen en andere pads zijn volledig gevuld met cellen.
- Koppel de spuit gebruikt voor cel laden en de dikke buis verbonden met het uit de dunne buis van de uitlaat kanaal, spoelt de kant channel voor een paar minuten bij hogere stroomsnelheden (10 pl / min) om luchtbellen en / of cellen die niet de chip (figuur 2B) nog niet verlaten te verwijderen. Indien cellen niet uit het zijkanaal worden verwijderd, kunnen ze beginnen te groeien in het zijkanaal en interfereren met het experiment later.
- Zet de stroom van de spuitpomp terug tot 0,5 gl / min en sluit het zijkanaal af door deze op een dikke buis (ca. 5 cm lang) met een katheter plug aan het uiteinde (figuur 2D).
- Vrij waardoor een uiteindelijke stroomsnelheid van 1,5 ul / min. Debieten kunnen variëren, afhankelijk van medium en giststam.
- Start een filmpje met de microscoop en camera-instellingen geschikt zijn voor het doel van het experiment. Zorg ervoor dat de snelheid van de microscoop podium is ingesteld op zo'n lage snelheid die de olie kunnen volgen. Voor de bepaling van replicatieve levensduur, image cellen elke 10 minuten. Om cellen te beschermen tegen de kleine hoeveelheden UV-licht dat wordt uitgezonden door de halogeenlamp, die wordt gebruikt tijdens DIC acquisitie, is het raadzaam om een extra UV-filter te plaatsen in de lichtweg. Bij gebruik van fluorescentiemicroscopie, heeft het de voorkeur beeld de cellen minder vaak (bijvoorbeeld elke 20 minuten) fototoxische effecten te vermijden. Het experiment is voltooid wanneer alle cellen geladen bij de start van het experiment zijn dood, die onder normale omstandigheden duurt tot 5 dagen. Het wordt aanbevolen om regelmatig de aandacht van de beelden tijdens het experiment en zonodig bijstellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit protocol worden de cellen geladen in de microfluïdische chip direct vanaf mid-exponentiële cultuur. Te bepalen of de leeftijdsverdeling van cellen opgesloten in de microfluïdische chip is vergelijkbaar met dat van de cultuur vóór het laden werden de cellen gekleurd met tarwe agglutinine geconjugeerd aan FITC (WGA-FITC) te lopen littekens visualiseren. Zoals te zien is in figuur 3, wordt het insluiten van cellen onder de micropads van de microfluïdische chip niet voorgespannen naar cellen van een ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De microfluïdische hier beschreven methode is een belangrijk nieuw instrument in het verouderen onderzoek als het in staat stelt eenvoudig en automatisch genereren van gist replicative levensduur data in combinatie met een continue hoge resolutie imaging. Deze eigenschappen zijn belangrijke verbeteringen in de experimentele mogelijkheden van de klassieke uitsnijmethode, maar er zijn enkele beperkingen van de methode waarmee rekening moet worden gehouden.
Merk op dat de bepaalde replicatieve ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij willen Laura Schippers bedanken voor het schrijven van de eerste versies van de cel laden protocol en Marcus de Goffau en Guille Zampar voor het maken van mitochondriale morfologie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | Deze verpakking bevat PDMS base en PDMS curing agent. |
| Glass petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Wordt aangeduid als dunne buis |
| Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Wordt aangeduid als dikke buis |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Zelf gemaakt; Neem voor details contact op met de corresponderende auteur | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optioneel: Metalen houder voor cover glass (22x40 mm) | Zelf gemaakt; Neem voor details contact op met de corresponderende auteur | ||
| (Fluorescentie) Microscoop met 60x objectief, autofocus, time-lapse mogelijkheden en bij voorkeur een geautomatiseerde (gemotoriseerde XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
Referenties
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209(2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297(2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275(2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
