Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist

Summary

We beschrijven hier de werking van een microfluïdische apparaat dat continue en hoge-resolutie microscopische beeldvorming van enkele ontluikende gistcellen kunnen gedurende hun volledige replicatie en / of chronologische levensduur.

Abstract

We demonstreren het gebruik van een eenvoudige microfluïdische setup, waarbij enkele gist cellen gedurende hun gehele levensduur kan worden gevolgd. De microfluïdische chip maakt gebruik van het verschil in grootte tussen moeder en dochter cellen met behulp van een array van micropads. Bij laden, worden de cellen gevangen onder deze micropads, omdat de afstand tussen de micropad en dekglas is vergelijkbaar met de diameter van een gistcel (3-4 um). Na het laden wordt kweekmedium continu doorgespoeld chip, die niet alleen zorgt voor een constante en gedefinieerde milieu gedurende het gehele experiment, maar ook spoelt de nieuwe dochtercellen, die niet onder de elektroden vanwege hun kleinere afmetingen behouden. De setup behoudt moedercellen zo efficiënt dat in een experiment tot 50 individuele cellen kunnen worden gecontroleerd op volledig geautomatiseerde wijze gedurende 5 dagen of eventueel langer. Bovendien, de uitstekende optische eigenschappen van de chip mogelijk highResolutie beeldvorming van cellen tijdens het hele verouderingsproces.

Introduction

Ontluikende gist is een belangrijk modelorganisme voor veroudering onderzoek ^1. Tot voor kort studeren replicatieve veroudering in gistcellen een bewerkelijk proces waarbij een uitsnijmethode, waarbij elke top handmatig werd uit de moedercel ^2,3. Om dit probleem op te lossen, hebben we onlangs een nieuwe microfluïdische setup staat om individuele moeder cellen te volgen gedurende hun hele levensduur ^4.

In onze microfluïdische chip, worden gistcellen gevangen onder zacht elastomeer gebaseerde micropads (zie figuur 1). Een continue stroom van medium spoelt nieuw gevormde dochtercellen dat de....

Protocol

1. Productie en bereiding van een silicium wafer Mold

Microfluïdische chips zijn gemaakt van een silicium wafer mal geproduceerd door zachte lithografie. Deze wafers kunnen vele malen worden hergebruikt om microfluïdische chips te produceren. Het is raadzaam dat de productie van een respectievelijke wafer wordt uitgevoerd door een groep gespecialiseerd in microfluïdische ^6.

De wafel wordt in twee stappen fotolithografische proces gebruikmakend van twee verschillende lagen van negatieve fotolak SU-8 ^7. De onderste laag wordt gebruikt om de cel trapping gebied (SU-8 2002, hoogte 3-4 urn) te g....

Results

In dit protocol worden de cellen geladen in de microfluïdische chip direct vanaf mid-exponentiële cultuur. Te bepalen of de leeftijdsverdeling van cellen opgesloten in de microfluïdische chip is vergelijkbaar met dat van de cultuur vóór het laden werden de cellen gekleurd met tarwe agglutinine geconjugeerd aan FITC (WGA-FITC) te lopen littekens visualiseren. Zoals te zien is in figuur 3, wordt het insluiten van cellen onder de micropads van de microfluïdische chip niet voorgespannen naar cellen van een .......

Discussion

De microfluïdische hier beschreven methode is een belangrijk nieuw instrument in het verouderen onderzoek als het in staat stelt eenvoudig en automatisch genereren van gist replicative levensduur data in combinatie met een continue hoge resolutie imaging. Deze eigenschappen zijn belangrijke verbeteringen in de experimentele mogelijkheden van de klassieke uitsnijmethode, maar er zijn enkele beperkingen van de methode waarmee rekening moet worden gehouden.

Merk op dat de bepaalde replicatieve .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DC Sylgard 184 elastomer	Mavom bv	1060040	Deze verpakking bevat PDMS base en PDMS curing agent.
Glass petri dishes 120/20 mm	VWR International	391-2850
Cover glasses 22x40 mm	CBN Labsuppliers BV	190002240
Tough-Tags	Sigma-Aldrich	Z359106
Aluminum foil
Plastic disposable cup
Serological pipette 5 ml	VWR International	612-1245
Scotch tape	VWR International	819-1460
Baysilone paste (GE Bayer silicones)	Sigma-Aldrich	85403-1EA
PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD	Cole Parmer	EW-06417-11	Wordt aangeduid als dunne buis
Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD	Cole Parmer	EW-06418-03	Wordt aangeduid als dikke buis
Scalpel	VWR International	233-5334
50 ml Luer-Lok syringes	BD	300137
5 ml syringes, Luer tip	VWR International	613-1599
Tweezers	VWR International	232-2132
20 Gauge Luer stubs	Instech Solomon	LS20
Syringe filters (pore size 0.20 μm)	Sigma-Aldrich	16534K
Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm	Instech Solomon	SP20/12
Petri dishes	VWR International	391-0892
EQUIPMENT
Benchtop UV-Ozone Cleaner	NOVA Scan	PSD-UVT
Harvard Pump 11 Elite	Harvard Apparatus	70-4505
SU-8 silicon master mold (wafer)			Zelf gemaakt; Neem voor details contact op met de corresponderende auteur
Balance	Sartorius corporation	ED4202S
Vacuum pump	KNF Neuberger	N022 AN.18
Desiccator	VWR International	467-2115
Hot plate	VWR International	460-3267
Optioneel: Metalen houder voor cover glass (22x40 mm)			Zelf gemaakt; Neem voor details contact op met de corresponderende auteur
(Fluorescentie) Microscoop met 60x objectief, autofocus, time-lapse mogelijkheden en bij voorkeur een geautomatiseerde (gemotoriseerde XY control) stage	Nikon	Eclipse Ti-E