Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten

Samenvatting

Kv dysfunctie wordt geassocieerd met hartritmestoornissen. Om de moleculaire mechanismen die leiden tot dergelijke aritmieën we een systematische protocol gebruiken voor isolatie van atriale en ventriculaire hartspiercellen uit Kv kanaal bijkomende subunit knockout muizen. Geïsoleerde cardiomyocyten kan vervolgens direct worden gebruikt voor cellulaire elektrofysiologische studies, biochemische of immunofluorescentie (IF) testen.

Samenvatting

KCNE genen coderen voor een kleine familie van Kv kanalen bijkomende subeenheden die heteromere complexen met Kv kanalen alfa subeenheden vormen om hun functionele eigenschappen te wijzigen. Mutaties in KCNE genen zijn gevonden in patiënten met hartritmestoornissen zoals lange QT syndroom en / of atriale fibrillatie. De precieze moleculaire pathofysiologie die leidt tot die ziekten nog onduidelijk. In eerdere studies de elektrofysiologische eigenschappen van de ziekte veroorzakende mutaties in deze genen zijn meestal onderzocht in heterologe expressie systemen en we kunnen niet zeker of de gerapporteerde effecten kunnen direct worden vertaald in de moedertaal van hartspiercellen. In ons laboratorium hebben we daarom gebruik maken van een andere aanpak. Wij direct de effecten van KCNE gendeletie in geïsoleerde cardiomyocyten van knockout muizen door cellulaire elektrofysiologie - een unieke techniek die we beschrijven in dit nummer van het Journal of Gevisualiseerd Experimenten. De harten van genetically ontworpen KCNE muizen snel uitgesneden en gemonteerd op een Langendorff-apparaat door aorta canule. Vrije ^{Ca2 +} in het myocardium is gebonden EGTA en dissociatie van cardiomyocyten wordt dan bereikt door retrograde perfusie van de kransslagaders met een speciale laag Ca ^{2 +} buffer met collagenase. Atria, vrije rechter ventrikel wand en het linker ventrikel kan dan worden gescheiden door microchirurgische technieken. Calcium wordt vervolgens langzaam toegevoegd naar geïsoleerde cardiomyocyten in meerdere stappen omvattende wassen. Atriale en ventriculaire hartspiercellen gezonde uiterlijk zonder spontane contracties worden dan onmiddellijk onderworpen aan analyses door elektrofysiologische patch clamp techniek of andere biochemische analyses binnen de eerste 6 uur na isolatie.

Protocol

1. Animal Anesthesie en het oogsten van organen

1. Verdoven de muis door intraperitoneale (ip) injectie van Ketamine (200 mg / kg BW) en xylazine (20 mg / kg BW).
2. Om anticoagulate injecteren 250 IE Heparine ip om de bloedstolling en trombose te voorkomen.
3. Wacht tot diepe narcose bereikt, die wordt gekenmerkt door areflexie. Om te controleren of areflexie, test cornea reflex door voorzichtig aan te raken het hoornvlies of de testvlucht reflex door staart knijpen.
4. Breng de muis op operatietafel en zet deze vast in rugligging.
5. Incise de huid en de buikwand onder de zwaardvormig en voer clamshell thoracotomie: de snede aan beide zijden strekken zich uit langs de ribbenboog en vervolgens delen van ribben in de mediale axillaire lijn, af te buigen de ribbenkast naar boven.
6. Open pericardium, zoek grote vaten. Druk zachtjes op het hart caudaal van beter weer te geven van de aorta. Klem de aorta behulp van een tang.
7. Plaats het hart holte van een paar s cissors en ontleden alle verbindingskabels schepen met een enkele snit. Zorg ervoor dat u een groot genoeg deel van de aorta ascendens voor Langendorff canulatie behouden.
8. Onmiddellijk over uitgesneden hart een Petri schaal gevuld met ijskoud en pre-oxygenized oplossing 1 (oplossingen, zie tabel 1).

2. Voorbereiding van Hart en Langendorff perfusie

1. Canule de aorta met een 1.8F stalen canule. Zorg ervoor dat u luchtembolie te voorkomen.
2. Fixeren aorta op de canule met een chirurgische hechtdraad en gelijk kransslagaders met 1 ml van oplossing 1.
3. Verbinding canule met een Langendorff-apparaat.
4. Zorg ervoor dat de tijd van thoracotomie tot Langendorff cannulatie niet meer dan 120 sec tot uitgebreide ischemie / reperfusie schade te voorkomen aan de hartspier.
5. Perfuseren hart met 10 ml ^van Ca2 ⁺ vrije oplossing 2 (4 ml / min).
6. Perfuseren hart met collagenase oplossing 3 8 min. (4 ml / min).

le "> 3. Microchirurgische Dissociatie van hartkamers

1. Transfer hart in een voorverwarmde 100 mm petrischaal met laag ^{Ca2 +} oplossing 4.
2. Verwijder voorzichtig de aorta en andere niet-cardiale weefsel met een schaar en gooi deze weg.
3. Aparte atria en de ventrikels en afzonderlijk verder te gaan met elke kamer. Houden cellen ondergedompeld in oplossing 4. Gebruik kleine hoeveelheden (minder dan 5 ml).

4. Verdere Dissociatie van cardiomyocyten

1. Atriale cardiomyocyten:
   1. Te individualiseren atriale cardiomyocyten de atria over in een aparte voorverwarmde 100-mm cultuur schotel en dissociëren van het weefsel door middel van het voorzichtig uit elkaar met fijne pincet. Zorgen voor een nagenoeg volledige dissociatie van het weefsel.
   2. Gebruik een pipet 1 ml met een vergrote vuurgepolijst plastic pipet om de cellen te schorten in 1 ml van oplossing 5 gedurende 5 minuten.
   3. Scheid de cellen van afval door gebruik van een mobiele filter (200 pm maaswijdte).
   4. Voeg 5 ml oplossing 5 aan de celsuspensie en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 16 xg bij kamertemperatuur.
   5. De volgende stappen worden uitgevoerd onder een celkweek kap. Verwijder het supernatant en geresuspendeerd de pellet in 5 ml oplossing 6.
   6. Na bezinking door zwaartekracht gedurende 10 min in een 15 ml buisje gecentrifugeerd gedurende 1 minuut bij 16 xg bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen, afhankelijk van de hoeveelheid daarvan in 1-5 ml van de oplossing 6.
2. Ventriculaire cardiomyocyten:
   1. Ontleden de linkerventrikel gebied van belang met fijne forceps in 5 ml oplossing 4.
   2. Schorsen cellen voorzichtig pipetteren totdat het meeste cellen worden gescheiden. Breng de celoplossing na filtering (200 um maaswijdte) in een 50 ml buis, voeg een volume van 25 ml.
   3. Centrifugeer gedurende 2 min. bij 16 xg bij kamertemperatuur.
   4. De volgende stappen worden uitgevoerd onder een celkweek kap. Supernatant te verwijderen, resuspendeer de pellet in 25 mlOplossing 6 en laat sedimentatie van de cellen gedurende 10 minuten.
   5. Tel de cellen en verwijder het supernatant, voeg 25 - 50 ml oplossing 6 op de cellen.

5. Voorbereiding van cardiomyocyten voor Cellulaire elektrofysiologie, Biochemische of IF Studies

1. Voor elektrofysiologie studies Houd de myocyten in oplossing 6 in een 50 ml buis en remmen sedimentatie.
2. Voor biochemische studies, bijv. calcium beeldvorming plaat myocyten op laminine beklede celkweekschaal (eindconcentratie 20 ug / ml laminine in PBS).
3. Voor immunofluorescentiekleuring stelt een celkweekschaal plaat met glazen dekglaasjes en gecoat met laminine oplossing (eindconcentratie 50 ug / ml laminine in PBS).
   1. Verwijder de oplossing voor het uitplaten myocyten. Plaat de cellen en controle van de celdichtheid met behulp van een microscoop.
   2. Laat de myocyten zich aan slip gedurende 1 uur bij 37 ° C zijn in 2% CO _2, verwijdert de oplossingen onmiddellijk beginnen met een standaard kleuringsprocedure protocol.
   3. Incuberen met fixatief, bijvoorbeeld 4% PFA in PBS (pH 7,5) gedurende 10 min bij kamertemperatuur en volgen drie wasstappen PBS gedurende 5 minuten elk.
   4. De cellen permeabiliseren en remmen onspecifieke antilichaambinding de myocyten incuberen met 10% serum, 0,3% Triton, 0,2% BSA in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Incuberen met het primaire antilichaam gedurende 1 uur bij 37 ° C en was zoals eerder beschreven.
   6. Incuberen met het secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De kernen tegenkleuring en α-actinine gebruik DAPI en fluorochroom geconjugeerd phalloidin (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
   7. Na het wassen de overdracht van de glazen dekglaasjes voorzichtig van silaan behandeld microscoopglaasjes en embed cellen in fluorescentie fixeermiddel.

6. Cellular Elektrofysiologie

1. Voer Whole-cell patch-clamp opnamen op frequentieshly geïsoleerde atriale en ventriculaire hartspiercellen bij kamertemperatuur.
2. Overdracht gezonde verschijnen cardiomyocyten in perfusie kamer gevuld met een bepaald volume van de extracellulaire bad oplossing. 117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH _{2PO 4,} 4 mM _NaHCO3, 1,7 mM _MgCl2, 3 mM _CoCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose en 0,02 mM tetrodotoxine (TTX) (pH 7,4) . Gebruik NaOH voor pH-waarde-aanpassing.
3. Gebruik de juiste patch-clamp-apparatuur (dat wil zeggen IX71 omgekeerde microscoop, een Multiclamp 700B versterker, een Digidata 1440A acquisitie systeem en PC met pClamp10.3 software (Molecular Devices)).
4. Gebruik patch pipetten met weerstanden van 3-5 MQ gevuld met intracellulaire oplossing die 130 mM KCl, 2 mM _MgCl2, 11 mM HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na ₂ ATP, 0,4 mM GTP Na _2, 5 mM Na ₂ CP en 4,9 mM _CaCl2 (pH 7,2). Gebruik KOH voor pH-waarde-aanpassing.
5. Evoke uiterlijke K + stromen during 4,5 sec voltage stappen potentialen tussen -60 en +50 mV in stappen van 10 mV van een bedrijf potentiaal van -70 mV na een 20 msec tot -40 mV prepulse testen.
6. Zorg ervoor dat lekstromen zijn altijd <100 pA.
7. Voor dissectie van verschillende K + stromen met specifieke remmers zoals 4-aminopyridine (4-AP, ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA), Heteropodatoxin 2 (HpTx2, Alomone) of tetraethylammonium (TEA, Sigma). Stock oplossingen moeten worden bereid in de extracellulaire bad-oplossing, en rechtstreeks op de dichtst mogelijke nabijheid van de cel via een microtip na "baseline"-opnames. Equilibratie moeten worden toegestaan ​​voor 2-3 min. voor "drug"-opnames.
8. Voor de analyse normaliseren huidige amplitudes in individuele cellen om de celgrootte (whole-celmembraan capaciteit). Gegevens analyseren offline met behulp van pClamp10.3 software (Molecular Devices) of vergelijkbare software.

Resultaten

Isolatie van volwassen muizen cardiomyocyten van genetisch gemanipuleerde muizen om de functie van bepaalde genen van belang in vitro studie is een krachtig instrument om inzicht cardiale pathofysiologie. Deze methode wordt momenteel gebruikt door slechts een klein, maar groeiend aantal fundamentele wetenschap laboratoria over de hele wereld. Echter, isolatie van volwassen ventriculaire hartspiercellen murine lastig en moet grondig en herhaaldelijk worden uitgevoerd door ervaren handen. Figuur 1

Discussie

Met de groeiende ontwikkeling van genetisch gemanipuleerde muizenstammen de hartfunctie en cardiale pathologie over gendeletie bestuderen er ook een toenemende belangstelling voor gespecialiseerde methoden om de effecten van het specifieke gen deletie in vitro bestuderen. In ons laboratorium bestuderen we de rol van een familie van Kv kanalen bijkomende subeenheden op de cardiale repolarisatie. De KCNE genen bestaan ​​uit een gezin van 5 genen (KCNE1-5) die een belangrijke rol in de menselijke...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens	Vennootschap
Tetrodotoxine	Alomone
4-aminopyridine	ICN Biomedicals
Heteropodatoxin 2	Alomone
Tetraethylammo	Sigma Chemicals
Collagenase Type 2	Worthington