In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

Samenvatting

Ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen aan te passen als reactie op gedrags-uitdagingen. Een In vivo Twee-foton beeldvorming methode wordt hier beschreven die het mogelijk maakt het volgen van dergelijke moleculaire veranderingen in individuele corticale neuronen door middel van genetisch gecodeerd verslaggevers.

Samenvatting

De hersenen het vermogen te veranderen in reactie op ervaring is essentieel voor gezonde hersenfunctie, en afwijkingen in dit proces bijdragen van verschillende hersenaandoeningen ^1,2. Om een ​​beter begrip van de mechanismen waarmee hersencircuits reageren bieden een dier vereist het vermogen om de ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in een bepaalde set van neuronen monitoren gedurende een langere periode, in het levende dier. De ervaring en bijbehorende neurale activiteit bekend genexpressie veranderingen in neuronen ^1,2 veroorzaken ^de meeste methoden om dergelijke veranderingen te detecteren niet mogelijk herhaalde waarneming van dezelfde neuronen over meerdere dagen of niet voldoende resolutie om acht individuele neuronen ^{3 , 4.} We beschrijven een methode die in vivo twee-foton microscopie combineert met een genetisch gecodeerd fluorescerende reporter ervaring-afhankelijke genexpressie in de individuele corticale neuronen volgen de loop van dag tot dag bieden.

Een van de gevestigde ervaring-afhankelijke genen is Activity-gereguleerde cytoskelet geassocieerde eiwit (Arc) ^5,6. De transcriptie van Arc is zeer snel en zeer geïnduceerd door verscherpte neuronale activiteit ³ en het eiwitproduct reguleert de endocytose van glutamaatreceptoren en langdurige synaptische plasticiteit ^7. De expressie van Arc is op grote schaal gebruikt als een moleculaire marker om neuronale circuits betrokken bij specifieke gedrag ³ kaart. In de meeste van deze studies werd Arc expressie gedetecteerd door in situ hybridisatie of immunohistochemie in vaste hersencoupes. Hoewel deze methoden blijkt dat de expressie van Arc werd gelokaliseerd op een subset van neuronen na exciterend gedrag bieden, hoe de patronen van cellulaire Arc expressie kan veranderen met meerdere episodes van herhaalde onderscheidend ervaringen over dagen niet onderzocht. ntent "> In vivo twee-foton microscopie een krachtige manier om ervaring op-afhankelijke cellulaire veranderingen in het levende brein ^8,9 onderzoeken biedt. Om het onderzoek van de Arc expressie in levende neuronen mogelijk te maken door twee-foton microscopie, we eerder genereerde een knock- in muizenlijn waarin een GFP reporter wordt geplaatst onder de controle van de endogene promoter Arc ^10. Dit protocol beschrijft chirurgische preparaten en imaging procedures voor het bijhouden bieden afhankelijke Arc-GFP expressie patronen in neuronale ensembles in het levende dier. In deze werkwijze , chronische craniale ramen werden eerst geïmplanteerd in Arc-GFP muizen over de corticale gebieden plaats. Deze dieren werden vervolgens herhaaldelijk afgebeeld door twee-foton microscopie na gewenste gedragsparadigma's in de loop van enkele dagen. Deze methode kan algemeen voor dieren met andere fluorescerende verslaggevers van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen ^4.

Protocol

De experimentele procedures die hieronder worden beschreven werden goedgekeurd door het National Institute of Mental Health Animal Care en gebruik Comite en waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren.

1. Pre-operatieve voorbereiding

1. Reinig alle gereedschap in een hete kraal sterilisator voor aseptische chirurgie, het reinigen van de operatie site met 70% ethanol, en zette schoon drop doeken. Draag steriele handschoenen. Verdoven van het dier met vers bereide 1,2% avertin oplossing gegeven van 0,02 ml / g, intraperitonially. U kunt ook verdoven met isofluraan gas via een neuskegel, 5% voor inductie, 1,5% voor onderhoud, met een passieve aaseter circuit. Controleer de anesthesie niveau met behulp van de staart of teen knijpt om volledige sedatie te garanderen.
2. Bedek het dier ogen met steriele oogzalf, en injecteer vers bereid dexamethason (0,2 mg / kg) en carprofen (5 mg / kg) subcutaneously de hersenen zwelling en ontsteking ¹¹ voorkomen. Scheer het haar over de schedel tussen de oren, en steriliseer de huid met betadine scrub en drie afwisselende swabs van 70% ethanol.
3. Monteer het dier in een stereotaxisch operatie stadium met earbars, met watercirculatie verwarmingselement onder de dierenset bij 37 ° C. Controleer regelmatig het dier anesthesie niveaus, en een aanvulling op de oorspronkelijke verdoving dosis als dat nodig is.
4. Injecteer 200 ul van 0,5% Marcaine onder de hoofdhuid om het gebied te verdoven. Incise de huid en verwijder de huid flap over de schedel. Verwijder het periost en droog het gebied met schone wattenstaafjes.

2. Chronische Cranial Window Chirurgie

1. Gebruik een hoge snelheid tandheelkundige boor met een 0,5 mm boor tot een 3-5 mm cirkel met een diameter zachtjes schetsen over de hersenen regio van belang. Van tijd tot tijd nat de boorlocatie met een steriele 0,9% zoutoplossing en duidelijke weg bot stof met schone wattenstaafjes. Als het bot bloedt, gebruik gelfoam geweekt met een steriele zoutoplossing om de bloeding vlek en tot het stopt met wachten.
2. Wanneer de laatste bot laag is bereikt, tillen en het bot eiland te verwijderen met fijne punt tang. Dura bijlagen bij de onderste plank van het bot zich kunnen voordoen als het venster steekt een bot hechtdraad. Deze moeten voorzichtig worden verwijderd als het bot flap wordt opgeheven.
3. Roll bevochtigd gel schuim zachtjes over de blootgelegde dura aan het oppervlak schoon te maken en voor elke durale bloeden te stoppen wachten Critical stap:. Niet verder voordat alle durale bloeden is gestopt. Bloed dat wordt gevangen in de craniale venster leidt meestal tot een ondoorzichtige raam.
4. Als het gebied van belang onder een locatie waar de dura is bijzonder dik, het verwijderen van de dura bovenstaande nodig zijn. Als dit het geval is, voorzichtig onder de dura scheiden van de pia met zeer fijne forceps, een kleine incisie in de opgeheven dura maken met een andere paar fijne pincetten, pak de snijranden en voorzichtigsplitsing van de dura. De dura is dun maar sterk, dus wees voorzichtig niet naar de hersenen snijden met de intacte randen van de dura.
5. Spoel het gebied met steriele ACSF of een steriele zoutoplossing.
6. Leg een steriele glazen dekglaasje (3-5 mm) over de dura of pia Critical stap:. Wanneer er te veel schedel curves gebruikt Kwiksil ¹² hechtmiddel te vullen ruimten waar de dura of pia zou nauw contact niet met de dekglaasje in regio die niet worden afgebeeld.
7. Gebruik cyanoacrylaat gel om het elastomeer kleefmiddel en de randen van het dekglaasje bedekt dekken. Bedek de hele blootgesteld schedel met cyanoacrylaat gel of een krazyglue en tandheelkundig cement mengsel Critical stap:. Laat geen cyanoacrylaat gel naar de hersenen oppervlak niet aanraakt.
8. Embed een op maat gemaakte metalen kop fixatie bar aan de andere kant van de schedel.
9. Het dier terug naar een warme kamer herstel, na een injectie van intraperitonial ketoprofen, 5 mg / kg, for pijnbestrijding. Verdere analgetische nog twee dagen post-operatief.
10. Na twee weken van het postoperatieve herstel, het dier verdoven met isofluraan (5% voor inductie, 1,5% voor onderhoud), te monteren in een op maat gemaakte microscoop podium met een hoofd-fixatie frame, en controleer de craniale venster voor optische helderheid onder belichting met blauw licht. Brain oppervlak bloedvat duidelijkheid is een sterke aanwijzing van craniale venster kwaliteit. Indien het bloedvat randen scherp, het venster waarschijnlijk bruikbaar. De twee weken durende post-operatieve hersteltijd wordt aanbevolen om voldoende tijd voor het dier om te herstellen van een operatie mogelijk te maken. Craniale ramen meestal leeg te maken en te verbeteren in deze tijd, en blijven optisch transparant voor extra weken tot maanden tot hergroei van de schedel of verdikking van de dura degradeert venster kwaliteit.

3. Behavioral protocol en laser scanning van twee-foton microscopie

1. Dieren met duidelijke cranial vensters worden blootgesteld aan een milieu stimulus of aan een gedrags training en daarna afgebeeld op het moment van maximale Arc-GFP expressie. Alvorens te beginnen met een gedrags-protocol gebruikt, dient het dier te worden bewaard in een consistente kooi-omgeving tot dag-tot-dag variatie te minimaliseren in de baseline Arc-GFP expressie niveaus.
2. Beginnen gedragstraining of milieu stimulatie paradigma, afhankelijk van de hersenen gebied van belang. Bijvoorbeeld kunnen dieren worden blootgesteld aan verschillende visuele omgevingen op opeenvolgende dagen, en afgebeeld dagelijks bij visuele stimulatie stimulus-specifieke responsen te identificeren in de visuele cortex ^10.
3. Arc-GFP-fluorescentie in neuronen bereikt doorgaans een piek niveau twee uur na stimulatie. De experimentele tijdlijn kan worden geoptimaliseerd voor het detecteren van Arc-GFP expressie in neuronen bevorderen op hun hoogtepunt fluorescentieniveaus.
4. Na een gedrags-training of milieuveranderingenl stimulatie is voltooid, verdoven van het dier met isofluraan (5% voor inductie, 1,5% voor onderhoud) en monteer het dier in de custom-made microscoop podium met hoofd-fixatie frame onder de twee-foton microscoop.
5. Het dier hoofdpositie is bevestigd aan het hoofd-bevestigingskaderplaat die rechtstreeks op de fase met de geïmplanteerde metalen staaf op de schedel. Isofluraan en zuurstof continu toegevoerd aan de muis via een neuskegel. De lichaamstemperatuur wordt onderhouden met behulp van een verwarmingselement.
6. Zorg ervoor dat de microscoop detectoren worden beschermd tegen omgevingslicht door het uitvoeren van twee-foton laser scanning in een donkere kamer. Gebruik een 20x of 25x (1,05 numerieke apertuur) water immersie lens voor de beeldvorming. Ten eerste, onder epi-fluorescentie verlichting, verwerven een beeld van het oppervlak bloedvat patronen over het gebied van de hersenen van belang met een CCD-camera voor toekomstige beeld uitlijning.
7. Start twee-foton laser scanning om een ​​3-D beeld stack te verwerven. Een Olympus FV1000MPE multi-foton microscoop wordt gebruikt in onze setup. De excitatie golflengte van de twee-foton laser ingesteld op 920 nm, en de kracht van de laser uitgezonden door het doel is ingesteld op ongeveer 50 mW. Uitgezonden fluorescentie wordt gelijktijdig gedetecteerd in groen en rood kanalen (dichroïsche spiegel bij 570 nm, barrière filters op 495 tot 540 nm en 570 tot 625 nm), met behulp van een externe tweekanaals photomutiplier detectiesysteem dicht in de buurt met het model. Arc-GFP-fluorescentie verschijnt alleen in het groene kanaal, terwijl weefsel auto-fluorescentie wordt in beide kanalen ^{13, 14.}
8. Typische afbeeldingsstapels hebben afmetingen van ongeveer 320x320x100 urn (breedte x lengte x diepte), een horizontale resolutie van 0,5 pm / pixel en een verticale resolutie van 3 um / pixel.
9. Na het verkrijgen van het beeld stack, de terugkeer van de dieren naar de kooi. Laat het dier niet te verstoren tot de volgende gedrags-en imaging-sessie. Herhaal het gedrag en beeldvorming procedure over dagen als wenselijked.. Gebruik de eerder verworven hersenoppervlak bloedvat beeld te oriënteren terug naar dezelfde beeldvorming locatie.

Resultaten

Dit protocol beschrijft een methode om ervaring afhankelijke moleculaire veranderingen in individuele corticale neuronen in levende dieren volgen. Een chronische craniale venster is voor het eerst gemaakt over een corticaal gebied van interesse in een muis die een fluorescerende reporter van genexpressie. Twee-foton microscopie kan vervolgens worden gecombineerd met verschillende gedrag paradigma gedragsmatig geïnduceerde moleculaire veranderingen in individuele neuronen waarnemen en volgen deze wijzigingen in dez...

Discussie

De in vivo imaging hier beschreven werkwijze kan herhaald onderzoek Arc genexpressie verandert op dezelfde sets van neuronen gedurende meerdere dagen in het levende dier. Het is een efficiënte en veelzijdige methode om informatie over neurale plasticiteit gerelateerde moleculaire dynamica in individuele neuronen verkrijgen in reactie op verschillende gedrag vertonen. Standaard histochemische methoden zoals in situ hybridisatie en immunohistochemie kan eencellige resolution ^{3 bereiken,} maar m...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Apparatuur	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
FV1000 multi-foton laser scanning microscoop	Olympus	FV1000MPE	Imaging
Dissectie microscoop	Omano	555V107	Chirurgie
Stereotaxis chirurgie podium voor muizen	Harvard Apparatus	726335	Chirurgie
20X of 25X water immersie objectief	Olympus	XLPL25XWMP	Imaging
Microscoop podium met hoofd-fixatie kader	Custom made	N / A	Imaging
Fijne tang	Fine Science Tools	11.251-20	Chirurgie
Dental boor braam	Fine Science Tools	19.007-05	Chirurgie
CCD camera	QImaging	QICAM 12-bit	Imaging