Meting van Tactiele allodynie in een muizenmodel van bacteriële prostatitis

Marsha L Quick; Joseph D Done; Praveen Thumbikat

doi:10.3791/50158

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meting van Tactiele allodynie in een muizenmodel van bacteriële prostatitis

16.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50158

⸱

16 januari 2013

Marsha L Quick¹ , Joseph D Done¹ , Praveen Thumbikat¹

¹Department of Urology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Infectie van de prostaat kan een bijdragende factor in het bemiddelen bekken pijn bij chronische prostatitis zijn. We beschrijven de procedure voor het bereiden van gestandaardiseerde bacterieel inoculum, instillatie van bacteriën in de urethra van mannelijke muizen en methode voor het meten tactiele allodynie bij muizen in de tijd.

Samenvatting

Uropathogene Escherichia coli (UPEC) zijn ziekteverwekkers die een belangrijke rol spelen bij infecties van de urinewegen en bacteriële prostatitis afspelen ^1. We hebben onlangs aangetoond dat UPEC een belangrijke rol in de initiatie van chronische pijn in het bekken ^2, een kenmerk van chronische prostatitis / chronische bekkenpijn syndroom (CP / CPPS) ^3,4 te hebben. Infectie van de prostaat door klinisch relevante UPEC kunnen initiëren en chronische pijn vast te stellen via mechanismen die weefselschade en de start van de mechanismen van auto-immuniteit ^{05 mei} te betrekken.

Een uitdaging voor het begrijpen van de pathogenese van UPEC in de prostaat is de relatieve ontoegankelijkheid van de prostaat voor manipulatie. We gebruik gemaakt van een eerder beschreven intra infectie methode ⁶ tot en met een klinische stam van UPEC leveren in mannelijke muizen en bepaalt zij aldus een opgaande infectie van de prostaat. Hier beschrijven we onze protocollen voor het standaardiseren van de bacterial inoculum ⁷ en de procedure voor catheterizing verdoofde mannelijke muizen voor instillatie van bacteriën.

CP / CPPS wordt voornamelijk gekenmerkt door de aanwezigheid van tactiele allodynie ^4. Gedrag testen werd gebaseerd op het concept van cutane hyperalgesie als gevolg van genoemde viscerale pijn ^8-10. Een prikkelbare focus in viscerale weefsels vermindert huidpijn drempels waardoor een overdreven reactie op normaal niet-pijnlijke stimuli (allodynie). Toepassing van normaalkracht op de huid resultaat abnormale respons die de neiging te stijgen met de intensiteit van de onderliggende ingewandspijn. We beschrijven methode in NOD / ShiLtJ muizen die von Frey vezels gebruiken om tactiele allodynie tijd kwantificeren in reactie op een infectie met bacteriën UPEC.

Protocol

1. Bacteriën Voorbereiding voor Muis Inoculatie

Het volgende moet worden gedaan onder aseptische omstandigheden.

Neem een 17 x 100 mm polypropyleen buizen met doppen en 3 ml vers Luria bouillon (LB) media. Met behulp van geautoclaveerd tips, neem dan even bevroren bacteriën glycerol voorraad van stam CP1 ² en de overdracht van een kleine hoeveelheid van de cultuur in de buis met de LB media. Plaats het dopje zodat zuurstof is nog steeds in staat om de buis in te voeren - de cultuur moet groeien onder aërobe omstandigheden. Place buis bij 37 ° C in een schudincubator bij 220 rpm overnacht.
De volgende dag overdragen 5 pi kweek gedurende de nacht naar een nieuwe buis met 3 ml LB media en groeien onder statische omstandigheden in een incubator bij 37 ° C.
Op dag 3 overdracht 40 ul van cultuur in aa 50 ml buis met 40 ml LB-medium per stuk. Leg ze in een 37 ° C incubator statische 's nachts.
Schakel en stel centrifuge tot 4 ° C.Zodra centrifuge heeft bereikt eindtemperatuur, breng elke 40 ml cultuur in een 40 ml Nalgene centrifugebuis.
Weeg buizen aan centrifuge evenwicht - volume aan te passen met LB media als dat nodig is. Spin buizen bij 6.000 rpm gedurende 20 minuten.
Verwijder voorzichtig supernatant en voorzichtig bacteriële pellet te schorten in 40 ml steriele PBS.
Herhaal stap 1.5 met PBS.
Zuig uit supernatant en schorten bacteriën in 500 pi steriel PBS. Over in een 1,5 ml microfugebuis. Neem 10 pi van schorsing en verdunnen in 990 ul ijskoude PBS. Gebruik een spectrofotometer de OD _{420 nm} gelezen om de benodigde volume voor inoculatie te bepalen. Om het juiste volume te bepalen van ijskoude PBS tot pellet te schorten: de OD _{420 nm} nummer (in ml) Neem en trek de geschatte hoeveelheid van de bacteriële pellet [ex. OD _{420 nm} = 0,545, pellet ongeveer 0.075 ml. 0,545 tot 0,075 = 0,470].
Verwijder 10 pi bacteriesuspensie en diluit in 990 ul ijskoude PBS. Lees de OD _{420 nm.} Het doel is te komen tot een OD _{420 nm} waarde voor de verdunde suspensie van 1,000 ± 0,010. Als het nummer van uw verdunning is boven deze doelstelling, voegt meer volume aan de suspensie en neem een andere lezing. Als het nummer is onder de 0.990 dan spin down de schorsing en herhaal de OD _{420 nm} lezen tot het verkrijgen van de gewenste lezen.

2. Animal Infectie

Muizen (5 tot 7 weken oud, tien per groep) werden gekocht bij Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Muizen zijn verdoofd door inhalatie van 1-4% isofluraan in een plexiglas kamer en worden bewaakt totdat ligfiets.
Een muis tegelijk wordt genomen voor het inbrengen van bacteriën door catheterisatie met polyethyleen (PE10) katheter bevestigd aan een gemodificeerde 30 G naald van een glazen Hamilton spuit (lengte van 1,5-2,0 cm). De katheter wordt ingebracht op de naaf van de naald. De muis is placed op het dorsale oppervlak onder narcose onderhouden met behulp van een neuskegel.
De penis van de muis is geëxtrudeerd door lichte druk en liberale hoeveelheden smeermiddel op wattenstaafjes wordt gebruikt voor smering van de ingang van de penis urethra.
10 pl fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 1 x 10 ⁸ bacteriën wordt in de urethra van verdoofde muizen na catheterisatie.
Muizen worden gehouden in een verdoofde gedurende 15 min in de kamer Plexiglas na bacteriële inleiding bacteriële hechting mogelijk te maken en onmiddellijk plassen voorkomen.
Muizen worden teruggeplaatst in hun kooien en gecontroleerd voor de volgende 24 uur.

3. Gedrag Testen

Muizen werden getest voor infectie (baseline) en op dag 3, 7, 14, 21 en 28 na infectie. Doorverwezen hyperalgesie en allodynie tactiele werd getest met behulp van von Frey filamenten toegepast op de buik ^11,12 en de plantaire rEgion van de achterpoot ^13. Het testen werd perfomed op een vast tijdstip van de dag, werden standaard methodologie en enkele experimentator het testen van alle dieren gebruikt. Verblind testen van groepen werd gebruikt om de beperkingen van op gedrag gebaseerde pijn proeven te in diermodellen. Vijf individuele von Frey filamenten met krachten van 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 en 4,0 g (Stoelting, USA) werden op de buik en de frequentie van terugtrekking reacties werd berekend.

Na een 30 min periode van acclimatisatie, worden muizen geplaatst in individuele plexiglas kamers (6 x 10 x12 cm) in eigen huis gemaakt met een roestvrij staaldraad roostervloer.
Doorverwezen hyperalgesie en allodynie tactiele werden getest met behulp van de vijf von Frey filamenten. Elke vezel werd gedurende 1-2 sec met een inter-stimulus interval van 5 sec voor een totaal 10 keer, en de haren werden getest in oplopende volgorde van kracht.
Elke vezel wordt toegepast op de onderbuik in de algemene nabijheid van de prostaat enzorg is besteed aan verschillende gebieden te stimuleren in deze regio de desensibilisatie vermijden of "de wind" effecten. Filamenten toegepast in oplopende volgorde van kracht voor 1-2 sec met minstens 5 sec interval tussen stimulaties in totaal 10 maal.
Er zijn drie soorten gedrag worden beschouwd als een positieve reactie op filament stimulatie: 1) scherpe terugtrekken van de buik; 2) onmiddellijke likken of krabben van het gebied van gloeidraad stimulatie; 3) springen.
Frequentiegebied werd berekend als het percentage positieve respons (uit 10, bijvoorbeeld 5 reacties van 10 = 50%) en data werd gerapporteerd als het gemiddelde percentage van de respons frequentie ± SE
Dieren met meer dan 25 positieve totale basislijn reacties zijn uitgesloten van de studie.
Tactiele allodynie werd getest op de plantaire regio van de achterpoot met von Frey filamenten met krachten van 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 en 4,0 g. De mediaan 50% onttrekkingsdrempel (5) werd gemeten met de omhoog-omlaagmethode waarbij testen werd gestart met 0,04 g filament die loodrecht op de voetzool van de achterpoot tot filament lichtjes gebogen. Filamenten werden getest oplopend tot een positieve reactie waargenomen. Een positieve reactie op de gloeidraad werd gedefinieerd als een scherpe terugtrekking van de poot of likken van de test poot. Wanneer een positieve reactie opgenomen de volgende zwakkere filament werd toegepast en als een negatieve respons waargenomen, wordt de volgende sterke filament toegepast.
De experimenten en methodologie beschreven zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Northwestern University verzorging van dieren en het gebruik comite.