De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Samenvatting

Eiwitcomplexen katalyseren belangrijke cellulaire functies. Gedetailleerde functionele en structurele karakterisering van vele essentiële complexen vereist recombinante productie. MultiBac is een baculovirus / insectencelsysteem vooral afgestemd voor het uitdrukken van eukaryote eiwitten en hun complexen. MultiBac werd geïmplementeerd als een open-access platform en standaard operationele procedures ontwikkeld om het nut te maximaliseren.

Samenvatting

Proteomics onderzoek bleek de indrukwekkende complexiteit van eukaryote proteomen in ongekend detail. Het is nu een algemeen bekend begrip dat eiwitten in cellen bestaan ​​meestal niet als geïsoleerde gegeven maar oefenen hun biologische activiteit in combinatie met vele andere eiwitten, in mensen tien of meer, die assemblagelijnen in het vak voor de meeste, zo niet alle vitale functies ^{1. , 2} Kennis van de functie en de architectuur van deze multiprotein assemblages vereist hun bepaling in superieure kwaliteit en voldoende hoeveelheid voor een gedetailleerde analyse. Het gebrek aan vele eiwitcomplexen in cellen, met name in eukaryoten, verbiedt de winning van natieve bronnen en noodzakelijk recombinante productie. De baculovirusexpressievectorsysteem (BEV) is bijzonder nuttig gebleken voor het produceren van eukaryote eiwitten zijn, waarvan de activiteit berust vaak post-translationele processing die andere gebruikelijke expressiesystemen kunnen vaakgeen ondersteuning. ³ BEV gebruik een recombinant baculovirus waarin het gen van interesse is ingevoegd insecten celkweken die op hun beurt het gekozen eiwit infecteren. MultiBac is een BEV die in het bijzonder is ontworpen voor de productie van eukaryotische eiwitcomplexen die veel subeenheden bevatten. ⁴ Een essentiële voorwaarde voor efficiënte productie van eiwitten en hun complexen stabielere protocollen voor alle bij een expressie experiment die ideaal kan worden geïmplementeerd als stappen standard operating procedures (SOP's) en volgde ook door niet-gespecialiseerde gebruikers betrekkelijk gemakkelijk. De MultiBac platform op het European Molecular Biology Laboratory (EMBL) maakt gebruik van SOP's voor alle betrokkenen in een multi-eiwitcomplex uitdrukking experiment stappen, te beginnen met het inbrengen van de genen in een aangelegde baculovirale genoom geoptimaliseerd voor heterologe eiwitproductie eigenschappen aan kleinschalige analyse van het eiwit exemplaren geproduceerd. ^5-8 Het platformwordt geïnstalleerd in een open access-modus bij EMBL Grenoble en heeft vele wetenschappers uit de academische wereld en de industrie om eiwitcomplex onderzoeksprojecten versnellen ondersteund.

Inleiding

Biologische activiteit wordt gecontroleerd door vergaderingen van eiwitten en andere biomoleculen die in onderling overleg handelen om cellulaire functies katalyseren. Sprekende voorbeelden zijn de machines die de erfelijke informatie in DNA in messenger RNA transcribeert. In mensen, meer dan 100 eiwitten samenkomen in een gedefinieerd en gereguleerd proces om genen transcriberen, die grote multiprotein complexen met 10 en meer subeenheden waaronder RNA polymerase II en algemene transcriptiefactoren zoals TFIID, TFIIH en anderen. ⁹ Andere voorbeelden zijn de ribosoom, bestaande uit vele eiwitten en RNA moleculen, die eiwitsynthese of de nucleaire porie complex is verantwoordelijk voor shuttling biomoleculen door de nucleaire envelop in eukaryoten katalyseert. Een gedetailleerde architectuur en biochemische dissectie van nagenoeg alle multicomponent machines in de cel is essentieel om de functie te begrijpen. De structuur opheldering van prokaryote en eukaryotic ribosomen, bijvoorbeeld, vormde keurmerk gebeurtenissen waardoor ongekend inzicht in hoe deze macromoleculaire machines uitvoeren van hun aangewezen functies in de cel. ^10,11

Ribosomen kan voldoende kwaliteit en kwantiteit voor gedetailleerde studie worden verkregen door zuiveren van het endogene materiaal uit gekweekte cellen, vanwege het feit dat tot 30% van de cellulaire massa uit ribosomen. RNA polymerase II reeds minder overvloedig met orden van grootte, en vele duizenden liters gistcultuur verwerkt te worden tot een gedetailleerde atomaire weergave van deze essentiële complex centraal transcriptie verkrijgen. ¹² De overgrote meerderheid van de andere essentiële complexen zijn echter aanwezig veel lagere hoeveelheden in oorspronkelijke cellen, en derhalve niet voldoende worden gezuiverd uit natuurlijke bron materiaal. Om dergelijke complexen toegankelijk te gedetailleerde structurele en functionele analyse maken vereist heterologe productie met behulp van recombinant techniques.

Productie van recombinant eiwit had een grote impact op life science onderzoek. Vele eiwitten zijn recombinant geproduceerd en hun structuur en functie ontleed bij hoge resolutie. Structurele genomica programma's hebben gebruik gemaakt van de opheldering van de genomen van vele organismen aan het genproduct repertoire van gehele organismen in high-throughput mode (HT) te pakken. Duizenden eiwitstructuren zijn aldus bepaald. Tot op heden is de meest overvloedig gebruikt voor recombinant eiwitproductie geweest E. coli en vele expressiesystemen ontwikkeld en verfijnd door de jaren heterologe in deze gastheer. De plasmiden een overvloed aan functionaliteiten om eiwitproductie mogelijk in E. coli vullen hele catalogi van commerciële aanbieders.

Echter, E. coli heeft bepaalde beperkingen waardoor het ongeschikt voor veel eukaryote proteïnen te produceren en in particulaire eiwitcomplexen met vele subeenheden. Daarom heeft eiwitproductie in eukaryotische gastheren steeds meer de werkwijze van keuze in de afgelopen jaren. Een bijzonder geschikt systeem eukaryote eiwitten is het baculovirus expressie-vectorsysteem (BEV) dat steunt op een recombinant baculovirus die de heterologe genen insecten celkweken gekweekt in het laboratorium infecteren. Het MultiBac systeem is een recent ontwikkelde BEV die vooral is aangepast voor de productie van eukaryotische eiwitcomplexen met vele subeenheden (Figuur 1). MultiBac werd voor het eerst geïntroduceerd in 2004. ¹³ Sinds de introductie, heeft MultiBac voortdurend verfijnd en gestroomlijnd om behandeling te vereenvoudigen, te verbeteren doelproteïne kwaliteit en in het algemeen maken van het systeem toegankelijk is voor niet-gespecialiseerde gebruikers door het ontwerpen van efficiënte standard operating procedures (SOP's). ⁴ MultiBac is geïmplementeerd in veel laboratoria in de wereld, in academia en industrie. Aan het EMBL in Grenoble, werden transnationale toegang programma's opgezet door de Europese Commissie om deskundig opleiding op het MultiBac platform voor wetenschappers die wilden deze productie systeem te gebruiken voor het bevorderen van hun onderzoek. De structuur en functie van vele eiwit-complexen die tot dusverre niet toegankelijk waren opgehelderd door monsters geproduceerd MultiBac. ⁴ Hierna worden de essentiële stappen van MultiBac productie samengevat in protocollen als in werking op MultiBac faciliteit in EMBL Grenoble.

Protocol

1. Tandem recombineering (TR) voor het maken van Multigene expressie constructen

1. Planning van de co-expressie strategie. Ontwerp aanpak voor het invoegen van uw genen van belang in en acceptoren. Potentiële fysiologische submodules van uw complexe bijeen te worden gebracht van specifieke Handelaren en Donors. Gebruik Vermenigvuldiging Module bestaande uit Homing endonuclease (HE) - BstXI paren tot expressie cassettes combineren op individuele donor en acceptor plasmiden ^7,8 Maak alle relevante constructies in silico en valideren strategie grondig alvorens tot experimenteel werk.. Zo dient genen plaats gecontroleerd niet bevatten HE of andere restrictieplaatsen en de aanwezigheid van juiste open leesramen (ORFs) worden gevalideerd. Overwegen het bestellen van synthetische genen geoptimaliseerd voor insectencelsystemen codongebruik en mRNA secundaire structuur van eiwitten productieniveaus alsmede opheffing van een exi verbeterensting HE sites uit de genen van belang. Overweeg het plaatsen van zuivering tags die zijn gebaseerd op gegevens uit de literatuur over flexibele of blootgesteld N-of C-uiteinden van uw eiwitten van keuze. Overwegen om polyproteïne strategieën die gericht zijn op het produceren van verschillende eiwitsubeenheden in uw complex als de relatieve hoeveelheden van de afzonderlijke eiwitten moeten worden gecontroleerd wegens stoichiometric problemen in het complex. ⁴ Bereid gedetailleerd "How-To" document (elektronisch lab boek wordt aanbevolen) met daarin alle geplande experimentele stappen van het project in de aanloop naar de volledige multigene construct (s). Maak elektronische bestanden van het Cre-LoxP gesmolten plasmiden bijvoorbeeld door het gebruik van het Cre-ACEMBLER software die kan worden gedownload van de Berger groep homepage ( www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / cre-acembler ).
2. Plaats uw genen van belang in geselecteerde Donors enAcceptanten met behulp van restrictie-enzymen en ligase, of, als alternatief, door het gebruik van ligatie onafhankelijke methoden volgens gepubliceerde protocollen. ^5,6,14 Als u toegang tot een liquid handling werk-station hebt en als u van plan een groot aantal constructen te genereren ( bijvoorbeeld voor combinatorische benaderingen) overwegen robotica scripts ontwikkeld en geïmplementeerd door de Berger-groep (figuur 2). ^14,15 Wanneer een liquid handling werk-station niet beschikbaar is, handmatig bij gebruik van microtiterplaten laat gen inbrengen in een HT-achtige manier.
3. Beperkingen opgelegd door de noodzaak om de stoichiometrie van de uitdrukking subeenheden controle kunnen materialiseren. Bij stoechiometrisch onevenwichtige expressieniveaus van individuele subeenheden van een eiwitcomplex, overwegen om polyproteïne strategieën toe verschillende subeenheden van het complex en een specifiek protease (bijvoorbeeld tabak etch virus NIA protease) verbinden in enkele grote ORF gescheiden door sijzondere proteolytische sites. ^4,8 Overweeg co-expressie van een of meerdere polyproteïnen met enkele uitdrukking cassettes als u een zeer groot complex met veel subeenheden en op grote schaal, variërend moleculaire gewichten van de individuele colli. Overweeg co-expressie meerdere genen die coderen voor hetzelfde eiwit in een polyproteïne of meerdere identieke expressiecassettes als dat eiwit wordt gekenmerkt door lage productieopbrengst. ^4,13
4. Valideren alle donor en acceptor constructies gekloond door restrictie mapping (naar keuze in high-throughput) en sequencing. Overgaan tot Donor-Acceptant combinaties zekering door Cre-LoxP recombinatie aan de multigene expressie constructen van keuze te genereren. Valideer gezuiverde Acceptor-Donor fusie plasmiden door restrictie mapping, gebruik van elektronische sequenties door Cre-ACEMBLER en dergelijke meer als referentie.
5. Slaan gezuiverd en gevalideerd Donoren, Acceptanten en donor-acceptor fusies bij -20 ° C of -80 ° C. Archief plasmids en hun sequenties (Microsoft Excel, Filemaker, anderen) zorgvuldig voor later gebruik.

2. Composiet Multigene Baculovirus Generation, Amplification en opslag

1. Integreren multigene transfervectoren de MultiBac baculovirale genoom door transformeren in DH10 cellen die het virale genoom en de functionaliteiten die nodig zijn voor Tn7 omzetting. Merk op dat de Multibac baculovirus genoom worden voorgeladen met bijzondere genen (YFP marker, chaperones, etc.) in zijn eigen LoxP plaats (gemanipuleerd in het genoom distaal van de Tn7 bevestigingsplaats) een in vivo Cre reactiemengsel voorafgaand Tn7 integratie. ¹³ Na Tn7 omzetting, worden cellen met composiet baculovirus met de genen van belang geselecteerd door blauw / wit screening (succesvolle Tn7 omzetting resulteert in het verlies van α-complementering van de β-galactosidase, daarom kolonies met de juiste Tn7 omzetting wit blijven selectief eengar platen die X-gal) en het genoom bereid door alkalische lysis en ethanol / isopropanol precipitatie. ^5,6
2. Transfectie en initiële virusproductie. Plaats 6-well weefselkweek plaat in steriele kap. Van log-fase Sf21 insectencellen celkweek, zaad uit monsters van cellen in de putjes en transfecteren door toevoeging van het gezuiverde baculovirale genoom en een transfectie reagens gemengd in kweekmedia zoals beschreven. ⁶ Harvest oorspronkelijke virus na 48-60 uur door het verwijderen van de media ( hoge kwaliteit, lage titer virus V _0, typisch 3 ml per putje). Supplement vers medium en test voor eiwit (en, indien een YFP marker aanwezig is, voor fluorescentie) na nog eens 2-3 dagen. ^6,7
3. Versterking van het virus, lage MOI regime. Gebruik V ₀ virus tot 25-50 ml van cellen in log-fase (celdichtheid <1x10 ⁶ cellen per ml) infecteren in kleine (100-250 ml) Erlenmeyer schudflessen geagiteerdeop orbitale platform shakers (Figuur 3). Tellen cellen en splitsen elke 24 uur tot cellen stoppen verdubbeling (proliferatie arrestatie). Volg een lage MOI (multipliciteit van infectie wil zeggen het aantal virusdeeltjes per cel) schema: De cellen moeten verdubbelen (ten minste) eenmaal (MOI <1), anders herhaalt experimenteren met een kleiner volume V ₀ toegevoegd. Normaliter worden 3 ml van ₀ V wordt gebruikt om 25 ml van Sf21 insectencellen te infecteren bij een dichtheid van 0.5x10 ⁶ cellen / ml. Dit is essentieel om nadelige voorkomen dat over-amplificatie en automatische verwijdering van virus dat kan leiden tot verlies van de heterologe genen van belang. Harvest V ₁ virus (25-50 ml) na 48-60 uur door pelleteren cellen en het verwijderen van het medium met het virus. Vullen met verse media en test voor YFP en eiwitproductie door het verwijderen van 1x10 ⁶ cellen om de 12 of 24 uur, omhulsels en valideren van eiwitproductie en marker-eiwit (YFP) signaal. ^6, Amplify virus (naarV ₂₎ verder als grotere volumes uitdrukking zijn gericht op het door het infecteren van maximaal 400 ml cellen in 2 L schudflessen met V ₁ virus dat aan de bovenvermelde lage MOI regime (cellen moeten na infectie verdubbelen ten minste een keer met V _1). Streng testen eiwitproductie en marker-eiwit signaal gedurende amplificatie om ophoping van defecte virussen niet langer met uw genen van belang te voorkomen. ^5-7 Gebruik celpellets accumuleren bij elke aanvullingen stap al voor het vaststellen van de zuivering protocollen voor het tot expressie gebrachte eiwit complex van belang.
4. BIIC opslag van productie virus. We raden aan _V2 virus als de productie virus slaan met de BIIC (B aculovirus-i i nfected nsect c ellen) methode, wijzigingen (bv. verlies van het gen van belang) van het recombinante virus te voorkomen en hoge expressie behouden niveaus ¹⁶ Pellet geïnfecteerde cellen 24 uur na proliferatie arrestatie wordt waargenomen -. in dit stadium cellen bevatten volledige virale deeltjes net voordat ze zouden worden vrijgelaten (door knopvorming) in de media. Verwijder media en vries porties van de celpellet in vloeibare stikstof en opgeslagen onbeperkt. ^7,16

3. Eiwit Productie en downstream processing

1. Infecteren grote (re) culturen en monitoring YFP. Gebruik V _1, V ₂ of bevroren BIIC hoeveelheden aan grotere celculturen voor productieruns (meestal 400 ml in 2 L flessen) infecteren. Houd u aan lage MOI regime (passen virus volume gebruikt voor infectie, die besmet cultuur verdubbelt ten minste een keer). Vergroten geïnfecteerde kweekvolumes indien nodig door het aantal kolven vermenigvuldigen. Als YFP marker-eiwit aanwezig is, trekken op bepaalde tijdstippen 1x10 ⁶ cellen, pellet-en lyseren cellen en bewaken evolutie van de YFP signaal totdat een plateau is bereikt indicating maximum recombinant eiwitproductie. YFP niveaus kunnen worden gemeten in een standaard 96 wells plaat lezer kan opnemen fluorescentiesignalen (bijv. Tecan SPECTRAFluor). Oogst cellen in dit stadium. Store cel pellets bij -20 ° C (korte termijn) of -80 ° C (op lange termijn).
2. Cellysis en fractionering. Lyse cellen door uw favoriete preferentiële techniek aangepast aan de behoeften van het eiwit (bevriezen-ontdooien, sonicatie, Franse pers, anderen). ^5-7 fractioneren cytosol en kernen en test voor de aanwezigheid van de eiwitten van belang. Ontwikkel zuiveringsprotocollen basis van de resultaten eiwitzuivering vereenvoudigen. Overwegen om het weken procedures om uw proteïne halen uit de nucleaire fractie onder hoge KCl voorwaarden als je eiwitten bevinden zich in de celkern. ^7,18
3. Eiwitzuivering (micro-schaal, op grote schaal). Merk op dat de vaak kleine hoeveelheden (10 of 25 ml) van celkweek zijn sufficient voor het verkrijgen van cel pellets voor het zuiveren van aanzienlijke hoeveelheden van uw eiwitten van belang vanwege de doorgaans hoge of zeer hoge productieniveaus van heterologe eiwitten in het baculovirus / insectencel systemen (vaak 10-100 mg eiwit per L cultuur en meer). In combinatie met micro-zuivering (multiwellplaten, microtip methoden, GE Healthcare ÄKTAmicro systeem, anderen) is het mogelijk om biochemische en activiteitsgegevens en vaak ook voldoende hoeveelheid van de gewenste eiwitten en complexen voor nanoliter-schaal high-throughput kristallisatie (HTX verkrijgen ). Overweeg het gebruik van metalen affiniteit zuivering (Clonetech Takara TALON, Qiagen NiNTA metaalchelator harsen) en een oligo-histidine (6-10 residuen) tag op blootgestelde subeenheden van uw eiwitcomplex om zuivering te vergemakkelijken, in samenwerking met ionenwisseling en size exclusion chromatografie in kleine volumes met bijvoorbeeld de ÄKTAmicro of soortgelijk klein volume zuivering machine (figuur 4 ). Andere affiniteitszuivering stappen en ionenuitwisseling (IEX) stappen naast de affiniteitszuivering met oligo-histidine tags of andere markeringen (kiezen GST, MBP, CBP, anderen) kunnen en moeten worden beschouwd volgens de biochemische eigenschappen van de eiwitten van belang en individuele voorkeuren. Overweeg tagging meer dan een subunit met affiniteit tags om zuiveringsrendement verbeteren. Concentreer uw gezuiverde eiwit complexen en stellen opslag protocollen zoals bevriezen, met of zonder glycerol. Ontwikkeling criteria kwaliteitscontrole standaard die kan worden toegepast (activiteit assays, biochemische en biofysische tests) batch-to-batch variatie van het gezuiverde eiwit te beoordelen.

Resultaten

Sterke co-expressie van heterologe eiwitten bereikt door MultiBac systeem wordt getoond in figuur 1d (probes die 48 uur na infectie een suspensie celkweek). De overexpressie eiwit bands zijn duidelijk waarneembaar in de gehele cel extract (SNP) en de geklaarde lysaat (SN). De kwaliteit en kwantiteit van het eiwit geproduceerd materiaal is vaak voldoende om structuurbepaling van eiwitcomplexen, zoals mitose checkpoint complex MCC figuur 1e mogelijk. ¹⁷

Discussie

Video snap-shots in figuren 2 en 3 tonen het volledige proces van robot-assisted genereren van cDNA van multigene expressieconstructen tot aan infectie van insecten celkweken voor eiwitproductie. Nieuwe reagentia (plasmiden en virussen) en robuuste protocollen zijn ontwikkeld om een ​​pijpleiding vertrouwen op SOP inschakelen. De gehele pipeline is geïmplementeerd als een platform technologie op het EMBL in Grenoble. De MultiBac platform is toegankelijk door veel wetenschappers van univ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetracycline	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine	Euromedex	EU0420 (25 g)	1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine	SIGMA	G3632 (5 g)	1,000X at 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1,000X at 1M
Cre-recombinase	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
6-well plate Falcon	Dominique Dutscher	353046
2 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357507
5 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357543
10 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357551
25 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357535
50 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357550
50 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352070
15 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352096
1.8 ml cryotube Nunc	Dominique Dutscher	55005
100 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211917
250 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211918
500 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211919
2 L shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211921
Certomat Orbital Shaker + plateau	Sartorius	4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Biological Safety Cabinet Faster	Sodipro	FASV20000606
Optical Microscope	Zeiss	451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus	TECAN
10 μl conductive tips (black),	TECAN	10 612 516
200 μl conductive tips (black)	TECAN	10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted	Eppendorf	0030 128.648
96 well V bottom, non sterile	BD falcon	353263
96 deepwell plate color natural, PP)	Fisher	M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom	Greiner	655101
96 deepwell plate	Thermo scientific	AB-0932
24 well blocks RB	Qiagen	19583
DpnI restriction enzyme	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	homemade		7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1% agarose GP	Life Technologies	G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit	Macherey Nagel	740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq green master mix	Promega	M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	homemade
Urea 2 M	homemade
EDTA 500 mM pH 8.0	Homemade
LB broth (Miller) 500 g	Athena ES	103