Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het gebruik van chemostaten in Microbiële Systems Biology

30.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50168

⸱

14 oktober 2013

 ,  , 
1Center for Genomics and Systems Biology, Department of Biology, New York University

In dit artikel

Samenvatting

Celgroei tarief is een gereguleerd proces en een primaire determinant van cel fysiologie. Continue kweken met chemostaten maakt extrinsieke controle cellen groei met nutriënten limitatie de studie van moleculaire netwerken die celgroei en hoe deze netwerken ontwikkelen om optimale celgroei regelen vergemakkelijken.

Samenvatting

Cellen reguleren hun groeitempo in reactie op signalen van de buitenwereld. Als de cel groeit, moeten diverse cellulaire processen worden gecoördineerd waaronder macromoleculaire synthese, metabolisme en uiteindelijk, betrokkenheid bij de celdeling cyclus. De chemostaat, een methode voor het regelen van experimenteel cel groei, biedt een krachtig middel systematisch bestuderen hoe groeipercentage gevolgen cellulaire processen - met inbegrip van genexpressie en stofwisseling - en de regulerende netwerken die het tempo van de celgroei. Wanneer gedurende honderden generaties chemostaten kan worden gebruikt om adaptieve evolutie van microben in milieuomstandigheden die de celgroei beperkt bestuderen. We beschrijven het principe van chemostaat culturen, tonen hun werking en geeft voorbeelden van de verschillende toepassingen. Na een periode van onbruik na hun introductie in het midden van de twintigste eeuw, de convergentie van genoom-schaal methodologieën met een vernieuwd inlangstelling in de regulatie van de celgroei en de moleculaire basis van adaptieve evolutie is het stimuleren van een renaissance in het gebruik van chemostaten in biologisch onderzoek.

Inleiding

De groei van cellen wordt geregeld door complexe netwerken van op elkaar inwerkende genetische en omgevingsfactoren 1,2. De multifactoriële regulatie van celgroei vereist een systeem-level benadering van haar studie. Echter, de strenge studie van gereguleerde celgroei uitgedaagd door de moeilijkheid experimenteel regelen van de snelheid waarmee cellen groeien. Bovendien, zelfs in de meest eenvoudige experimenten extracellulaire voorwaarden zijn vaak dynamisch en complex als de cellen voortdurend veranderen hun omgeving als ze zich kunnen vermenigvuldigen. Een oplossing voor deze problemen is door de chemostaat: een werkwijze voor het kweken van cellen die experimentele controle cel groei kunnen in bepaalde, invariante en gecontroleerde omgevingen.

Werkwijze continu kweken met een chemostaat werd onafhankelijk beschreven door Monod 3 en Novick & Szilard 4 in 1950. Zoals oorspronkelijk bedacht worden cellen gekweekt in een vast volume van media die continu verdund door toevoeging van nieuwe media en gelijktijdige verwijdering van oude media en cellen (figuur 1). Gekoppelde gewone differentiaalvergelijkingen (figuur 2) beschrijven de mate van verandering in cel dichtheid (x) en de concentratie van een groei-beperkende nutriënt (en) in de chemostaat vat. Belangrijk is dat deze stelsel van vergelijkingen voorspelt een enkele (nul) stabiele steady-state (figuur 3) met de opmerkelijke implicatie dat bij steady-state, de specifieke groeisnelheid van de cellen (dwz de exponentiële groei constant) is gelijk aan het tarief waarbij de kweek wordt verdund (D). Door het variëren van de verdunning is het mogelijk om steady-state populaties van cellen vast te stellen op verschillende groeipercentages en onder verschillende omstandigheden van nutriënten limitatie.

De experimentele controle groei middels chemostaten was cruciaal voor de ontwikkeling van een begrip van hoe celfysiologie veranderingenmet groeipercentages 5,6. Echter, deze voormalige steunpilaar van microbiologische methoden werd steeds obscure tijdens de explosie in het moleculair biologisch onderzoek in de late twintigste eeuw. Vandaag, hernieuwde belangstelling voor de groei controle in zowel microben en meercellige organismen en de komst van genoom-schaal voor systemen-niveau analyse is de motivatie voor het gebruik van chemostaten vernieuwd. We beschrijven hier drie toepassingen die inspelen op de precieze controle van de cel groeicijfers en de externe omgeving die uniek zijn mogelijk met behulp van chemostaten. Eerst beschrijven we het gebruik van chemostaten om te onderzoeken hoe de overvloed van duizenden biomoleculen - zoals transcripten en metabolieten - gecoördineerd worden gereguleerd met de groeisnelheid. Ten tweede, beschrijven we hoe chemostaten kan worden gebruikt om nauwkeurige ramingen van de groei-rate verschillen tussen verschillende genotypen in-nutriënten beperkt omgevingen met behulp van competitie-experimenten verkrijgen. Ten derde, we beschrijven hoe chemostaten kanworden gebruikt om adaptieve evolutie van cellen groeien in constante voedselarme omgevingen te bestuderen. Deze voorbeelden illustreren de manier waarop chemostaten worden waardoor systemen-niveau onderzoeken van de celgroei regelgeving, gen door milieu interacties en adaptieve evolutie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het principe van continue kweken met een chemostaat kan worden gerealiseerd in verschillende implementaties. In alle chemostaten is het essentieel om 1) werkwijzen voor het handhaven van steriliteit alle onderdelen, 2) een goed gemengde cultuur 3) geschikte beluchting van het kweekvat en 4) een betrouwbare media toevoeging en verwijdering cultuur. Hier beschrijven we het gebruik van een Sixfors bioreactor (Infors Inc) als chemostaat gebruik van werkwijzen die gemakkelijk kunnen worden aangepast aan alternatieve opstellingen.

1. Montage van de chemostaat Schepen

  1. Schakel de Sixfors met de hoofdschakelaar.
  2. Spoel de chemostaat vaartuig, roerder assemblage, en aan te brengen slangen met gedeïoniseerd (DI) water. Controleer alle slangen en o-ringen en vervang versleten zoek stukken.
  3. Zorg ervoor dat de aandrijfas draagvlak is naar boven gericht in de glazen vat en dat de bovenkant van de aandrijfas wordt vastgeklikt op zijn plaats op de roerder montage. Stel de stirrer constructie in het glazen vat zodat de onderkant van de aandrijfas is geplaatst in de aandrijfas steun. Gebruik de klem om de roerder is bevestigd aan de glazen vat.
  4. Vul het vat met ongeveer 300 ml DI water.
  5. Verwijder de doppen van een opgeloste zuurstof (DO 2) probe en controleer het elektrolyt niveau door het losdraaien van de onderste behuizing en zorg ervoor dat de onderste behuizing is half gevuld met elektrolyt oplossing. Rescrew de onderste behuizing en invoegen in de haven op de chemostaat schip. Schroef tot handvast.
  6. Neem een ​​pH-sonde en verwijder deze uit de opslag buffer (3 M KCl). Verwijder de pH-sonde dop en hechten aan fermentor 1. Met behulp van de Sixfors controle scherm, navigeer naar de fermentatie-parameter menu en selecteer "kalibreren pH". Plaats de pH-sonde in een standaard pH 7 buffer en opnemen lezen als High lezen. Herhaal dit met pH 4 buffer en opnemen lezen als Low lezen. Maak de pH-sonde van fermentatie, wassen met DI-water en plaats de sonde into de poort op de chemostaat schip. Schroef tot handvast.
  7. Plaats de chemostaat vaartuig in het rek. Let op het schip dat fermentor (1-6) de pH probe aangesloten en gekalibreerd. Plaats de pH-probe dop op de pH-probe. Met behulp van folie strak bedek de bovenkant van de Do 2 sonde.
  8. Vouw folie over de uiteinden van de slang aan de chemostaat vat.
  9. Herhaal de stappen 1,2-1,8 voor alle vaartuigen.
  10. De schepen Steriliseren in autoclaaf ze gedurende 15 min op een vloeibaar cyclus.

2. Voorbereiden van de Media

  1. Bepaal de beperkende reeks concentraties een voedingsstof door te groeien batch culturen in verschillende concentraties nutriënten. De voedingsstof beperkend het bereik waar de uiteindelijke celdichtheid is een lineaire functie van de aanvankelijke concentratie nutriënt (figuur 4). Selecteer een nutriëntenconcentratie ruim binnen de beperkende bereik. Voorbeelden van standaard media samenstelling voor studies met Saccharomyces cerevisiae zijn in 7-11.
  2. Autoclaaf lege mandfles, afgesloten met een rubber stop met een luchtinlaat en mediakanaal na eerst te garanderen dat het uiteinde van de media buis is bedekt met folie.
  3. In een afzonderlijk vat bereiden 10 L media.
  4. Bevestig een 500 ml filter beker in een 100 ml fles media. Verwijder de katoenen filter met een tang gesteriliseerd in ethanol en direct hechten aan de filtratie poort van de media mandfles.
  5. Bevestig de media mandfles een vacuüm bron en filter steriliseren media toe te voegen aan het filter beker.
  6. Wanneer filtratie van media is voltooid, sluit de filtratie-poort met een metalen klem.

3. Kalibreren dO 2 Probes en opzetten chemostaat

  1. Na de chemostaat schepen zijn geautoclaveerd en mogen in de bijbehorende warmte jas afkoelen plaats van het schip. Sluit de temperatuursensor, pH-sonde, en doe 2 sonde. Laat devaartuig zitten met de stroom gedurende minstens 6 uur om de dO 2 sondes polariseren.
  2. Het uiteinde van elk effluent buis in een afzonderlijke verzamel-houderdeel. Sluit de luchttoevoer via een autoclaaf filter en zet luchtstroom. Het water van elk schip moet stromen van het effluent buizen, die aangeeft dat alle afdichtingen correct worden gevormd.
  3. De hoogte van het effluent buis volgens de gewenste werkvolume (bijv. 300 ml). We maken gebruik van een liniaal die is gemarkeerd met buis plaatsingen gekalibreerd om verschillende werken volumes.
  4. Sluit de media mandfles om de chemostaat vat. Gebruik ethanol om buis te houden eindigt zo steriel mogelijk. Rijg de pomp slang door de pomp en open klem. Handmatig op de pomp totdat de media begint te stromen in de chemostaat vat. Laat slang van de pomp, dient de pers vrijelijk in chemostaat vat stromen. Als de media het effluent buis bereikt, sluit slang aan de pomp en klem.
  5. Start running het basisprogramma met waaier ingesteld op 400 rpm en het ingesteld op 30 ° C temperatuur
  6. Om te kalibreren dO 2 sondes, schakelt luchttoevoer en overschakelen naar stikstofgas. Wacht minstens een uur en opnemen meetwaarde als "laag gelezen". Ga terug naar de luchttoevoer (dwz met ambient zuurstofconcentratie), wacht minstens een extra uur en opnemen meting als "hoge lees".
  7. Initiëren gegevensregistratie met behulp van Iris software.

4. Enting

  1. Gebruik 70% ethanol tot de bovenkant van het kweekvat steriliseren.
  2. Verwijder de schroef op de bovenzijde van het vat en pipet 1 ml van een overnachting cultuur in de chemostaat vat. Draai de schroef weer.
  3. Geven het moment van inenting in Iris.
  4. Wacht ongeveer 24 uur voor culturen om vroeg stationaire fase te bereiken. Als de kweek groeit, zal opgeloste zuurstof en pH te verlagen. In het geval van glucose beperkend media, zal opgeloste zuurstof weer ~ 100% stationaire phase. Voor andere beperkingen voedingsstoffen zal opgeloste zuurstof in de stationaire fase blijven <100%.

5. Initiëren Pompen en bereiken van Steady State

  1. De verdunning wordt berekend door de stroomsnelheid te delen (hoeveelheid medium stroomt in het vat per uur) door het volume kweek. Bijvoorbeeld, met een volume van 300 ml een verdunning van 0,1 betekent dat 30 ml medium wordt toegevoegd aan de kweek per uur. Omdat het systeem onder positieve druk hetzelfde volume wordt verwijderd uit het vat zodat de cultuur voortdurend verdund. Een reeks verdunning (D) kan worden gebruikt die niet de maximale groeisnelheid (μ max) van de cellen, waarboven cellen uit de chemostaat wordt gewassen.
  2. Kies pompinstellingen, waarbij het aantal seconden dat de pomp aan en uit te geven, om de gewenste stroomsnelheid te stellen. De pomp levert media met een snelheid van ~ 0,11 ml / sec.
  3. Definieer een programma met de Sixfors interface dat de pomp timing, temperatuur en impellor snelheid aangeeft. Start het programma.
  4. Leeg het verzamelen van houders van vloeibare en noteer de tijd.
  5. Na ten minste twee uur, gebruik dan een cilinder te meten hoeveel media is verwijderd uit het schip. Hierdoor wordt het volume dat is toegevoegd aan de chemostaat vat gelijk. Bereken de verdunning (D = V effluent / V cultuur / tijd). Pas pomp instellingen indien berekend verdunning niet overeenkomt met de gewenste verdunning.
  6. Bij steady-state, heeft celdichtheid in de chemostaat niet veranderen in de tijd. Dit kan worden gemeten zonder verstoren de cultuur door bemonstering van de uitstroom. We operationeel bereiken van een steady state te definiëren als gelijke maten celdichtheid die worden gescheiden door ten minste een bevolking verdubbeling. Het bereiken van steady-state wordt ongeveer acht cultuur generaties na aanvang van de cultuur verdunning. Bij steady-state, cellen groeien exponentieel (i.e. constante groei in de tijd) in-nutriënten beperkte voorwaarden. De verdubbelingstijd van de bevolking (generatie tijd) is ln (2) / D.
  7. Blijf periodiek effluent volumes gemeten gedurende de duur van het experiment te verzekeren dat een constante verdunning wordt gehandhaafd.

6. Toepassing 1: Studeren groeiende cellen met verschillende snelheden in steady-state condities

  1. Bij steady-state in de chemostaat, de groei van de populatie van cellen is gelijk aan de verdunning. Door systematisch veranderen van de verdunning is het mogelijk om cellen groeien met verschillende snelheden. Dit maakt de systematische studie van fysiologische parameters die variëren met de groei inclusief celvolume, celcyclus podium en stressbestendigheid. Bovendien kan steady-state profielen globale mRNA, eiwit en metabolietniveaus worden getest in cellen die groeien met verschillende snelheden. Er zijn twee manieren om monsters te verwerven:
  2. Kleine monsters kunnen passief ob zijngehandhaafd door het plaatsen van het uiteinde van het effluent buis in een 1,5 ml of 15 ml buisje. Een monster van 1-5 ml kan worden verkregen in een paar minuten (afhankelijk van de stroomsnelheid). Vele fysiologische parameters worden gemeten uit deze monsters.
  3. Genexpressie of metaboliet analyses vereisen grotere monsters die zo snel mogelijk moet worden verkregen. Het uiteinde van het effluent buis in een 15 ml conische buis. Maak de schroef van het metalen uiteinde van het effluent buis en duw naar beneden. A ~ 10 ml monster zal snel vul je tube. Houd in gedachten dat het volume in de chemostaat schip is veranderd. Als er veel opeenvolgende monsters genomen kan het nodig zijn om stroming tot een constante verdunning te handhaven.

7. Toepassing 2: Nauwkeurige meting van groeiverschillen tussen genotypen in Controlled Environments Met behulp van flowcytometrie-gebaseerde competitietesten

  1. Chemostaten kan worden gebruikt om het effect van nutriëntenconcentratie kwantificerenover de verschillen in groei (dwz fitness) tussen verschillende genetische achtergronden. Door co-kweken van stammen gelabeld met verschillende fluorescente proteïnen de mate van verandering in relatieve abundantie in exponentiële groei wordt bepaald. Het uitvoeren van deze test met verschillende verdunning (D) kan de studie van effecten van nutriënten concentratie (s) op fitness verschillen.
  2. Vast steady state culturen van de twee stammen in afzonderlijke vaten chemostaat met identieke verdunning en een volume van 300 ml.
  3. Passief proeven 1 ml van elk vaartuig. Spin down cellen, resuspendeer in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bij 4 ° C. Deze monsters bevatten homogene cel monsters, die controles voor de daaropvolgende flowcytometrie-analyse zijn.
  4. Plaats het effluent buis van het ene vat in een autoclaaf maatcilinder. Maak de schroef van het metalen uiteinde van het effluent buis en duw omlaag om cellen te verdrijven uit de chemostaat. Wanneerhet volume op 150 ml, terug het metalen uiteinde van het effluent buis naar zijn oorspronkelijke positie (300 ml). Herhaal dit met de tweede schip, met behulp van een andere maatcilinder.
  5. Gebruik 70% ethanol om de steriliteit te handhaven tijdens het verwijderen schroef bovenop de chemostaat vaartuig. Plaats de trechter in de opening en giet 150 ml van de andere cultuur in de chemostaat vat. Draai de schroef weer. Herhaal dit met de tweede schip, met behulp van de tweede trechter. Elke chemostaat vat bevat nu een mengsel van de twee stammen.
  6. Het verkrijgen van een 1 ml monster uit elk vat met passieve bemonstering elke 2-6 uur. Spin down cellen, resuspendeer in PBS en bewaar bij 4 ° C. Doorgaan met het nemen van monsters voor 2-3 dagen zorgvuldig opnemen van de tijd elk monster werd genomen.
  7. Na afloop van het experiment, ultrasone trillingen en verdun monsters ~ 2 x 10 6 cellen / ml. Met flowcytometrie, meet het percentage van de twee stammen in elk monster. Aangezien beide stammen exponentieel groeien, het relatieve groeipercentage verschil isbepaald door lineaire regressie van ln (strain1/strain2) tegen de tijd (gemeten in generaties). De helling van de regressielijn is de proportionele verschil in groeisnelheid (de fitness voordeel) van een stam ten opzichte van de andere.
  8. Zoals de mengcultuur wat tijd om een ​​nieuwe steady-state bereiken kunnen nemen, kunnen vroege tijdstippen slecht passen bij de regressie. Dit kan het best worden opgelost doordat de 2-3 generaties te verstrijken alvorens met de monsterneming of het verwijderen van vroege punten die duidelijke uitschieters zijn. Omgekeerd, wanneer een stam de andere heeft weggeconcurreerd de gegevens niet langer bruikbaar zijn en deze punten moeten worden uitgesloten.

8. Toepassing 3: Experimentele Evolution

  1. Experimentele evolutie uitgevoerd in chemostaten selecteert voor mutanten die zijn toegenomen in fitness in de nutriënt beperkte omgeving. Selectie gebeurt meestal over honderden generaties.
  2. Opzetten van een steady-state chemostaat cultuur met behulp van een stamvan bekende genotype (en bij voorkeur bekend genoomsequentie) en een bepaald nutriënt-beperking.
  3. Om een ​​"fossiele vondsten" van de aanpassing bevolking behouden passief bemonsteren chemostaat om de 2-3 dagen en bewaar het monster in 15% glycerol bij -80 ° C.
  4. Controleer de media reservoir en vullen met vers medium nodig.
  5. Handhaving van de exponentieel groeiende cultuur voor een paar honderd generaties.
  6. Na voltooiing van de selectieplaat een monster van cellen op vaste agarplaten. Nadat de cellen zijn gegroeid tot kolonies, kies een zuivere monster van kolonies met tandenstokers en beënt klonen in afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat met 100 ul medium. Laat klonale monsters 's nachts groeien, voeg 100 ul van 30% glycerol en bewaar op -80 ° C.
  7. Karakteriseren klonen van whole genome sequencing en het uitvoeren van fenotypische tests waaronder de beoordeling van geschiktheid, met behulp van een gemeenschappelijke fluorescent gelabelde referentie-stam, zoals beschreven in Application 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een groot voordeel van chemostaten is het vermogen om de groei van cellen experimenteel regelen door het variëren van de verdunning. In de gist Saccharomyces cerevisiae, de morfologie van de cel is informatief van de fase in de celdelingscyclus. Populaties met hogere groei bevatten een hoger percentage actief delende cellen zoals bepaald door de fractie unbudded cellen (figuur 5A). Analyses van globale mRNA expressie in chemostaat culturen is gebleken dat de expressie van vele genen differentieel tot ex...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Chemostaten staat de teelt van microben in-groei gecontroleerde steady-state condities. De cellen groeien continu met een constante snelheid waardoor een invariant externe omgeving. Dit in tegenstelling tot batch cultuur werkwijzen waarbij de externe omgeving verandert voortdurend en de groei wordt bepaald door een complexe interactie tussen omgeving en genotype. Aldus is een groot voordeel van het kweken van microben in chemostaten via batch cultuur is de mogelijkheid om experimenteel controle van de groei van cellen. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het opstarten van fondsen van de New York University. Wij danken Maitreya Dunham en Matt Brauer, die het gebruik van Sixfors bioreactoren als chemostaten eerste instantie ontwikkeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Infors-HT Sixfors ChemostatAppropriate Technical Resources, Inc. 
Glass Bottle 9.5 LFisher Scientific02-887-1Voor mediavat en beslag
PinchcockFisher Scientific05-867Voor mediavat en beslag
Stopper, Size 12, Green NeopreneCole-PalmerEW-62991-42Voor mediavat en beslag
Straight ConnectorCole-PalmerEW-30703-02Voor mediavat en beslag
General purpose ties 4 inFisher ScientificNC9557052Voor mediavat en beslag
Tubing, Silicone RubberSmall PartsB000FMWTDEVoor mediavat en beslag
Tubing, Silicone, 3/8 in ODFisher Scientific02-587-1QVoor mediavat en beslag
Tubing, Silicone, 7/32 in ODFisher Scientific02-587-1EVoor mediavat en beslag
Tubing, Stainless Steel, 3/16 in ODMcMaster-Carr6100K164Voor mediavat en beslag
Tubing, Stainless Steel, 3/8 in ODMcMaster-Carr6100K161Voor mediavat en beslag
Hook ConnectorsFisher Scientific14-66-18QVoor mediavat en beslag
Ratchet ClampCole-PalmerEW-06403-11Voor mediavat en beslag
Luer, FemaleCole-PalmerEW-45512-34Voor mediavat en beslag
Luer, MaleCole-PalmerEW-45513-04Voor mediavat en beslag
Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μmFisher ScientificMTGR05010Voor mediavat en beslag
PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μmFisher ScientificNC9131037Voor mediavat en beslag
Direct-Reading Flowtube for AirCole-PalmerEW-32047-77Voor stikstofgas setup
Direct-Reading Flowtube for NitrogenCole-PalmerEW-32048-63Voor stikstofgas setup
Gas Proportioner Multitube FramesCole-PalmerEW-03218-50Voor stikstofgas setup
Regulator, Two-Stage AnalyticalAirgasY12-N145D580Voor stikstofgas setup
Hose Adaptor, Stainless SteelAirgasY99-26450Voor stikstofgas setup
Hose Male AdaptorAirgasWES544Voor stikstofgas setup
Norprene TubingUS Plastics57280Voor stikstofgas setup
Tripod BaseCole-PalmerEW-03218-58Voor stikstofgas setup
Valve CartridgesCole-PalmerEW-03217-92Voor stikstofgas setup
Carboy 10 LFisher Scientific02-963-2AVoor media bereiding
Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; voor 45 mm halsmaatFisher ScientificSCGP-T10-REVoor media bereiding
Media Bottle 100 ml, 45 mm halsmaatFisher ScientificFB-800-100Voor media bereiding
calcium chloride·2H2OFisher ScientificC79-500Media Reagents
sodium chlorideFisher ScientificBP358-1Media Reagents
magnesium sulfate·7H2OSigma Aldrich230391Media Reagents
potassium phosphate monobasicFisher ScientificAC424205000Media Reagents
ammonium sulfateFisher ScientificAC423400010Media Reagents
potassium chlorideSigma AldrichP9541Media Reagents
boric acidSigma AldrichB6768Media Reagents
copper sulfate·5H2OSigma Aldrich209198Media Reagents
potassium iodideSigma Aldrich60400Media Reagents
ferric chloride·6H2OFisher ScientificI88-100Media Reagents
manganese sulfate·H2OSigma Aldrich230391Media Reagents
sodium molybdate·2H2OSigma AldrichM7634Media Reagents
zinc sulfate·7H2OFisher ScientificZ68-500Media Reagents
biotinFisher ScientificBP232-1Media Reagents
calcium pantothenateFisher ScientificAC24330-1000Media Reagents
folic acidSigma AldrichF7876Media Reagents
inositol (aka myo-inositol)Fisher ScientificAC12226-1000Media Reagents
niacin (aka nicotinic acid)Sigma AldrichN4126Media Reagents
p-aminobenzoic acidFisher ScientificAC14621-2500Media Reagents
pyridoxine HClSigma AldrichP9755Media Reagents
riboflavinSigma AldrichR4500-25GMedia Reagents
thiamine HClFisher ScientificBP892-100Media Reagents
LeucineSigma AldrichL8000-100GMedia Reagents
UracilSigma AldrichU0750Media Reagents
DextroseFisher ScientificDF0155-08-5Media Reagents

Referenties

  1. Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
  2. Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
  3. Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
  4. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112, 715-716 (1950).
  5. Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
  6. Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).
  7. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  8. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
  9. Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
  10. Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
  11. Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
  12. Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107(2006).
  13. Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4(2007).
  14. Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
  15. Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 187, 299-317 (2011).
  16. Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325(2012).
  17. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
  18. Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303(2008).
  19. Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202(2011).
  20. Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
  21. Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
  22. Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49(2006).
  23. Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
  24. Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
  25. Conlon, I., Raff, M. Size control in animal development. Cell. 96, 235-244 (1999).
  26. Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. Extracellular control of cell size. Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).
  27. Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
  28. Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Chemostaatcultuurgroeisnelheidscontrolegenexpressieanalyseadaptieve evolutieflowcytometrienutriëntenbeperkingsteady-statecultuurverdunningssnelheidsberekeningcompetitieve fitnessassay
Het gebruik van chemostaten in Microbiële Systems Biology
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.