Een snelle en eenvoudige manier om humane cellijnen met induceerbare en omkeerbare cDNA overexpressie of shRNA-gemedieerde knock-down van het gen van belang genereren. Deze methode kunnen onderzoekers betrouwbaar en zeer reproduceerbaar manipuleren cellijnen die moeilijk te veranderen door transiënte transfectie methoden of conventionele knockdown / knockout strategieën.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Genereren van stabiele humane cellijnen met tetracycline induceerbare (Tet-on) shRNA of cDNA Expression
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een belangrijke benadering op het gebied van zoogdiercel biologie is de manipulatie van de expressie van genen van belang in geselecteerde cellijnen, teneinde te onthullen een of meer van de functie van het gen (s) met behulp van transiënte / stabiele overexpressie of knockdown van het gen van belang. Helaas, voor diverse celbiologische onderzoeken deze aanpak is niet geschikt wanneer manipulaties van genexpressie resultaat in cel groei / proliferatie gebreken of ongewenste celdifferentiatie. Daarom hebben onderzoekers aangepast de tetracycline repressor eiwit (TetR), uit de E. coli tetracycline resistentie operon 1, om zeer efficiënte en strakke regelgeving genereren cDNA expressie in zoogdiercellen 2,3. Kortom, TetR aangepast om ofwel (1) blok initiatie van transcriptie door binding aan het Tet-operator (TO) in de promoter regio na toevoeging van tetracycline (Tet-off genoemd systeem) of (2) binden aan de TO thij afwezigheid van tetracycline (Tet-on genoemd systeem) (figuur 1). Aangezien het ongemak dat het Tet-off systeem de continue aanwezigheid van tetracycline (met een halfwaardetijd van ongeveer 24 uur in weefselkweek celkweekmedium) moeten Tet-on systeem is uitgebreider geoptimaliseerd, zodat de ontwikkeling van zeer strakke en efficiënte vectorsystemen voor cDNA expressie zoals hier gebruikt.
Kort na de instelling van RNA interferentie (RNAi) voor gen knockdown in zoogdiercellen 4, vectoren die korte haarspeld RNA (shRNAs) beschreven die functie, vergelijkbaar met siRNA 5-11. Echter, deze shRNA gemedieerde knockdown benaderingen hebben dezelfde beperking als conventionele knockout strategieën, aangezien stabiel uitputting niet uitvoerbaar is targets gen zijn essentieel voor cellulaire overleving. Om deze beperking te overwinnen, van de Wetering et al. 12. Wijzigde de shRNA expressievector pSUPER 5 Hier beschrijven we een methode om efficiënt genereren stabiele humaan Tet-on cellijnen die betrouwbaar rijden of induceerbare overexpressie of uitputting van het gen van belang. Met deze methode, hebben we met succes gegenereerd Tet-on cellijnen die significant de analyse van de MST / hMOB / NDR cascade vergemakkelijkt centrosoom 13,14 en 15,16 signalering van apoptose. In dit rapport beschrijven we onze vectoren van keuze naast beschrijven twee opeenvolgende stappen van manipulatie die noodzakelijk zijn om efficiënt genereren menselijke Tet-on cellijnen (figuur 2). Bovendien naast waarin een protocol voor het genereren van menselijke Tet-on cellijnen bespreken we kritische aspecten van de technische procedures en karakterisering van Tet-on cellen.
Protocol
1. Klonering van pcDNA6_TetR_IRES_blast
- Zoals geïllustreerd in figuur 3, voert een gedeeltelijk digest van pcDNA6/TR plasmide (V1025-20, Invitrogen) met de restrictie-enzymen Xba I en Nco I bij de TetR gen en de promoter van de blasticidine resistentie (BlastR) gen te verwijderen. Isoleer de 4,6 kb vectorfragment.
- De polyadenyleringssequentie uit het TetR gen te introduceren door PCR een Xhol plaats onmiddellijk na het stopcodon van het cDNA met behoud TetR de Xba I plaats bij het 5'-uiteinde van het cDNA. Subkloon het resulterende fragment in pMigR1 17 met restrictie-enzymen XbaI en XhoI het genereren van de pMigR1_TetR plasmide.
- Digereren van het pMigR1_TetR vector met de restrictie-enzymen Xba I en Nco I bij de TetR_IRES fragment vrij. Isoleer de 1,25 kb insert fragment.
- Ligeren van het 4,6 kb pcDNA6/TR en de 1,25 kb TetR_IRES fragmenten. Transform het ligatieproduct in competente E.coli en identificeert de gewenste pcDNA6_TetR_IRES_blast construct gebruikmaking van standaard moleculaire biologische technieken.
2. Generatie van cellijnen stabiel tot expressie TetR
- Op dag 1, Seed 1x10 6 cellen per 10 cm weefselkweekplaat met een standaard groeimedium (bijvoorbeeld DMEM aangevuld met 10% FCS). Seed twee platen, een voor transfectie met pcDNA6_TetR_IRES_blast en de andere als een negatieve controle voor selectie blasticidine. Zorg ervoor dat u de laagst mogelijke doorgang en de aanbevolen groei medium te gebruiken.
- Op dag 2 transfecteren een plaat met 2 pg pcDNA6_TetR_IRES_blast met Fugene 6 (E2691, Promega) volgens de instructies van de fabrikant. Niet transfecteren de tweede plaat.
- Op dag 3, worden standaard groeimedium bevattende 5 ug / ml blasticidine aan beide platen. Houd er rekening mee dat de optimale selectie concentratie kan variëren voor een bepaalde cellijn en macht need van te voren worden bepaald.
- Op dag 4 worden de cellen gesplitst op 1/5, 1/25, 1/50 en 1/100 met 10-cm platen en standaard groeimedium bevattende 5 mg / ml blasticidine. Zorg ervoor dat u een behoorlijk label platen die getransfecteerde of getransfecteerde cellen. Bereid twee platen per verdunning stap.
- Dagelijkse controle cellen, zodat alle cellen op het getransfecteerde platen stierven binnen de eerste week. Verander selectie media om de 2-3 dagen.
- Na 1-2 weken moet blasticidine-resistente kolonies beginnen te verschijnen. Selecteer platen die 5 tot 50 kolonies opdat enkele kolonies kunnen worden opgehaald.
- Wanneer de kolonies hebben een diameter van ongeveer 5 mm (of groter) bereikt, isoleren ten minste 12 onafhankelijke klonen met klonen cilinders enkele kolonies halen. Breng elke kloon in een aparte putje van een 24-well weefselkweekplaat. Wanneer confluent, splitsen cellen uit elk putje in een enkel putje van een 6-well weefselkweekplaat.
- Doorgaan naar cultuur cldie in de selectie media. Wanneer confluent, split cellen uit elk putje in twee afzonderlijke putjes van een 6-well weefselkweekplaat.
- Voor elke kloon te testen, bevriezen een putje van confluente cellen en oogsten cellen in het andere goed voor het testen door immunoblotting.
- Detecteren TetR door Western blotting met de muis monoklonaal anti-TET02 antilichaam (Mobitec GmbH). Herinneren aan een lysaat van de ouderlijke cellijn als een negatieve controle omvat.
- Selecteer 3 klonen met de hoogste TetR expressie en uit te breiden elk klonale cultuur. Freeze voorraden van elke kloon veelbelovend zo spoedig mogelijk. Tenslotte, bekijk de moleculaire en celbiologische parameters van belang door vergelijking van de oudercel lijnen met de TetR-tot expressie brengende klonen. Selecteer de 'beste' kloon met de hoogste TetR uitdrukking die niet wordt weergegeven eventuele wijzigingen in de moleculaire en cel-biologische parameters van belang.
3. Pilot Testen van Pter en pT-Rex DEST30 Vectoren Expressing shRNA of cDNA's, Respectievelijk
- Genereren Pter plasmide met shRNA inserts beschreven 12. Construct pT-Rex DEST30 vector (12,301-016, Invitrogen) met het cDNA van belang met Gateway-technologie (Invitrogen). Bij cDNA expressie zal toevoeging van een label aan het cDNA later vergemakkelijken detectie van exogeen tot expressie gebrachte eiwit.
- Tijdelijk transfecteren de ouderlijke doelcel lijn met Pter of pT-Rex DEST30 plasmiden (die ofwel shRNAs of cDNA's van belang) met behulp van de transfectie reagens van keuze. Voor het testen van shRNA expressieplasmiden zorgen voor hoge transfectie-efficiëntie kan worden bereikt.
- Oogst cellen en proces getransfecteerd voor immunoblotting met de juiste antilichamen, in de verwachting tot een uitputting of overexpressie van uw gen van belang op te sporen.
4. Genereren van stabiele cellijnen met tetracycline induceerbare (Tet-on) Expressie van shRNAs of cDNA gebruiken Pter of Pt-Rex DEST30 Vectors
- Op dag 1, zaad 1x10 6 cellen van de 'beste' TetR-expressie kloon per 10-cm plaat met behulp van uw standaard groeimedium aangevuld met gecertificeerde Tetracycline-vrij serum (bijvoorbeeld FBS van Invitrogen, 16000-014). Zaad een plaat voor transfectie met Pter (of Pt-Rex DEST30), en een plaat als negatieve controle voor dubbele selectie. Zorg ervoor dat u de laagst mogelijke doorgang te gebruiken.
- Op dag 2 transfecteren een plaat met 2 pg Pter (of Pt-Rex DEST30) met Fugene 6. Niet transfecteren de tweede plaat.
- Op dag 3, worden standaard groeimedium bevattende 5 ug / ml blasticidine en 500 ug / ml zeocine (of 1 mg / ml G418).
- Op dag 4 worden de cellen gesplitst op 1/5, 1/25, 1/50 en 1/100 met 10-cm platen en standaard groeimedium bevattende 5 ug / ml blasticidine en 500 ug / ml zeocine (of 1 mg / ml G418). Bereid twee platen per verdunning stap.
- Controleer dagelijks de cellen, en zorg ervoor dat in de eerste week alle cellen op de niet-getransfecteerde platen zijn gestorven.Wijzig de standaard groeimedium dat blasticidine en zeocine (of G418) om de 3-4 dagen.
- Na 2-3 weken, blasticidine / zeocine (of blasticidin/G418) dubbel-resistente kolonies moeten beginnen te verschijnen. Selecteer platen die 5 tot 50 kolonies aan enkele kolonies te plukken.
- Wanneer de kolonies hebben een diameter van ongeveer 5 mm (of groter) bereikt is, kunt klonen cilinders om enkele kolonies te plukken. Isolaat ten minste 24 afzonderlijke klonen. Breng elke kloon in een aparte putje van een 24-well weefselkweekplaat.
- Cultuur klonen in medium dat onderhoud concentraties blasticidine (5 ug / ml) en zeocine (250 ug / ml) [of G418 (0,5 mg / ml)]. Wanneer confluent, splitsen cellen uit elk putje in een enkel putje van een 6-well weefselkweekplaat.
- Voor elke kloon te testen, een split confluente putje van een 6-well plaat in drie afzonderlijke putjes van een 6-well plaat. Wanneer confluent, bevriezen cellen van het ene goed. Gebruik de resterende twee putten voor het testen van de tetracyclinee-induceerbare expressie. Voeg tetracycline bij een concentratie van 1 ug / ml aan een putje, terwijl de tweede put tetracycline vrij.
- Na 24 tot 96 uur incubatie met Tetracycline, oogst cellen en werkwijze voor immunoblotting met geschikte antilichamen. Kortere incubatietijden tetracycline aanbevolen bij screening voor de inductie van cDNA expressie terwijl meer tetracycline behandelingen nodig om shRNA-gemedieerde afbraak van endogene eiwitten te bepalen.
- Selecteer ten minste twee klonen met de gewenste depletie / overexpressie en vergroten elke cultuur. Freeze voorraden van elke kloon veelbelovend zo spoedig mogelijk. Bij de teelt van Tet-on-klonen voor experimenten altijd voor zorgen dat de media aangevuld met tetracycline-vrij serum en de respectieve selectie antibiotica bij onderhoud concentraties te gebruiken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een voorbeeld voor de initiële karakterisering van RPE-1 cellijnen die stabiel TetR is weergegeven in figuur 4. Merk op dat alle klonen RPE-1 expressie verschillende niveaus van TetR (vergelijk lanen 2 en 5), terwijl de ouderlijke cellijn (dat als negatieve controle) drukt niet de exogene TetR eiwit (Figuur 4, baan 1). Deze variatie in TetR uitdrukking onder RPE-1 Tet-on celklonen verwacht, omdat de expressie van de TetR expressie plasmiden is sterk afhankelijk van het plasmide integrat...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wij geloven dat Tet-on systemen sterk de analyse van genfunctie maken, met name in celsystemen die moeilijk te manipuleren en / of wanneer de gemanipuleerde gen essentieel voor celoverleving. Bovendien de mogelijkheid om genexpressie te controleren door zeer specifieke Tet-on systemen biedt de mogelijkheid om genfuncties studeren verschillende fasen (bijvoorbeeld tijdens de celcyclus of goed gedefinieerde differentiatie). Werkwijze hier gepresenteerde onderzoekers in staat om de gewenste stabiele genereren Tet-on cellij...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken alle leden van ons laboratorium voor nuttige discussies. Wij danken Joanna Lisztwan en Christina Gewinner voor kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de BBSRC subsidie BB/I021248/1 en de Wellcome Trust subsidie 090090/Z/09/ZAH is een Wellcome Trust Research Career Development fellow aan de UCL Kanker Instituut.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Opmerkingen (optioneel) |
| Foetaal runderserum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Getest Tet-vrij |
| Blasticidine | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocine | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratoria | P31-011 | 100 mg / ml in media |
| anti-TET02 | Mobitec GmbH | TET02 | Gebruik van 1/1000 tot 1/2000 voor WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg / ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg / ml in water |
| Klonen cilinders | Bellco Glass Inc | 2090 tot 00.808 | herbruikbare |
Referenties
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
