Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Extracellulair Het identificeren van Motor Neuronen voor een Muscle Motor Pool in

11.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50189

⸱

25 maart 2013

 ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University , 2Department of Neurosciences, Case Western Reserve University , 3Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

In dit artikel

Samenvatting

In dieren met grote geïdentificeerde neuronen ( Bv Weekdieren), wordt de analyse van de motorische zwembaden gedaan met behulp van intracellulaire technieken 1,2,3,4. Onlangs hebben we een techniek ontwikkeld om extracellulair stimuleren en individuele neuronen opnemen in Aplysia californica 5. We hebben nu beschrijven een-protocol voor het gebruik van deze techniek om eenduidig ​​te identificeren en motorische neuronen karakteriseren binnen een motor zwembad.

Samenvatting

Bij dieren met grote geïdentificeerde neuronen (bijv. weekdieren), analyse van de motor pools wordt gedaan met behulp van intracellulaire technieken 1,2,3,4. Onlangs, ontwikkelden we een techniek om extracellulair te stimuleren en op te nemen individuele neuronen in Aplysia californica 5. We hebben nu beschrijven een-protocol voor het gebruik van deze techniek om eenduidig ​​te identificeren en motorische neuronen karakteriseren binnen een motor zwembad.

Deze extracellulaire techniek heeft voordelen. Elke optie, extracellulaire elektroden kan stimuleren en neuronen opnemen door de schede 5, zodat het hoeft niet worden verwijderd. Aldus zullen neuronen gezonder zijn in extracellulaire experimenten dan in intracellulaire degenen. Ten tweede, als ganglia zijn geroteerd door passende pinning van de mantel, kan extracellulaire elektroden toegang neuronen aan beide zijden van de ganglion, waardoor het eenvoudiger en efficiënter te identificeren meerdere neuronen in hetzelfde preparaat. Third, extracellular elektroden hoeven niet te cellen te penetreren, en dus gemakkelijk kunnen worden heen en weer liep tussen neuronen, waardoor minder schade berokkenen. Dit is vooral handig wanneer men probeert om meerdere neuronen op te nemen in de loop van te herhalen motor patronen dat alleen kan aanhouden voor minuten. Vierde, extracellulaire elektroden soepeler zijn dan intracellular Wat is tijdens spierbewegingen. Intracellulaire elektroden kunnen eruit trekken en deze beschadigen neuronen tijdens spiercontracties. In contrast, aangezien extracellulaire elektroden worden voorzichtig geperst op de schede bovenstaande neuronen, ze verblijven meestal boven hetzelfde neuron tijdens spiercontracties, en kan dus worden gebruikt in more intact preparaten.

Als unieke motor neuronen identificeren voor een motor pool (in name, de I1/I3 spier in Aplysia) met behulp extracellulaire elektroden, kan men gebruik features die niet vereisen intracellulaire metingen als criteria: soma size and location, axonale projectie, en spier innervatie 4, 6,7. Voor de specifieke motor pool gebruikt om de techniek illustreren, we opgenomen vanuit buccale zenuwen 2 en 3 om axonale projecties meten, en gemeten de samentrekking krachten van de I1/I3 spier om het patroon van spier innervatie voor de afzonderlijke motor neuronen bepalen.

We aan te tonen het complete proces van de eerste het identificeren van motorische neuronen met behulp van spier innervatie, dan is het karakteriseren van hun timing tijdens de motorische patronen, het creëren van van een vereenvoudigde diagnostische methode voor de snelle identificatie. De vereenvoudigde en nog veel meer snelle diagnostische methode is superieur voor meer intacte de voorbereidingen, bijv. in de geschorste buccale massa-het preparaat 8 of in vivo 9. Deze taak kan ook worden toegepast in andere motor pools 10,11,12 in Aplysia of in andere dierlijke systemen 2,3,13,14.

Protocol

1. Voorbereiding van opname Dish

  1. Tijdens de force transducer experimenten worden de buccale ganglia, cerebrale ganglion, en buccale massa geplaatst in een ronde Pyrex gerecht dat is gespecialiseerd voor force studies.
  2. Om ingestive-achtige patronen in de experimenten induceren, moeten we de non-hydrolyseerbare cholinerge agonist carbachol toepassing op de cerebrale ganglion 15. Om direct contact uit carbachol op de buccale ganglia en buccale massa moet worden vermeden, zijn afzonderlijke kamers nodig om de cerebrale ganglion vanaf dit buccale ganglia en de buccale massa (figuur 1) isoleren.
  3. Aangezien de buccale massa is veel dikker dan de buccale ganglia, worden ze niet geplaatst op hetzelfde niveau. Daarom moet dit gerecht beschikken over een reservecomputer kamer voor de cerebrale ganglion (area A in Figuur 1), een middelste platform voor de buccale ganglia (area C in figuur 1), en een veel diepere voorkamer voor de buccale massa (area D in Figuur 1).
  4. Om dit gerecht te creëren, beginnen met een ronde 100x15 Pyrex dish (15 mm hoog, 100 mm in diameter). De bouw van de schotel zal vereisen een aantal giet van Sylgard. Volg de instructies die bij het Sylgard product. Sylgard moet worden toegestaan ​​om ingesteld worden tussen de verschillende giet.
  5. De eerste pour is het creëren het hoogste niveau van Sylgard in de schotel (area B in Figuur 1), die de wand tussen de middle platform en achterkamer.
  6. Gebruik twee boetseerklei backings om het gebied isoleren voor Sylgard wall (area B in Figuur 1). Coat de boetseerklei backings met plastic omslag waar ze zullen de Sylgard voor gemakkelijkere het verwijderen contact op te nemen. Waarborgen tight afdichtingen aan de randen, waar boetseerklei zal de schotel contact, om lekkage minimaliseren.
  7. Giet Sylgard in de gedeelte tussen de twee boetseerklei backings bijna up naar de top van de schotel. Laat de Sylgard volledig 's nachts in te stellen. Het houden van de schotel op een warme plaats zal te inducerensneller setting. Verwijder de boetseerklei backings en schoon te-up van alle klei residu op de Sylgard.
  8. Vervolgens moet de achterkamer (area A in Figuur 1) en de middelste platform (area C in Figuur 1) worden uitgegoten.
  9. Plaats een boetseerklei backing ongeveer 5 mm weg van het vooroppervlak van de Sylgard voor de sectie van de middelste platform (gebied C).
  10. Giet Sylgard in in de afdelingen voor de rug kamer (gebied A) en middelste platform (gebied C) tot een hoogte van ongeveer 3-5 mm onder de bovenkant niveau van de eerste Sylgard wand (gebied B). Het Sylgard oppervlak van de back kamer moet iets lager zijn dan die van het middelste platform om lekkage te voorkomen vanaf dit back kamer die carbachol naar het midden platform. Laten we er opnieuw de Sylgard volledig 's nachts in te stellen en verwijder vervolgens de boetseerklei backing.
  11. De laatste stap is om te een inkeping snijden in het midden van de Sylgard muur om een ​​kanaal voor de cerebrale-buccale connectieven (CBC's) om te gaan te biedendoor middel van tussen de middelste platform en weer terug kamer. De breedte van deze notch moet ongeveer 3-4 mm, die breed genoeg voor de CBCS zijn. De onderkant van de notch mag niet lager zijn dan de Sylgard oppervlak van de middelste platform om lekkage te voorkomen. A scalpel blade kan worden gebruikt om de inkeping snijden.

2. Electrode Voorbereiding

  1. Trek aan extracellulaire glas elektrodes van single-barrelled capillair glas met behulp van van een Flaming-Brown micropipet puller zoals beschreven door McManus et al.. 8 in paragraaf 3.1. Met de FT345B filament in de puller, onze typische programma-instellingen zijn Hitte 480, Pull 50, Velocity 13, en Time 20, maar er rekening mee dat instellingen zullen verschillend zijn voor verschillende filamenten. Dit programma creëert de elektroden in een enkele pull met geen vuur-polijsten stadium. De grootte van de elektrode tip moet kleiner dan de grootte van de cellichamen. Voor de motor neuronen variërend van 50 urn tot 400 urn in soma diameter, de binnenste diameters van de extracellulaire glas elektroden zou moeten gaan over 40 um en hun weerstanden zou moeten zijn ongeveer 0,1 MQ wanneer ze zijn gevuld met Aplysia zoutoplossing.
  2. Trek aan zuig-elektroden van polyethyleen buis het gebruik van een Bunsen brander. Knip een stuk polyethyleen buis ongeveer 10 cm lang. Houd de tubing aan beide uiteinden en plaats deze zeer dicht bij de vlam gegenereerd door de Bunsen brander terwijl draaiing van de buis totdat het soft van de hitte. Zorgvuldig door Strek de buizen langs zijn lengte wanneer u het verplaatst uit de buurt van de vlam. Het middelste deel van het slangetje zal langwerpige en smal als de slang wordt getrokken.
  3. Snijd de leidingen aan in half tot twee zuig-elektroden te vormen. Zuig-elektroden zijn over het algemeen toegepast op de cut uiteinden van zenuwen of spieren, hoewel ze kan soms worden toegepast en passant.
  4. Creëren hook elektroden voor nerve opnamen na de protocol beschreven door McManus et al 8 in secties 3.2-3.13. Deze elektroden zijn especibondgenoot handig wanneer een zenuw of spier wordt niet gesneden.

3. Hook Electrode Attachment

  1. Ontleden de dier en verwijder de buccale massa naar aanleiding van de protocol beschreven in McManus et al.. 8 sectie 4.
  2. Voor opname en stimulatie, kan hook elektroden worden bevestigd aan een aantal verschillende zenuwen.
  3. Om patronen zoals werd gedaan in vivo door Cullins en Chiel 9 karakteriseren, moet opnames worden verkregen van de I2 zenuw en spier die de protractie fase van voeden 16, de radular zenuw (RN) dat de sluiting van het eten grijper 17, buccale geeft geeft zenuw 2 (BN2) en buccale zenuw 3 (BN3) dat de retractiefase 17,18 aan te geven. Attachment van de haak elektroden volgt een procedure gelijk aan die beschreven by McManus et al 8 § 5.
  4. De locaties van deze zenuwen verwijzen naar de schema van de Aplysia voerinrichting vertegenwoordigd inFiguur 2 van McManus et al 8. Merk op dat de BN2 trifurcates in takken a, b, en c voordat sluipende I1 spier op het laterale groove. Vertakken a is de eerste tak af te scheiden van de belangrijkste stam, en is grenzend aan de BN3.
  5. De nomenclatuur van branches a, b, en c werd gebruikt door Warman en Chiel 18. Branches a, b, en c behoren op bijkantoren 3, 2, en 1, respectievelijk, in de nomenclatuur gebruikt door Nargeot et al.. 19. Bovendien is de RN, de BN1 de BN2 en BN3 overeen met zenuwen 1, 6, 5 en 4, respectievelijk in de nomenclatuur die door Kandel 20 en Scott et al. 21.
  6. Om de spier innervatie van de I1/I3 spier-te bestuderen, alle de zenuwen met uitzondering van buccale zenuwen 2 zal worden gescheiden van de buccale massa-tijdens de experimenten. Zo, hebben we gebruik gemaakt van een haak elektrode om op te nemen uit de BN2.
  7. Aangezien I2 zenuw en de RN wordt niet aan de buccale massa, en ze zijn zeer moeilijk te bereiken met haak elektroden verdient het de voorkeur om zuiging elektrodes nemen in plaats van hen. We zullen beschrijven de toepassing van de zuig-elektroden in sectie 7.
  8. Gebruik een van beide een haak elektrode of een zuig-elektrode om op te nemen uit de BN3, omdat het gemakkelijk is om toegang te krijgen met behulp van een van beide soort van elektrode. We kozen voor een haak electrode gebruiken voor de BN3 Opnamen naar de aantal manipulators minimaliseren voor het vasthouden de zuig elektroden, en om ruimte te besparen voor andere manipulators of apparatuur.
  9. Bevestig een haak elektrode te vertakken een van de BN2 (BN2-a) om te afwijzing-achtige patronen te starten tijdens experimenten. Het is nuttig een extra haak elektrode hechten aan de BN2-a aan de andere kant, omdat sommige neuronen verschillend reageren op ipsilaterale vs contralaterale BN2-a stimulatie.
  10. Om u te helpen onderscheid te maken neuronen met unilaterale versus bilaterale projecties, hetis ook nuttig om haak elektroden hechten aan BN2 en BN3 aan de andere kant van de buccale ganglia.

4. Ganglia en Muscle Voorbereiding

  1. De buccale ganglia, cerebrale ganglion en buccale mis wordt voorbereid voor de force transducer experimenten, in die de cerebrale ganglion is bevestigd aan de buccale ganglia via de CBCS en de buccale massa is bevestigd aan de buccale ganglia via de BN2s enige.
  2. Na het bevestigen van de haak elektroden, snijd buccale zenuw 1 (BN1) en de esophageal zenuw (EN) bilateraal, het snijden op de gehechtheid punt om de buccale massa.
  3. Naar voren Trek aan de cerebrale ganglion om het te verplaatsen uit de weg van de I2 spier. Maak een snee in de I2 spier over de hele radular sac, uit te breiden de cut lateraal en anteriorly in beide richtingen, en trek de flap van de I2 spier ernaar uit om de radular zenuw bloot te leggen. Snijd de twee RN takken en zorg ervoor dat de takken zijn lang genoeg voor zuig-elektrode gehechtheid.
  4. Continue de I2 snede in een grote boog om de buccale ganglia, zorg dat u de BN2s of de BN3s snijden, totdat de buccale ganglia en de bijgevoegde deel van de I2 spier kan volledig worden gescheiden van de buccale massa. Snijd de bilaterale BN3s op de gehechtheid punt om de buccale massa, verder dan de haak elektrode gehechtheid.
  5. Breng een dun laagje van vacuüm vet aan op de inkeping in de opname-gerecht hierboven beschreven, dat de rug kamer en middelste platform verbindt, met behulp van een pipet tip om pick-up een glob van vacuüm vet en het verspreid over de inkeping.
  6. Breng een dunne laag Quick-Gel super lijm op de glazen bodem van de voorkamer waar de buccale mis wordt geplaatst, tegenover de Sylgard base van de middelste platform.
  7. Breng zorgvuldig de cerebrale ganglion, buccale ganglia en buccale massa om de opname schotel (Figuur 1) beschreven in hoofdstuk 2, en zorg ervoor dat geen van de haak elektroden strak worden getrokken, waardoor de zenuwen beschadigen.
  8. Zorgvuldig plaats de buccale massa op de lijm in de voorkamer van de opname schaal, tot waarborgen dat haar buikoppervlakte is gelijmd op de bodem van de schaal. Zorg ervoor dat u de ganglia en de elektroden te houden van het het aanraken van de lijm. Voeg Aplysia saline 8 (460 mM NaCl, 10 mM KCl, 22 mM MgCl2, 33 mM MgSO 4, 10 mM CaCl2, 10 mM glucose, 10 mM MOPS, pH 7.4 tot 7,5) aan de schaaltje dat zal de lijm induceren om te in te stellen.
  9. Als de schotel dient te worden overgedragen aan een andere microscoop voor het de voorbereiding van de buccale ganglia voor extracellulaire soma-opnamen, wees heel voorzichtig zijn met de haak elektroden. Group de elektroden aan een kant van de buccale massa samen en ook groepsbegeleider de elektroden aan de andere kant van de buccale massa samen. Voorzichtig houdt u de elektroden door vast te pakken het lab tape die de connector pennen heeft betrekking op, nogmaals het maken van zeker van zijn dat geen van de elektroden strak worden getrokken.
  10. Wanneer de schotel bevindt zich onder de microscoop, de elektrodes moet voorzichtig worden gedrapeerd over de zijkanten van de schotel en rust op het platform naast de schotel.
  11. Tijdens de pauzes en tussen stadia van het experiment, beluchten de zoutoplossing in de buccale massa-kamer met behulp van een aquarium luchtsteen.
  12. Gebruik een tang om de schede van de cerebrale ganglion te grijpen en het te trekken in de rug binnenkomt, wat zorgt dat de CBC's lopen door de inkeping. Speld de cerebrale ganglion behulp zenuwen andere dan de CBCS om schade aan de intact CBC's vermijden.
  13. Breng meer vacuüm vet over de CBC's, en vervolgens meer Aplysia zoutoplossing toe te voegen aan beide kamers van de schotel, zodat de ganglia volledig worden overspoeld. Zorg dat de bovenzijde van het vacuüm vet is iets hoger dan de Sylgard muur zodat geen lekkage zal optreden tussen de kamers.
  14. Om de buccale ganglia stabiliseren, eerste pin de uiteinden van de BN3s, vervolgens de BN1s en de ENS over de Sylgard base van de middelste platform (figuur 2). Omdat de BN3s worden opgenomen met haak elektrodes, dient de pennen meer distaal geplaatst dan de bevestigingspunten van de haak elektroden.
  15. Gebruik twee pins, gebogen 90 graden, als haken te rekken en verankeren de CBCS, zodat de CBCS niet wordt beschadigd (figuur 2).
  16. Speld naar beneden de RN takken tussen de achterkant kamer en de buccale ganglia. Dan is de I2 spier zal zijn op de top van de RNS. Als u de I2 zenuw bloot te leggen, gebruik maken van een tang om van de I2 spier-te grijpen en het te trekken meer dan de buccale ganglia. Speld twee hoeken van de I2 spier om schade aan de I2 zenuw te vermijden.
  17. Sever de I2 zenuw distaal van de punt waarop haar twee takken samen te voegen in de I2 spier. Zorg ervoor de spier nog geïnnerveerd vergelijkbaar te zijn de in vivo opnames. Snijd weg te de rest van de I2 spier-en flip de I2 zenuw rug en speld het naar beneden tussen de twee RN takken (zie figuur 2, inset).
  18. Stel de locaties van de pennen te rekken en voeg spanning als een zenuw te los, of spanning als een vrij nerve is te strak. Om verder te stabiliseren de buccale ganglia, toe te voegen meer pinnen op de schede tussen de zenuwen.
  19. Omdat de buccale ganglia zijn geplaatst caudale kant naar boven, draait u aan de buccale ganglia, indien de neuronen van rente bevinden zich op de rostrale kant. Om een ​​van de twee buccale ganglia te roteren, maken gebruik van fijne tang op enige speling in schede van de CBC te grijpen waar het is in de buurt om te de buccale ganglia en speld het naar beneden tussen de BN2 en de BN3. In sommige ganglia, is het wellicht meer handig om het te pinnen naar beneden tussen CBC en BN3.
  20. Voeg een extra pin op de schede van de buccale ganglion aan de zijkant dicht bij het front kamer om de beweging van de buccale ganglion minimaliseren.
  21. Om de schede met betrekking tot de buccale ganglia trimmen, maken gebruik van fijne een tang om de schede te grijpen aan de zijkant dicht bij de rug kamer, en knip dan weg te de overtollige schede met fijne een schaar zonder dat het blootstellen van de cellichamen. Nodig om volledig te schade te minimaliseren, alleen verwijderen het minimumbedrag van sheath nodig is om de cellichamen geschikte.
  22. Na thij schede van de buccale ganglia is getrimd, trekt u de I2 zenuw en de RNS over de buccale ganglia en speld ze naar beneden tussen de buccale ganglia en de voorste kamer verder te draaien de buccale ganglia. (Zie Figuur 2).
  23. Te wassen out eventuele resterende magnesium chloride 8 dat werd gebruikt om het dier verdoven ervan vóór versnijding, vervangt u de Aplysia saline in de schotel met verse Aplysia zoutoplossing.

5. Elektrisch Aansluiten Hook Electrodes

  1. Na het van de ganglia en de spier worden bereid, zorgvuldig over te dragen de schotel naar de trillingsisolatie tafel voor de experimenten.
  2. Bevestig alle elektrode pinnen om hun-aansluitingen op het BNC-kabels die verbinding maken met de versterkers (AM Systems model 1700 versterker). Nogmaals, zorg ervoor dat de elektroden niet zijn strak getrokken terwijl het doen van dit. Zorg ervoor dat de elektroden de juiste wijze zijn gehecht aan hun juiste kabels en dat de polariteiten correct zijn.

6. Het opzetten van de Extracellulaire Glass Elektroden voor Soma Recordings

  1. Vul de elektrode met Aplysia zoutoplossing volgens een spuit bevestigd aan een stuk van polyethyleen buis van ongeveer 15-20 cm. Bevestig het vrije uiteinde van de polyethyleen slang aan op de uiteinde van de glazen electrode. Trek terug op de zuiger van de spuit te vullen van de elektrode met Aplysia zoutoplossing.
  2. Plaats de gevulde extracellulaire glas elektrode in de inkeping van de houder op de manipulator. Gebruik de manipulator om de elektrode tip te plaatsen in de Aplysia zoutoplossing die de buccale ganglia.
  3. Steek een zilver / zilverchloride draad gesoldeerd aan een mannelijke gouden connector pin in de elektrode om te dienen als de opname te draad. Plaats een ander zilver / zilverchloride draad gesoldeerd aan een mannelijke gouden connector speld direct in de Aplysia zoutoplossing binnen de sectie van de opname schaaltje met de buccale ganglia te treden als de referentie-draad. Sluit beide ee opname en verwijzing draden aan op de BNC-kabel die wordt aangesloten op de versterker.
  4. Als er is genoeg ruimte voor meer manipulators, kunnen extra extracellulaire glas elektroden worden toegevoegd aan tegelijkertijd op te nemen meerdere neuronen.

7. Het instellen van de Suction Elektroden voor de Nerve Recordings

  1. Trim de smalle uiteinde van de aanzuigslang electrode tip om de diameter van de zenuw overeenkomen. De binnendiameter van de elektrode tip moeten vergelijkbaar of enigszins kleiner dan diameter de zenuw om tight zuigkracht waarborgen.
  2. Sinds de I2 zenuw en de RN zijn zeer dicht bij elkaar, kunnen hun elektrodes worden gehouden door de dezelfde manipulator om ruimte te besparen. Plaats twee elektroden in twee inkepingen van dezelfde vergunninghouder. Draai de twee elektroden en de ervoor zorgen dat hun tips zijn dicht bij een andere. Kies een van hen voor de I2 zenuw opname, de andere voor de RN opname.
  3. Plaats de punt van de elektrode in de Aplysia zoutoplossing in het recording schotel met de buccale ganglia. Bevestig het vrije uiteinde van de polyethyleen slang op het spuit de zuig electrode. Gebruik de spuit te vullen van de elektrode met Aplysia zoutoplossing. Verplaats de elektrode tip dicht bij het ​​einde van het doel zenuw, dwz de I2 zenuw, en gebruik de spuit om de zenuw zuigen in de elektrodebundel. De lengte van de zenuw binnen de elektrode moet ongeveer 0,5-1,0 mm om een ​​goede afdichting waarborgen.
  4. Herhaal de aanzuiging voor de elektrode die zal worden gehecht aan de RN.
  5. Verbind de elektroden met de overeenkomstige BNC-kabels zoals beschreven in paragraaf 6.3.

8. Het opzetten van de Force Transducer om de I1/I3 Muscle Contractie Meet

  1. Om de krachtomzetters hechten aan de spier, gebruik maken van zijden hechtdraden. Buig de gebogen naald van elk hechtdraad, en bind de hechtdraad om de kracht transducer. Voorzichtig grijpen en een kleine hoeveelheid spier lift met forceps en terwijl de naald in een ander stel forceps Plaatsde naald door de spier tot de gebogen punt in de naald (figuur 1).
  2. Transducers kan ofwel dorsaal-of lateraal worden bevestigd op de I1/I3 spier. Dorsale werktuig maken meting van contracties opgeroepen door activering van de linker-of rechterkant van de spier. Laterale bevestigingspunten toont sterkere krachten voor de meerderheid van neuronen, maar zal meting van contractie staan ​​alleen aan de zijde waaraan de transducer is bevestigd.
  3. Te helpen identificeren neuronen die u kunnen activeren anterior, posterior, of beide gebieden van I1/I3, hechten een kracht transducer om de posterior deel van de spier, net anterieur van de faryngeale weefsel, en bevestig andere kracht transducer om de voorste deel van het spier, ten de bekken (Figuur 1; noot haken).
  4. Til de krachtomzetters totdat de hechtingen worden strak getrokken, maar laat je niet te veel uitrekken. Om dit te controleren, bekijkt u de meting van de krachtopnemer wanneer de hechting heeft wat speling in it, en til de transducer tot de meting is iets boven dit basisniveau.

9. Het identificeren van Motor Neuronen binnen een Motor Pool

  1. Dit protocol beschrijft een proces voor extracellulair het identificeren van motorische neuronen binnen een motor zwembad. We gebruikt AxoGraph software om de activiteit van individuele neuronen, meerdere zenuwen, en de spier (EMG signaal of contractie krachten) toezicht houden. In dit protocol, hebben we de samentrekking krachten van de spier gebruikt als een illustratie voor de proces van het identificeren motor neuronen; in andere experimenten, gebruikten we EMG als goed, en de setup voor dergelijke experimenten is zeer vergelijkbaar (zie Discussie).
  2. Om een kandidaat neuron te lokaliseren, gebruikt u de manipulator om voorzichtig op de punt van de extracellulaire glazen elektrode naar beneden op de huls over het midden van de neuron soma 5 (Figuur 3), dat is de beste locatie voor stimulatie en het opnemen selectiviteit 5. Aangezien de drempelstroom fof activeren van een neuron lineair toeneemt met elektrode naar soma afstand 5 wordt de stimulatie selectiviteit erger wanneer de elektrode verder van het midden van het doel neuron naar een naburige neuron.
  3. Om een ​​motor neuron te identificeren, eerst direct stimuleren het neuron met behulp van de extracellulaire glaselektrode om ervoor te zorgen dat alleen dit neuron wordt middel van verhitting, en onderzoekt zij of de spier innerveert. Dan, extracellulair document uit dit neuron tot doel een one-for-een relatie tussen de extracellulaire soma opname en de zenuw opnames, die ook cruciaal is voor neuron identificatie.
  4. Aangezien de meeste extracellulaire versterkers staan ​​niet toe dat simultaan stimuleren en de opname in een kanaal, het kanaal gebruikt voor het stimuleren en de soma (het soma kanaal) opnemen op stimulatie-modus en een korte anodische stroom (bijvoorbeeld 6 msec voor Aplysia neuronen 5) van toepassing op de soma (Figuren 4A, 5A, noot pijlen 1 in beide figuren), vanaf een lage stroom (bijvoorbeeld 200 pA), geleidelijk verhoogd tot de huidige neuron barst.
  5. Zodra het neuron geactiveerd is om te barsten, moet men onmiddellijk over te schakelen van de soma kanaal van de stimulatie-modus om de opnamemodus (Figuren 4A, 5A, noot pijlen 2 in beide figuren). Echter, zal er nog steeds vertragingen tussen de soma stimulatie en-opname als gevolg van de reactie bij mensen vertragingen.
  6. Indien de neuron branden op een redelijke hoeveelheid tijd, moet het mogelijk te observeren one-voor-one overeenkomstige actie potentialen vanaf dit soma opname en op de zenuw (s) waardoorheen de neuron projecten (figuren 4B, 5B; nota streeplijnen ), evenals de krachten gegenereerd door de neuron (figuren 4A, 5A; noot blue boxes). Indien de neuron stopt afvuren voordat de soma opname begint, verhoging van het huidige deze activeren voor een langere tijd.
  7. De signaal-ruisverhouding van het extracellulaireopnamen afhankelijk van de electrode locatie en soma size. De extracellulaire opname zal groter worden als de soma grootte toename en elektrode-to-soma afstand afneemt. Aangezien de ruis alleen varieert in een smal bereik, zal het signaal-to-ruisverhouding ook worden verhoogd doordat de soma schaalvergroting en de elektrode-to-soma is kleiner. Het meest gebruikelijke meetbereik van de signaal-ruisverhouding is 4u01-8:01u.
  8. De motor neuronen kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun kenmerken, zoals soma locatie-, zenuw-projectie en spier-innervatie 4,6,7. Aangezien enkel deze twee BN2s zijn bevestigd aan de buccale massa, door het bewaken de activiteit op de BN2s, kan men ervoor zorgen dat de spiercontractie werking dan wordt veroorzaakt door de neuron geactiveerd door de extracellulaire stimulatie.
  9. Bijvoorbeeld B3 is een grote motor neuron de I1/I3 spier (300-400 urn in diameter in soma dieren van 200 tot 350 gram) aan de zijde van de rostrale buccale ganglion (fig. 3 ). Het alleen projecten via de ipsilaterale BN2, en innerveert zowel de anterior en posterior delen van de I1/I3 spier. De meeste van de tijd, het activeren van het genereert een grotere anterior zijn dan posterieure kracht (8 van de 9 experimenten).
  10. Nadat een neuron is geïdentificeerd, kan zijn activiteiten worden geregistreerd in verschillende voederstrategieën-achtige gedrag via het extracellulaire glaselektrode (figuren 4 en 5), die kunnen worden uitgelokt zoals hieronder beschreven. Het extracellulaire opname op de soma zal veel specifieker zijn dan het zenuw opnamen, die de activiteit van vele verschillende neuronen omvatten.
  11. Om egestive-like motorische programma induceren, stimuleren BN2-a met 1-2 min van pulsen 19 (2Hz, elke puls is 1 msec). Deze stimulatie genereert een betrouwbare manier egestive patronen in deze instelling. Met voldoende huidige (bijv. 300 uA), kan Bebo patronen aanhouden de duur van de stimulatie. Soms is er nog een patroon dat zich voordoet kort na zijnde stimulatie stopt.
  12. Om ingestive-like motorische programma induceren, plaats een enkele kristallen solid carbachol direct op de schede van de cerebrale ganglion 15. Als men wil controle het niveau van carbachol exposure, gebruik een oplossing van 1 tot 10 mM carbachol in Aplysia saline. Hogere concentraties hebben meer kans om te induceren. Zich herhalende patronen het algemeen beginnen binnen vijf minuten, en kan voor ongeveer tien tot vijftien minuten duren alvorens te beginnen met run down.
  13. Na uitwassen carbachol meerdere malen en wachten minstens 30 min, kan een latere toepassing van carbachol worden toegevoegd aan de cerebrale ganglion om more ingestive-like motor patterns induceren.
  14. Na meerdere motorische neuronen voor de specifieke motor groep zijn geïdentificeerd en gekarakteriseerd tijdens motorische programma's, kan men de ontwikkeling van een sterk vereenvoudigd diagnostische methode die minimale informatie voor het snel identificeren van deze neuronen in de toekomst het werk (Figuur 6 vereist </ Strong>), bijvoorbeeld in de geschorste buccale massa preparaten of in vivo. De criteria kunnen onder meer soma grootte en de locatie-, zenuw-projectie-,-eenheid grootte op de zenuwen, en de timing van activiteit tijdens motorische patronen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuren 4 en 5 tonen typische resultaten gebruikt om twee I1/I3 motorneuronen identificeren. Figuur 4 toont het soma opnamen van een grote motor neuron, B3, tijdens egestive-achtige en ingestive-achtige patronen (figuren 4C, 4D). De een-op-een overeenkomstige pieken op de soma kanaal en het ipsilaterale BN2 kanaal (figuur 4E) tonen aan dat de specificiteit van B3 soma opname werd gehandhaafd tijdens patronen. B3 vuurt in het midden-tot-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dieren met grote geïdentificeerde neuronen, zoals weekdieren (bijvoorbeeld Lymnaea, Helix, en Aplysia), analyse van motor pools wordt meestal gedaan met behulp intracellulaire opname 1,2,3,4. In dit protocol, beschrijven we een werkwijze voor uniek identificeren de motor neuronen voor een motor pool behulp een extracellulair techniek. We de krachtmetingen gebruikt als illustratie van dit proces. Men zou ook kunnen gebruik maken van EMG om spier te innervaties te meten. Kort, daartoe, de p...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

We hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door NIH subsidie ​​NS047073 en NSF subsidie ​​DMS1010434.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam Vennootschap Catalogusnummer Reacties
Natriumchloride Fisher Scientific S671 Biologische, Certified
Kaliumchloride Fisher Scientific P217 Gecertificeerde ACS
Magnesiumchloridehexahydraat Acros Organics 19753 99%
Magnesiumsulfaat heptahydraat Fisher Scientific M63 Gecertificeerde ACS
Calciumchloridedihydraat Fisher Scientifc C79 Gecertificeerde ACS
Glucose (dextrose) Sigma-Aldrich G7528 BioXtra
MOPS Buffer Acros Organics 17263 99%
Carbachol Acros Organics 10824 99%
Natriumhydroxide Fisher Scientific SS255 Certified
Zoutzuur Fisher Scientific SA49 Certified
Single-barrelled capillair glas AM Systems 6150
Flaming-Brown micropipet trekker model P-80/PC Sutter Instrumenten Filament gebruikte: FT345B
Emaillen roestvrij staaldraad California Fine Wire 0.001D, coating h
Huishoudelijke Silicone II Lijm GE
Duro Quick-Gel superlijm Henkel corp.
AM Systems Model 1700 versterker AM Systems Filterinstellingen: 10-500 Hz voor de I2 zenuw / spier; 300-500 Hz voor alle andere zenuwen
Pulsemaster Multi-Channel Stimulator Wereld Precisie-instrumenten A300
Stimulus Isolator Wereld Precisie-instrumenten A360
AxoGraph X AxoGraph Wetenschappelijke Software voor opnames
Gold Connector Pins Bulgin SA3148 / 1
Gold Connector Sockets Bulgin SA3149 / 1
Sylgard 184 siliconelastomeerfase Dow Corning
100 x 15 mm Crystalizing Schotel Pyrex
High Vacuum Grease Dow Corning
Pipettips Fisher Scientific 21-375D
Minutien Pins Fine Science Tools 26.002-10
Boetseerklei Sargent Kunst 22-4.400
Whisper Air Pump Tetra 77849
Aquarium Tubing Eheim 7783 12/16 mm
Elite Bruissteen Hagen A962
Vannas Spring Schaar Fine Science Tools 15.000-08
Dumont # 5 Fine Forceps Fijn Science Gereedschap 11.254-20
Kimwipes Kimberly-Clark 34155

Referenties

  1. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  2. Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
  3. Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
  4. Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
  5. Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
  6. Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
  7. Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
  8. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320(2012).
  9. Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791(2010).
  10. Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
  11. Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
  12. Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
  13. Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
  14. Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
  15. Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
  16. Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
  17. Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
  18. Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
  19. Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
  20. Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
  21. Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
  22. Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
  23. Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
  24. Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
  25. Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
  26. Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
  27. Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
  28. Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
  29. Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
  30. Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Extracellulaire stimulatieidentificatie van motorneuronenbuccale gangliazuigelektrodenglaselektrodenspierinnervatieaxonale projectiekrachttransductieelektrofysiologische registratie
Extracellulair Het identificeren van Motor Neuronen voor een Muscle Motor Pool in
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.