Genetisch gecodeerd optogenetic tools kunnen niet-invasieve manipulatie van specifieke neuronen in de Drosophila Hersenen. Dergelijke instrumenten kunnen identificeren neuronen waarvan activering is voldoende om te lokken of te onderdrukken bepaalde gedragingen. Hier wordt een werkwijze voor het activeren Channelrhodopsin2 die wordt uitgedrukt in specifieke neuronen in vrijlopende vliegen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Optogenetic Stimulatie van Escape Gedrag in
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Steeds genetisch gecodeerde hulpmiddelen steeds beschikbaar waarmee non-invasieve manipulatie van de neurale activiteit van specifieke neuronen in Drosophila melanogaster 1. De belangrijkste zijn optogenetic tools, die de activering of silencing van specifieke neuronen in de intact en vrij bewegende dieren met behulp van helder licht mogelijk te maken. Channelrhodopsin (ChR2) is een door licht geactiveerde kation kanaal dat, wanneer geactiveerd door blauw licht, veroorzaakt depolarisatie van neuronen die het uit te drukken. ChR2 effectief is geweest voor het identificeren van neuronen van cruciaal belang voor specifieke gedragingen, zoals CO 2 vermijden, proboscis uitbreiding en reuze-vezels gemedieerde schrikreacties 2-4. Aangezien de sterke lichtbron gebruikt om ook stimuleren ChR2 fotoreceptoren stimuleren, zijn deze technieken optogenetic niet eerder toegepast in het visuele systeem. Hier combineren we een optogenetic aanpak met een mutatie die fototransductie schaadt de demonstrate dat activering van een cluster van loom-gevoelige neuronen in de vlieg optische kwab, Foma-1 neuronen, rijdt een vluchtgedrag gebruikt om botsing te voorkomen. We gebruikten een nul-allel van een essentieel onderdeel van de fototransductiecascade, aan fosfolipase C-β, gecodeerd door het gen norpA, dat zij de blinde vliegt en ook de Gal4-UAS transcriptionele activator systeem expressie van ChR2 rijden in de Foma-1 neuronen. Individuele vliegen worden geplaatst op een klein platform omringd door blauwe LED's. Wanneer de LEDs branden, de vliegen snel opstijgen in vlucht, op soortgelijke wijze visueel gedreven loom-vluchtgedrag. Wij geloven dat deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast aan andere gedrag onderzocht in vrij bewegende vliegen.
Inleiding
Een groeiend arsenaal van genetisch gecodeerde instrumenten zijn ontwikkeld om neurale activiteit in specifieke cellen in Drosophila melanogaster 1 manipuleren. Deze tools stellen de niet-invasieve activering of silencing van specifieke neuronen in de intact en vrij bewegende dieren. Onder deze, Channelrhodopsin2 (ChR2), een door licht geactiveerde kation kanaal, biedt belangrijke voordelen, omdat het kan tijdelijk worden gecontroleerd en snel geïnduceerd. Wanneer neuronen die uitdrukkelijke ChR2 worden blootgesteld aan helder blauw (470 nm) licht dat ze snel depolariseren en vertonen verhoogde werkingsveld 3-5. Dergelijke gerichte activering van specifieke neuronen in vrij bewegende dieren is gebleken dat de toereikendheid van de bijzondere neuronen voor gedrag, zoals CO 2 vermijden 3, proboscis extensie 2,4, en Giant-vezels gemedieerde schrikreacties 4. Echter, zoals de sterke lichtbron nodig is om ChR2 stimuleren ook het stimuleren van fotoreceptoren, de toepassing optogenetic technieken om het visuele systeem is beperkt. Door combinatie van een optogenetic benadering met een mutatie die fototransductie schaadt, hebben we aangetoond dat activatie van een specifieke cluster van neuronen in de vlieg optische kwab de vluchtgedrag gebruikt om botsing te voorkomen 6 rijden.
De meeste, zo niet alle, visuele dieren vertonen een vluchtgedrag om botsingen te voorkomen met tegemoetkomend objecten. Wandelen of stationair vliegen, wanneer voorgesteld met een dreigende botsing, take-off op de vlucht, weg van de naderende botsing 7-9. Deze take-offs worden gekenmerkt door verhoogde vleugels voorafgaand aan de start-en een onstabiele vlucht traject 10,11. Dit antwoord is verschillend van de reus-vezel gemedieerde schrikreactie, sprongen die niet worden voorafgegaan door opgeheven vleugels, en meestal resulteert in een vrije val tuimelen 4,9. De identificatie van een specifiek cluster van weefgetouw gevoelige neuronen in de optische lob, Foma-1 neuronen, die uniquely afgestemd op het naderen van objecten coderen, we probeerden hun betrokkenheid bij weefgetouw van de vlieg vluchtgedrag onderzoeken. Hier laten we zien het gebruik van het selectief activeren optogenetics deze neuronen en opwekken van de vlieg vluchtgedrag.
We gebruiken de Gal4-UAS transcriptionele activator systeem om de expressie van ChR2 rijden in de Foma-1 neuronen. ChR2 vereist de cofactor all-trans-retinal en als deze is te vinden in lage concentraties in het Drosophila centrale zenuwstelsel moet worden aangevuld in het vliegen 'dieet. 3,4 als fel licht wordt gebruikt om ChR2 activeren en vliegen vertonen sterke phototactic gedrag 12, zochten we de mogelijkheid van een visuele reactie op de stimulus te elimineren. Hiervoor gebruikten we dieren die homozygoot mutant waren voor een nul-allel van het norpA gen, dat een essentieel onderdeel van de fototransductiecascade, fosfolipase C-β codeert. Fotoreceptoren in een dergelijke mutant vliegen in staat zijn om verantwoorded tot 13 licht. Om de optogenetic stimulatie van de ontsnapping respons te testen, moeten we een enkele vlieg te isoleren en te baden in helder blauw licht. Om dit te doen, plaatsen we de individuele vliegen in pipetpunten. Een pipet tip wordt geplaatst in een aangepaste houder, zodanig dat de vlieg geotactically loopt de tip en uit op een rechthoekig platform. De vlieg is in staat om vrij rond te lopen op de top van dit platform. Het platform wordt omringd door vier blauwe LED arrays, elk 3 LEDs, gericht op de bovenkant van het platform. Na de vlieg op het platform, worden de LED's branden, en de vlieg reactie wordt opgenomen met behulp van een high-speed camera 6.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Genereer Channelrhodopsin Flies
- Cross UAS-ChR2 vliegen met de Gal4 driver van uw keuze maken wij gebruik van G105-Gal4, die wordt uitgedrukt in Foma-1 neuronen in de optische lob.
- Om de mogelijkheid van een visuele reactie op het blauwe licht stimulatie te elimineren, zowel vlieg lijnen zijn in aw + norpA achtergrond.
- Eindresultaat: w + norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Na volwassen vliegt Eclose, zet geselecteerd vrouwen aan vers voedsel, aangevuld met 10 uM all-trans-retinal (een co-factor die nodig is voor ChR2) en beschermd tegen licht, gedurende 3 dagen voor het uitvoeren van de gedrags-test.
2. Maak 10 pM All-trans-retinal Enhanced Eten
- Los 100 mg all-trans-retinal in 17,6 ml 95% ethanol om 20 mM netvlies. Houd all-trans-retinal beschermd tegen licht te allen tijde.
- Smelt standaard maïsmeel vlieg voedsel in de magnetron, en laat het afkoelen tot warm om aan te raken.
- Mix 50 pi 20 mMall-trans-retinal in flesjes van 10 ml van vlieg voedsel.
- Laat flacons afkoelen en bewaar beschermd tegen licht.
3. Uitrusting
- Pipet tips: Standaard 1.000 ul pipet tips worden gesneden in de buurt van de top, het creëren van een porie diameter van ~ 2,25 mm.
- Platform (zie figuur 1).
- Een Delrin basis, werd 17 cm X 25 cm, uitgevoerd met schroefgaten op elke hoek naar ¼ "NPT koelvloeistofslang connectoren passen.
- Een verticale houder, gemaakt van Delrin, is bevestigd aan het midden van de basis. De afmetingen zijn 25 mm X 40 mm X 65 mm (breedte x diepte x hoogte). Een 10 mm brede groef loopt de lengte van de houder, met een vleugelmoer aan de onderkant. Een platform is aan de bovenzijde van de houder 25 mm X 40 mm X 10 mm met een 3,5 mm diameter gat uitgelijnd met de groef in de houder.
- LED arrays (zie figuur 1).
- Vier armen van de koelvloeistof slang, ~ 18 cm lang, zijn aangebracht op het platform base het gebruik van de koelvloeistof slang connector. Koelvloeistofslang wordt alleen gebruikt als structurele ondersteuning en wordt niet gebruikt voor koeling.
- Goed geplaatste groeven gesneden in het laatste stukje van de koelvloeistof schoonspuiten van elke arm aan te brengen een koellichaam aan het einde van elke arm.
- Een blauwe LED Rebel Tri-Stars is gemonteerd aan elk koellichaam met behulp van pre-cut thermische plakband. Een Carclo 18 ° Tri-lens is aangebracht op elke Tri-Star.
- LED Tri-Stars zijn aangesloten op de BuckPuck DC drivers en een voeding zoals gespecificeerd. We hebben geregeld onze set-up met elke BuckPuck voeden twee Tri-Stars in serie.
- Verlichting van alle vier de Tri-Stars LED bij 700 mA leverde een instraling van 713 W / m 2 op ons platform.
- Camera: De camera is gemonteerd op een statief en gericht op de bovenkant van het platform.
4. Behavioral Assay
- Kort verdoven vliegen op ijs.
- Plaats individuele vliegen in pipetpunten, met behulp van tape te sluitenBeide uiteinden van de tip.
- Na de vliegen hebben gewekt en actief verkennen van de pipet tip, verwijdert u de tape en plaats een pipet in de groef in verticale houder. De schroef wordt gebruikt om de pipet te vergrendelen en de onderkant van de tip sluiten.
- Als de vlieg verkent de pipet tip (meestal 30 - 60 sec), start de camera de opname net voor de vlieg blijkt uit de punt op het platform.
- Na de vlieg is ontstaan op het platform, Wacht 1-2 seco, en zet de blauwe LED's. Gebruik een timer om handmatig meten van de tijd totdat de vlieg initieert vlucht.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Blind vliegt die ofwel ChR2 of de G105 driver alleen laten een laag percentage van de start na hun verlichting met helder blauw licht. Blind vliegt vertoonde hetzelfde percentage van de start, ongeacht de verlichting (Figuur 2), wat suggereert dat deze take-offs spontane waren in plaats van als gevolg van de belichting met blauw licht. Wanneer de ChR2 wordt uitgedrukt in de Foma1 neuronen echter belichting met blauw licht roept de escape response. Meer dan 50% van de geteste vliegen nam binnen 1 sec van...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben aangetoond optogenetic stimulatie van ontsnapping gedrag door te baden vrij wandelen vliegen in helder blauw licht. Deze benadering kan eenvoudig worden aangepast aan andere gedrag onderzocht vrijlopende vliegen en kan worden geschaald naar grotere platforms door eenvoudig betegelen de LED-reeksen we over een groter gebied. Met behulp van de goedkope camera beschrijven we, of andere beschikbare camera systemen, kan de gebruiker op maat van de frame rate en de ruimtelijke resolutie van de beelden die op h...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door een Stanford Dean's Fellowship (SEJdV), een National Institutes of Health Pioneer Director's Award (TRC DP0035350), een McKnight Foundation Scholar Award (TRC) en R01 EY022638 (TRC).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagens | |||
| All-trans netvlies | Advance Scientific & Chemical Inc | R3041 | |
| Uitrusting | |||
| Koellichaam 9,2 C / W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm vierkant X 30 mm hoog |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blauwe Rebel LED aan Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-DE-700 | |
| Kabelboom voor BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Voorgesneden thermische plakband | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼ "ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant slangkoppeling | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼ "NPT Man |
| Laboratorium Grade omschakelmodus Programmeerbare DC voeding | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 |
Referenties
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O'Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
