Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Metabole Labeling van Nieuw Transcribed RNA voor hoge resolutie genexpressieprofilering van RNA synthese, verwerking en Decay in Cell Culture

27K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50195

⸱

8 augustus 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max von Pettenkofer Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Totaal cellulair RNA verschaft een slechte template voor het bestuderen korte termijn veranderingen in RNA synthese en verval en de kinetiek van RNA processing. We beschrijven hier metabolisch merken van nieuw getranscribeerde RNA met 4-thiouridine gevolgd door thiol-specifieke biotinylering en zuivering van nieuw getranscribeerde RNA waardoor deze beperkingen te overwinnen.

Samenvatting

De ontwikkeling van de hele-transcriptome microarrays en next-generation sequencing heeft een revolutie ons begrip van de complexiteit van de cellulaire genexpressie. Naast een beter begrip van de moleculaire mechanismen betrokken zijn nauwkeurige metingen van de onderliggende kinetiek steeds belangrijker geworden. Hier, deze krachtige methodieken staan ​​voor grote beperkingen als gevolg van intrinsieke eigenschappen van de sjabloon monsters ze studeren, dwz totaal cellulair RNA. In veel gevallen optreden veranderingen in totaal cellulair RNA ofwel te langzaam of te snel om de onderliggende moleculaire gebeurtenissen en hun kinetiek vertegenwoordigen voldoende resolutie. Daarnaast wordt de bijdrage van veranderingen in RNA synthese, verwerking en verval niet gemakkelijk onderscheiden.

We hebben onlangs ontwikkelde hoge-resolutie genexpressieprofilering om deze beperkingen te overwinnen. Er wordt gebruik gemaakt van metabolisch merken van nieuw getranscribeerde RNA met 4-thiouridine (dus ook wel 4SU-tagging) gevolgd door strenge zuivering van nieuw RNA getranscribeerd met thiol-specifieke biotinylering en streptavidine beklede magnetische korrels. Het is toepasbaar op een breed scala aan organismen, waaronder gewervelden, Drosophila en gist. Wij hebben met succes 4SU-tagging toegepast om te studeren real-time kinetiek van transcriptiefactor activiteiten, nauwkeurige metingen van RNA halfwaardetijden, en het verkrijgen van nieuwe inzichten in de kinetiek van RNA processing. Tenslotte kunnen computermodellen worden gebruikt om een ​​geïntegreerde, alomvattende analyse van de onderliggende moleculaire mechanismen te genereren.

Inleiding

Genexpressie is een belangrijk instrument dat wordt gebruikt om cellulaire processen en de bijbehorende complexe interactie netwerk bestuderen. Studies over mRNA overvloed hebben meestal al de methode van keuze voor fundamentele inzichten te krijgen in de onderliggende moleculaire mechanismen. De ontwikkeling van de hele-transcriptome microarrays 1 en, meer recentelijk, next-generation sequencing van RNA (RNA-seq) 2-4 aangewakkerd deze aanpak. Hoewel deze technologieën ons begrip van de complexiteit van de cellulaire genexpressie hebben een revolutie, waarmee zij worden geconfronteerd grote beperkingen als gevolg van de intrinsieke eigenschappen van hun template monster, dwz totaal cellulair RNA. Eerste, korte-termijn veranderingen in totaal RNA niet overeenkomen veranderingen in transcriptiesnelheden, maar inherent afhankelijk RNA halfwaardetijd van de respectievelijke transcripten. Terwijl een vijfvoudige inductie van een kortstondige transcript, bijv. coderend voor een transcriptiefactor, zal gemakkelijk detecteerbaar in totaal RNAbinnen een uur, dezelfde inductie van een langlevende transcript, bijv. codeert voor een metabolisch enzym, zal vrijwel onzichtbaar blijven. Bovendien, zelfs een complete shut-down (> 1.000-voudig down-regulatie) in de transcriptie snelheid van een gemiddelde gen met een RNA halfwaardetijd van vijf uur zal nemen gewoon vijf uur om zijn totaal RNA niveaus dalen met slechts tweeledig . Daarom analyse van totaal RNA bevordert de detectie van opwaartse regulatie van kortlevende transcripten, waarvan vele coderen voor transcriptiefactoren en genen met regulerende functie 5. Daarnaast wordt de ware kinetische cascade van regulering verduisterd en primaire signalering evenementen kunnen niet worden onderscheiden van de secundaire. Beide zijn beurt kan leiden tot aanzienlijke vertekening in daaropvolgende bioinformatica analyses. Ten tweede, kunnen veranderingen in totaal RNA niveaus niet worden toegeschreven aan veranderingen in RNA synthese of verval. Metingen van de laatste eisen cel invasieve benaderingen, zoals het blokkeren van Transcriptiover het gebruik van actinomycine D 6, en uitgebreide monitoring van lopende RNA verval in de tijd. Met een gemiddelde mRNA halfwaardetijd in zoogdiercellen van 5-10 uur 5,7, wordt mRNA van de meeste genen slechts gedaald met minder dan twee keer na verscheidene uren van transcriptionele arrest. Deze vrij kleine verschillen leiden tot grove onnauwkeurige metingen van mRNA halfwaardetijden van de meeste cellulaire genen als gevolg van de exponentiële aard van de onderliggende wiskundige vergelijkingen. Tenslotte, terwijl de RNA-seq van totaal cellulair RNA bleek dat ongeveer de helft van onze genen kunnen alternatieve splicing gebeurtenissen 8, de onderliggende kinetiek en de dynamische mechanismen leidende weefsel-en context-specifieke regulatie van RNA processing blijven slecht begrepen. Bovendien is de bijdrage van RNA verwerking differentiële genexpressie, in het bijzonder voor niet-coderende RNA's, nog worden vastgesteld. Al met al, deze beperkingen vormen de belangrijkste obstakels voorbioinformatic kinetische modellering van de onderliggende moleculaire mechanismen.

Onlangs hebben we een aanpak ontwikkeld, genaamd hoge resolutie genexpressieprofilering, om deze problemen te overwinnen 5,7,9. Het is gebaseerd op metabolisch merken van nieuw getranscribeerde RNA onder toepassing van 4-thiouridine (4SU-tagging), een natuurlijk voorkomende derivaat uridine en geeft direct toegang tot nieuw getranscribeerde transcripten met minimale tussenkomst in celgroei en genexpressie (zie figuur 1) 5, 10-12. Blootstelling van eukaryote cellen om 4SU resultaten in zijn snelle opname, fosforylering aan 4SU-trifosfaat, en incorporatie in nieuw getranscribeerde RNA. Na isolatie van totaal cellulair RNA, de 4SU-gelabelde RNA fractie thiol-specifiek gebiotinyleerd genereren van een disulfidebinding tussen de biotine en nieuw getranscribeerde RNA. 'Totaal cellulair RNA' kan dan kwantitatief worden gescheiden in het label ('nieuw getranscribeerd') en niet-gemerkte ('pre-existing ') RNA met hoge zuiverheid met streptavidine beklede magnetische korrels. Tenslotte wordt gelabeld RNA gewonnen uit de parels door het toevoegen van een reductiemiddel (bijvoorbeeld dithiothreitol) splitsen van het disulfide binding en het vrijgeven van de nieuw getranscribeerde RNA van de bolletjes.

Nieuw getranscribeerd RNA toont de transcriptionele activiteit van elk gen in het tijdsbestek van 4SU blootstelling. 4SU-tagging in de tijdschaal van minuten verschaft dus een momentopname van eukaryote genexpressie en een ideale sjabloon voor downstream-bioinformatica analyses (bv promotor analyse). In gevallen waarin steady-state omstandigheden kan worden aangenomen, de verhoudingen van nieuw getranscribeerd / totaal, opnieuw opgeschreven / ongelabelde en ongelabelde / totaal RNA bieden niet-invasieve en toegang tot nauwkeurige RNA halfwaardetijden 7,13. Bovendien is het belangrijk op te merken dat nieuw getranscribeerde RNA gezuiverd na slechts 5 min 4SU-tagging (5 min 4SU-RNA) jonger dan 15 en 60 min 4SU-RNA.Bij het ​​uitvoeren van zowel de ultra-korte en progressief langere 4SU-tagging in een experimentele setting gecombineerd met RNA-seq, zijn de kinetiek van RNA processing onthuld op nucleotide resolutie 9. Tenslotte tijdsverloop analyses van nieuw getranscribeerd en totaal RNA gecombineerd met computermodellen laten een geïntegreerde analyse van RNA synthese en verval 14.

Kortom, deze benadering maakt de directe analyse van de dynamica van RNA-synthese, verwerking en afbraak in eukaryote cellen. Het is in alle belangrijke modelorganismen zoals zoogdieren, insecten (Drosophila), amfibieën (Xenopus), en gist 5,15,16 toepassing. Het is direct compatibel met microarray analyse 5,17, RNA-seq 9,13,14, en is in vivo 12,15 toepassing. Hier hebben we detail de methodologie te labelen, te isoleren en te zuiveren nieuw getranscribeerd RNA in gekweekte zoogdiercellen. Bovendien, potentiometeral problemen en valkuilen worden besproken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Metabole Labeling met 4-thiouridine

Maak een gedetailleerd plan van de experimentele opstelling / schema, bijv. bij de 4SU toevoegen aan celkweek en wanneer de monsters te oogsten. Plan ten minste 5 minuten tussen elke conditie. Slechts behandelen cellen van een voorwaarde tegelijk. Handvat max. 3 - 5 gerechten op een gegeven moment. Behandel cellen zo snel mogelijk veranderingen in temperatuur en CO2 te minimaliseren. Vermijd blootstelling van de cellen aan fel licht na 4SU wordt toegevoegd, omdat dit kan leiden tot verknoping van 4SU-gelabelde RNA aan cellulaire eiwitten.

Start van etikettering

  1. Dooi 4-thiouridine (4SU) vlak voor gebruik en pipet benodigde hoeveelheid 4SU voor elke aandoening in een steriele Falcon buis.
  2. Neem de benodigde hoeveelheid celcultuurmedium (5 ml per 10 cm schaal) van de borden en voeg aan 4SU bevattende Falcon buis en meng. Verwijder de resterende medium uit de gerechten.
  3. Breng 4SU-bevattend medium terug naar de gerechten.

Einde van de etikettering

  1. Verwijder celkweekmedium van cellen. Voeg 5 ml Trizol aan elke plaat. Voor complexe experimenten, inclusief verschillende tijdstippen of voorwaarden, wordt deze stap best gedaan door twee mensen, een verwijdering van het medium, de andere het toevoegen Trizol en het oogsten van de lysaat.
  2. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur volledige cellysis.
  3. Gebruik een pipet 10 ml om de plaat af te spoelen met de toegevoegde Trizol. Dit helpt volledige cellysis en sample herstel. Voorzichtig behandelen als Trizol is zeer gevaarlijk bij contact met de huid of ogen! Hebben tegengif voor fenol brandwonden bij de hand (bv. polyethyleen glycol 300 of 400 in industriële spiritus (70:30)). Overdracht monsters polypropyleenbuizen. Houd er rekening mee dat standaard Falcon buizen niet deze hoge g krachten te weerstaan). Monsters kunnen bij -20 ° C gedurende ten minste een maand bewaard tot totale RNA is bereid.

2. RNA Voorbereiding behulp Gewijzigd Trizol Protocol

  1. Voeg 1 ml chloroform (0,2 ml per ml Trizol) en schud krachtig gedurende 15 sec. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.
  2. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
  3. Breng waterige bovenste fase (die het RNA) een nieuwe 15 ml polypropyleen buis.
  4. Voeg ½ het reactievolume van beide RNA neerslag buffer en isopropanol (bijv. 3 ml supernatant voeg 1,5 ml RNA neerslag buffer en 1,5 ml isopropanol).
  5. Meng goed. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
  6. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gooi supernatant.
  7. Kort spin down (5000 g gedurende 30 seconden) en verwijder resterende isopropanol met 200 ul pipet.
  8. Voeg een gelijk volume van 75% ethanol en schud buis totdat de pellet loskomt. Vermijd breken in vele kleine stukjes als deze kunnen maken verwijdering van residuenl ethanol moeilijk.
  9. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gooi supernatant.
  10. Spin down RNA kort en verwijder resterende ethanol met een 200 ul pipet. Herhaal stap en verwijder de resterende ethanol met een 20 ul pipet. Na deze twee stappen is nadere drogen van de pellet wordt uitgevoerd.
  11. Voeg 100 ui H2O per 100 ug verwachte RNA opbrengst en meng goed door en neer te pipetteren 5-6 keer om te helpen bij het ​​oplossen van het RNA.
  12. Oplossen en denatureren RNA door verwarming tot 65 ° C gedurende 10 min (shaker) normaal en plaats op ijs.
  13. Meet RNA concentratie bij 260 nm met behulp van een NanoDrop spectrofotometer, volgens de instructies van de fabrikant. Dit RNA kan bij -80 ° C gedurende ten minste een maand worden bewaard.

3. Thiol specifieke Biotinylatie van Newly Transcribed RNA

  1. Begin met 60 - 80 ug totaal cellulair RNA.
  2. Vormen etikettering reactie. Pipetteer in de volgendeOm (per ug RNA):
    1. 1 pi 10x Buffer Biotinylering
    2. 7 pl RNA (met 1 ug RNA verdund in nuclease-vrij H2O)
    3. 2 ui biotine-HPDP (1 mg / ml DMF)

Voeg altijd de biotine-HPDP laatste en meng onmiddellijk door pipetteren. In geval precipiteert het biotine, kan DMF inhoud worden verhoogd tot een eindconcentratie van 40%.

  1. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1,5 uur met rotatie.
  2. Voeg een gelijk volume chloroform. Meng krachtig. Incubeer gedurende 2-3 minuten totdat de fasen te scheiden en beginnen bellen beginnen te verdwijnen.
  3. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe buis zorgvuldig.
  4. Herhaal de stappen 3.4 en 3.5 keer. Misschien wilt u deze stap uit te voeren in 2 ml Phase Lock Gel Zware buizen om het verlies van RNA te verminderen.
  5. RNA neerslag: voeg 1/10 van het volume 5 M NaCl en een gelijk volumeisopropanol aan de waterfase.
  6. Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Gooi supernatant.
  7. Voeg een gelijk volume van 75% ethanol, centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, gooi supernatant.
  8. Spin kort en verwijder de resterende ethanol met 200 ul pipet.
  9. Spin kort en verwijder de resterende ethanol met 20 ul pipet.
  10. Sta niet toe dat RNA om te drogen. Resuspendeer in 50 - 100 ul H 2 O (~ 1 ui per 1 pg ingang RNA). Meng goed door en neer te pipetteren 5-6 keer.
  11. Controleer RNA kwaliteit door elektroforetische analyse om RNA degradatie te sluiten.

4. Dot Blot Analyse van 4SU-opname (optioneel)

4SU ​​opname kan gemakkelijk worden bepaald door dot blot analyse van gebiotinyleerd RNA. Dit is een optionele stap die trouble shooting en de schatting van 4SU bijmengingspercentages ten opzichte van een gebiotinyleerd DNA-oligo-controle mogelijk maakt. Voor deze test we recommend met joodacetyl-biotine in plaats van biotine-HPDP voor biotinylering van 4SU-gelabelde RNA in stap 3.2. Dit leidt tot een onomkeerbare biotinylering van 4SU-RNA. Daarom kolom-gebaseerde methoden (bijv. RNeasy) kan worden gebruikt voor het herstel van veel kleinere hoeveelheden gebiotinyleerd RNA (bijvoorbeeld 5 ug). Terwijl RNA gebiotinyleerd met biotine-HPDP is ook geschikt voor deze test, het resulterende signaal zwakker en de signaal-ruis-verhouding ongunstiger (figuur 3).

  1. Volg het protocol voor 4SU-etikettering en de isolatie van totaal cellulair RNA, zoals beschreven in de paragrafen 1 en 2.
  2. Biotinyleren 4SU-gelabelde RNA zoals beschreven in paragraaf 3 vervangen biotine-HPDP met joodacetyl-biotine en voeren twee chloroformextracties aan overmatige joodacetyl-biotine resten volledig te verwijderen.
  3. Recover gebiotinyleerd RNA door isopropanol / ethanol precipitatie zoals beschreven of met behulp van een kolom-gebaseerde benadering (bijv. RNeasy) bij kleine hoeveelheden RNA (<10 ug) Gebruikt.
  4. Incubeer de Zeta membraan in nuclease-vrij water met rockende gedurende 10 minuten.
  5. Neem het membraan uit de nuclease-vrij water en verwijder overmatig vocht door het plaatsen membraan tussen twee schone papieren handdoeken en stevig te drukken. Lucht-drogen van het membraan gedurende 5 min leidt tot mooier dots.
  6. Voor elk monster bereid 20 pi 200 ng / ul RNA met ijskoud dot blot bindingsbuffer (10 mM NaOH, 1 mM EDTA). Breng 5 ul van deze verdunning (dus 1 ug RNA) en drie verdere 10-voudige verdunningen (bijvoorbeeld 100, 10 en 1 ng RNA respectievelijk) de Zeta membraan door pipetteren. Pipetteren door een leeg rek van pipet tips kunnen worden om gelijkmatig verdeeld afstand bieden. Alternatief, een dot blot apparaat volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Breng 5 ul van de biotine-gelabelde DNA oligo bij concentraties variërend van 20 ng / ul tot 20 pg / pl (ie 100-0,1 ng oligo) als positieve control het membraan door pipetteren. Gebruik een gebiotinyleerd, 4SU-naïeve sample als negatieve controle.
  8. Lucht-drogen van het membraan gedurende 5 minuten.
  9. Incubeer het membraan gedurende 30 minuten in 40 ml blokkeringsbuffer met schommelen.
  10. Incubeer het membraan met 10 ml 1:1000 streptavidine-mierikswortel peroxidase gedurende 15 min. (5 ml PBS + 5 ml 20% SDS + 10 ul streptavidine-mierikswortel peroxidase)
  11. Was tweemaal membraan in 40 ml PBS + 10% SDS (20 ml PBS + 20 ml 20% SDS) gedurende 5 minuten.
  12. Was tweemaal membraan in 40 ml PBS + 1% SDS (38 ml PBS + 2 ml 20% SDS) gedurende 5 minuten.
  13. Was tweemaal membraan in 40 ml PBS + 0,1% SDS (40 ml PBS + 200 ul 20% SDS) gedurende 5 minuten.
  14. Verwijder overmatig vocht door het plaatsen membraan tussen twee schone papieren handdoeken en drukken op hen stevig.
  15. Visualiseer membraangebonden HRP met ECL per instructies van de fabrikant.
  16. Plaats het membraan in plastic folie / zak, verwijdert luchtbellen en incubeer gedurende 2 min in het donker.
  17. Expose membraan naarfilm voor 1-5 minuten.

5. Scheiding van gelabelde of niet gelabelde RNA Met streptavidine beklede magnetische korrels

  1. Heat wasbuffer (3 ml per monster) tot 65 C in een waterbad.
  2. Bereid verse 100 mM dithiothreitol (DTT) in nuclease-free H 2 O. Doen dat door decanteren 15-30 mg DTT poeder in een schone 50 ml Falcon buis geplaatst op de ultrafijne schaal. Weeg en voeg vereiste hoeveelheid nuclease-vrij H2O
  3. Heat gebiotinyleerd RNA monsters tot 65 ° C gedurende 10 min denatureren en onmiddellijk plaats op ijs.
  4. Plaats μMacs kolommen in de magnetische stand. Wij adviseren om niet meer dan 12 monsters tegelijk (6 - 8 monsters zijn optimaal) te verwerken.
  5. Pre-evenwicht Miltenyi zuilen met 1 ml kamertemperatuur wasbuffer. Dit zal ongeveer 15 minuten duren.
  6. Ondertussen, voeg 100 ul van streptavidine kralen 50-100 pl gebiotinyleerd RNA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten met rotatie.
    7. < li> Als een van de kolommen heeft ingeleid aftappen inmiddels kan dit worden vergemakkelijkt door voorzichtig drukken op de top van de kolom met een gehandschoende vinger. Zodra de stroom is begonnen met de kolommen goed leeglopen.
  7. Breng de RNA / beads aan de kolommen. Gooi de doorstroom tenzij je wilt het niet-gemerkte RNA-fractie (zie paragraaf 7) herstellen.
  8. Was driemaal met 0,9 ml 65 ° C wasbuffer (1 ml pipet tips krimpen bij het pipetteren buffers bij 65 ° C).
  9. Spoel driemaal met 0,9 ml kamertemperatuur wasbuffer.
  10. Pipetteer 700 ul Buffer RLT (RNeasy MinElute Cleanup Kit, Qiagen) in nieuwe 2 ml buisjes en leg ze onder de kolommen.
  11. Elueer het nieuw getranscribeerde RNA in de buffer RLT met toevoeging van 100 ul 100 mM DTT aan de kolommen.
  12. Voer een tweede elutie ronde 3 min later in hetzelfde buisje toevoegen van een 100 pi 100 mM DTT.

6. Terugwinning van opnieuw opgeschreven RNA

nhoud "> Ga verder met de RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen) protocol volgens de instructies van de fabrikant. Elute in 25 ul nuclease-free H 2 O. Meet RNA-concentraties met een Nanodrop spectrofotometer. Om de behoefte te ontdooien en opnieuw invriezen RNA voorkomen voordat het indienen aan een high-throughput assay aanbevolen bereiden cDNA direct na de nieuw getranscribeerde RNA gezuiverd. gebruik 2.5 ul van de nieuw getranscribeerde RNA in 20 pi cDNA synthese mix voor cDNA-synthese volgens de instructies van de fabrikant. Voer qRT-PCR controles met 1 : 10 verdunningen van cDNA mengsel WINKEL RNA bij -80 ° C..

7. Herstel van Ongelabelde, geconsolideerd RNA (optioneel)

Indien het ongebonden RNA moet worden hersteld, verzamel en combineren de doorstroming (na toevoeging van het RNA-streptavidineparels oplossing voor de kolommen) en de eerste wasbeurt voor daaropvolgende precipitatie. Gewoonlijk volstaat het om slechts 50% van het ongebonden RNA precipiteren als this zal bevatten> 80% van het uitgangsmateriaal.

  1. Voeg een gelijk volume isopropanol (geen zout toegevoegd moet worden als de wasbuffer bevat reeds 1 M NaCl).
  2. Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Gooi supernatant.
  3. Voeg een gelijk volume van 75% ethanol, centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, gooi supernatant.
  4. Spin kort en verwijder de resterende ethanol met 200 ul pipet.
  5. Spin kort en verwijder de resterende ethanol met 20 ul pipet.
  6. Sta niet toe dat RNA om te drogen. Resuspendeer in 100 pi H2O Meng goed door en neer te pipetteren 5-6 keer. Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 min onder schudden en rechtstreeks over ijs.
  7. Controleer RNA kwaliteit door elektroforetische analyse om RNA degradatie te sluiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

1. Uitgangsmateriaal en verwachte rendementen

Na 1 uur (hr) van 4SU-exposure nieuw getranscribeerde RNA vertegenwoordigt ongeveer 1-4% van de totale cellulaire RNA. Dit zal lager zijn in de groei-gearresteerd cellen als ze niet langer RNA te synthetiseren om rekening te houden voor de celgroei / replicatie. Bij etikettering voor 1 uur, raden wij het starten van de test met 60 - 80 ug totaal RNA. Beginnend met minder dan 30 ug totaal RNA resulteert in kleine RNA pellets die moeilijk te zien na d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Metabole etikettering van nieuw getranscribeerde RNA aanzienlijk versterkt de kracht van high-throughput technologieën zoals microarrays en RNA-seq door meer geschikte templates om de biologische vraag van belang aan te pakken. Het huidige protocol werd na optimalisatie. Het maakt> 1000-voudige verrijking van nieuw getranscribeerde RNA en biedt zeer reproduceerbare resultaten.

Het experimentele ontwerp van een 4SU-tagging experiment is van cruciaal belang als nieuw getranscribeerde RNA za...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Wij willen Amie Regan bedanken voor zorgvuldige lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NGFN Plus subsidie ​​# 01GS0801, MRC fellowship subsidie ​​G1002523 en NHSBT subsidie ​​WP11-05 op LD en DFG subsidie ​​FR2938/1-1 naar CCF

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4-thiouridineCarbosynthT4509Bereid een 50 mM stockoplossing in steriel H2O, bewaar bij -20 °C in aliquots van 50-500 μl, gooi ongebruikt reagens weg, bevries niet opnieuw.
TrizolInvitrogen15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)WAARSCHUWING - CORROSIEF en GEVAARLIJK VOOR DE GEZONDHEID! Zorg voor onmiddellijke toegang tot Fenool antidotum (PEG-Methanol); Bewaar bij 4 °C.
ChloroformSigma372978WAARSCHUWING - GEVAARLIJK VOOR DE GEZONDHEID
IsopropanolSigma650447
Natriumcitraat, nuclease-vrijSigmaC8532Bereid 1,6 M stockoplossing met nuclease-vrij water.
5M nuclease-vrij NaClSigma71386Stockoplossing
Nuclease-vrij H2OSigmaW4502Maak 1 ml aliquots in nuclease-vrije buisjes.
RNA precipitatiebuffer1,2 M NaCl, 0,8 M natriumcitraat in nuclease-vrij water. Bereid van tevoren onder strikt nuclease-vrije omstandigheden. Bewaar bij kamertemperatuur in 50 ml falconbuisjes.
EthanolSigma459844Gebruik met nuclease-vrij water om 80% ethanol te bereiden, bewaar bij -20 °C.
1 M nuclease-vrij Tris Cl, pH 7,5Lonza51237Stockoplossing
500 mM nuclease-vrij EDTA, pH 8,0Invitrogen15575-020Stockoplossing
10x Biotinyleringsbuffer (BB)100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA in nuclease-vrij water, maak 1 ml aliquots.
Dimethylformamide (DMF)SigmaD4551
EZ-Link biotin-HPDPPierce21341Bereid een 1 mg/ml stockoplossing door 50 mg biotin-HPDP op te lossen in 50 ml DMF. Zacht verwarmen bevordert solubilisatie. Bewaar bij 4 °C in 1 ml aliquots.
Phase Lock Gel Heavy tubes 2,0 mlEppendorf0032 005.152Optioneel voor de chloroform extractiestap.
Zeta membraanBIORAD162-0153
10x Dot blot bindingbuffer100 mM NaOH, 10 mM EDTA
Biotin-oligo5'-biotine, 25 nucleotiden, willekeurige sequentie
NatriumdodecylsulfaatFisherBPE9738Voor 100 ml 20% stockoplossing, voeg 20 g SDS toe aan 80 ml PBS pH 7-8 en pas volume aan tot 100 ml. Houd alle hoge percentage SDS oplossingen boven de 20 °C. Verwarm de oplossingen lichtjes als SDS precipiteert.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-BiotinPierce21333Bereid een 1 mg/ml stockoplossing door 50 mg iodoacetyl-biotin op te lossen in 50 ml DMF. Zacht verwarmen bevordert solubilisatie. Bewaar bij 4 °C in 1 ml aliquots. Genereert onomkeerbare, thiool-specifieke biotinylering.
Fosfaatbuffer salineGibco10010-015
Dot blot blokkeringsbufferMeng 20 ml 20% SDS met 20 ml 1 x PBS pH 7-8 en voeg EDTA toe tot de eindconcentratie van 1 mM.
Streptavidine-paardenradijs peroxidase Vector LaboratoriesSA5004Bewaar bij -20 °C. Meng 10 ml 20% SDS met 10 ml 1 x PBS. Voeg 20 μl Streptavidin-HRP toe voor gebruik.
ECL reagensGE HealthcareRNP2109Gebruik volgens de instructies van de fabrikant.
Super RX, X-RA Film, 18x24 cmFujifilm47410 19236
μMacs Streptavidin KitMiltenyi130-074-101Bewaar de kralen bij 4 °C.
Tween 20SigmaP1379
Wasbuffer100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 in nuclease-vrij H2O.
Dithiothreitol (DTT)Sigma43817Bereid als 100 mM DTT in nuclease-vrij H2O, bereid altijd vers voor gebruik.
RNeasy MinElute KitQiagen74204Bewaar kolommen bij 4 °C, resterende componenten van de kit bij kamertemperatuur.
1,5 ml schroefstoppolypropyleenbuisjesSarstedt72.692.005Compatibel met Dimethylformamide
2,0 ml schroefstoppolypropyleenbuisjesSarstedt72.694.005Compatibel met Dimethylformamide
15 ml buisjesBD Falcon352096Compatibel met Dimethylformamide
50 ml buisjesBD Falcon352070Compatibel met Dimethylformamide
Alle oplossingen/reagens moeten bij kamertemperatuur worden bewaard, tenzij anders gespecificeerd.
Apparatuur
UV/VIS spectrofotometerThermo ScientificNanoDrop 1000Of equivalent. Gebruik laag volume (1-2 μl) voor metingen van lage RNA concentraties om overmatige monsterverlies te voorkomen.
Polypropyleen 15 ml centrifugebuisjesVWR International525-0153In tegenstelling tot standaard 15 ml buisjes, tolereren deze tot 15.000 × g
Hogesnel

Referenties

  1. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  2. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  3. Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  4. Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
  5. Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  6. Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
  7. Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115(2009).
  8. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
  9. Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
  10. Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
  11. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
  12. Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
  13. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  14. Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
  15. Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
  16. Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458(2011).
  17. Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371(2010).
  18. Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
  19. Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908(2012).
  20. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
  21. Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
  22. Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

RNA verwerkingRNA afbraak4 thiouridine labelingthiol specifieke biotinyleringstreptavidine magnetische kralenzuivering van nieuw getranscribeerd RNAQ RT PCR analysenext generation sequencing
Metabole Labeling van Nieuw Transcribed RNA voor hoge resolutie genexpressieprofilering van RNA synthese, verwerking en Decay in Cell Culture
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.