Mitochondriën-geassocieerde ER Membranen (eigen MTM) en glycosfingolipiden Verrijkt microdomeinen (GEM): Isolatie van Mouse Brain

Ida Annunziata; Annette Patterson; Alessandra d'Azzo

doi:10.3791/50215

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Mitochondriën-geassocieerde ER Membranen (eigen MTM) en glycosfingolipiden Verrijkt microdomeinen (GEM): Isolatie van Mouse Brain

23.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50215

⸱

4 maart 2013

Ida Annunziata^*¹ , Annette Patterson^*¹ , Alessandra d'Azzo¹

¹Department of Genetics, St Jude Children's Research Hospital

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze procedure laat zien hoe u te isoleren van de volwassen hersenen van muizen de mitochondriën-geassocieerde ER membranen of Mams en de glycosfingolipiden verrijkte microdomain fracties uit Mams en mitochondriale preparaten.

Samenvatting

Intracellulaire organellen zijn zeer dynamische structuren met verschillende vorm en samenstelling, die onderworpen zijn aan celspecifieke intrinsieke en extrinsieke signalen. De membranen zijn vaak naast elkaar op gedefinieerde contact sites die worden hubs voor de uitwisseling van signaalmoleculen en membranen ^1,2,3,4. De inter-organellen membraan microdomeinen die gevormd tussen het endoplasmatisch reticulum (ER) en de mitochondriën in de opening van de IP3-gevoelige Ca ^{2 +} kanaal staan bekend als de mitochondria bijbehorende ER-membranen of ^4,5,6 eigen MTM. Het eiwit / lipiden en biochemische eigenschappen van deze membraan contactplaatsen zijn uitgebreid bestudeerd met name wat betreft hun rol bij het reguleren van intracellulaire ^{Ca2 + 4,5,6.} De ER dient als de primaire opslag van intracellulaire Ca ^{2 +,} en in die hoedanigheid regelt een groot aantal cellulaire processen stroomafwaarts van Ca ^{2 +} signalering, inclUding post-translationele vouwing van eiwitten en eiwit maturation7. Mitochondria, anderzijds, behouden ^{Ca2 +} homeostase, door buffering cytosolische ^{Ca2 +} concentratie waardoor ze de inleiding van apoptotische routes stroomafwaarts van Ca ^{2 + 4,8} onbalans. Het dynamische karakter van de eigen MTM maakt ze ideaal sites te ontleden elementaire cellulaire mechanismen, met inbegrip van Ca ^{2 +} signalisatie en regulatie van mitochondriale Ca ^{2 +} concentratie, lipide biosynthese en het transport-, energie-metabolisme en celoverleving ^{4,9,10,11,12.} Verschillende protocollen zijn beschreven voor de zuivering van deze microdomeinen van leverweefsel en gekweekte cellen ^13,14.

Eerder gepubliceerde werkwijzen waarbij rekening hebben we een aangepast protocol voor de isolatie van mitochondria en eigen MTM van de volwassen muizenhersenen. Deze procedure hebben we een extra zuiveringsstap, namelijk een Triton X100 extractie, dat enables het isolement van de glycosfingolipiden verrijkte microdomain (GEM) fractie van de eigen MTM. Deze preparaten GEM delen verschillende eiwitcomponenten met caveolae en lipide rafts, afkomstig van het plasmamembraan of andere intracellulaire membranen en voorgesteld om als verzamelen punten voor de clustering van receptor eiwitten en eiwit-eiwit interacties ^4,15.

Protocol

Het volgende protocol is bedoeld voor de isolatie en zuivering van Mams en parels van muizenhersenen

Oplossingen die nodig zijn voor Isolatie van mitochondriën, Mams en GEM

Fractionering van ruwe mitochondriale preparaat te verkrijgen:

Oplossing A: 0,32 M sucrose, 1 mM NaHCO _3, 1 mM _MgCl2, 0,5 mM _CaCl2 + proteaseremmers (vers toevoegen indien nodig)

Oplossing B: 0,32 M sucrose, 1 mM NaHCO ₃ + proteaseremmers (vers toevoegen indien nodig)

Eigen MTM Isolatie:

Isolatie Medium: 250 mM Mannitol, 5 mM HEPES pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA

Gradient Buffer: 225 mM Mannitol, 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (eindconcentratie)

GEM Isolatie:

content "> GEM extractiebuffer: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 + proteaseremmers (vers toevoegen indien nodig)

GEM oplosbaar Buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + proteaseremmers (voeg verse, indien nodig).

1. Eerste stap subcellulaire fractionering: Verwijdering van Kernen, niet-gelyseerde cellen en cellulaire puin

Euthanaseren muis in CO ₂ kamer.
Verwijder onmiddellijk hersenen, te halveren, te plaatsen in 2 ml buisjes op ijs en weeg.

Opmerking: Bewaar hersenhelften gescheiden gedurende de gehele procedure. Geldt voor de behandeling van een hersenhelft.

Place half hersenen in een voorgekoeld 2 ml glazen Dounce weefsel molen met 1 ml koude oplossing A. gehomogeniseerd met 15 slagen van een totale grote ruimte stamper.
Naar een 15 ml falcon-buis, op ijs en verdundhomogenaten tot 10 volumes w / v, bijvoorbeeld 0,225 tot 2,25 g ml.
Centrifugeer monster bij 1400 g gedurende 10 min bij 4 ° C.
Verwijder het supernatant overgebracht in een 30 ml rondbodem glazen centrifugebuis, op ijs. Zorg ervoor dat u de pellet te verstoren.
Resuspendeer de pellet in dezelfde 10 volumedelen oplossing A. Homogeniseer in dezelfde molen, met 3-6 slagen van een kleine speling stamper, 1 ml per keer.
Naar een vers 15 ml falcon-buis en centrifugeer bij 710 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Dit resulteert in een pellet van kernen en celafval.
Verwijder voorzichtig het supernatant en het zwembad met de bovenstaande vloeistof opgeslagen in stap 1.6.

2. Tweede stap: Ruwe Mitochondria Isolatie

Centrifugeer supernatanten bij 13.800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
Overdracht supernatant aan een Ultra-Clear Beckman Centrifuge Tube, op ijs
Hersuspendeer pellet in 10 volumes oplossing A. Homogeniseer in dezelfde molen, met 3-6 slagen van een kleine speling stamper, 1 ml per keer.
Centrifuge als stap 2.1.
Herhaal de stappen 2,2-2.4.
De resulterende pellet is een verrijkte mitochondriale fractie. De supernatants (cytosol en ER), dek af met parafilm en blijf op ijs.
Resuspendeer de pellet met 6 slagen van een kleine speling stamper, in 4,8 ml / g (g wordt verwezen naar de oorspronkelijke hersengewicht) oplossing B, in een nieuwe homogenisator.
Gebruik van glazen Pasteur pipetten, stelt een discontinue sucrosegradiënt in een Ultra-Clear Beckman centrifugebuis toevoegen vervolgens naar de bodem van de buis als volgt zorgvuldig, zodat er geen bellen gevormd:
Resupended Pellet (0,32 M sucrose)
3 ml 850 mM Sucrose (in 1 mM NaHCO ₃₎
3 ml 1 M Sucrose (in 1 mM NaHCO ₃₎
3 ml 1,2 M Sucrose (in 1 mM NaHCO3)
Centrifugeer bij 82.500 xg gedurende 2 uur bij 4 ° C. De resulterende scheiding aan het einde van de gradiënt produceert drie banden en een pellet: 1) myeline en andere membraan verontreinigingen (0,32 M - 0,85 M interface), 2) ER, Golgi, plasmamembranen (0,85 M - 1 M interface); 3) synaptosomen (1 M - 1,2 M interface); 4) mitochondria ruwe (pellet) die wordt gebruikt voor de daaropvolgende zuiveringsstappen

3. Isolatie van mitochondriën-geassocieerde ER membraan, eigen MTM

Resuspendeer de vers geïsoleerde ruwe mitochondriën van de ene hersenhelft, in 2 ml isolatiemedium voorzien van vers toegevoegde protease remmers.
Bereid een 30% Percoll verloop met Gradient Buffer 8 ml per half hersenen, en plaats in een Ultra-Clear Beckman centrifugebuis.

* Opmerking: Zorg gradiëntbuffer meer geconcentreerd (1,43 keer) om de juiste uiteindelijke concentratie na d te bereikeniluting Percoll tot 30%.

Layer mitochondriale schorsing op de top van bereide gradiënt LANGZAAM om luchtbelletjes te voorkomen.
Centrifugeer bij 95.000 xg gedurende 30 min, 4 ° C.
1. Verwijder de zware fractie (onderste band) eerst met een glazen Pasteur pipet en over te dragen aan een nieuwe ronde bodem glazen buis, op ijs.
2. Verwijder de lichte fractie (bovenste band) TWEEDE met een ander glas Pasteur pipet en over te dragen aan een aparte nieuwe ronde bodem glazen buis, op ijs.
Verdun beide fracties in stap 3.5 met 10 ml isolatiemedium en centrifugeer bij 6300 g gedurende 10 min bij 4 ° C.
Verwijder het supernatant van de zware fractie verkregen in stap 3.6, resuspendeer de pellet met nog eens 10 ml isolatiemedium en centrifugeer weer als punt 3.6. De resulterende pellet wordt het pure mitochondriale fractie zijn.
Decanteer het supernatans van het Licht Fractie verkregen in stap 3.6 tot een Ultra-Clear Beckman Centrifuge Tube, op ijs. Gooi de pellet.
Voeg voldoende isolatiemedium de supernatant verkregen in stap 3.8 de buis en centrifugeer bij 100.000 xg gedurende 1 uur vullen, 4 ° C. De resulterende pellet wordt de eigen MTM fractie zijn. Verwijder voorzichtig en gooi het supernatant.

Let op: Bij deze stap, kunt u ook bij 100.000 xg gecentrifugeerd gedurende 1 uur, 4 ° C het supernatant opgeslagen bij stap 2.6. De pellet wordt het ER fractie zijn en de cytosolische fractie supernatant.

4. Extractie van glycosfingolipiden-verrijkt microdomeinen, GEM

Lyse pure mitochondria en / of MAM fracties in 500 ul-1 ml extractiebuffer gedurende 20 minuten op ijs.
Centrifugeer lysaten bij 15.300 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
Verzamel supernatanten (Triton X-100 oplosbaar materiaal) en re-centrifuge pelletsgedurende 2 minuten om de nog oplosbaar materiaal. (Triton X-100 geëxtraheerd Mitochondria en / of Triton X-100 geëxtraheerd eigen MTM).
Oplosbaar pellets in het oplosbaar maken Buffer. Dit oplosbaar materiaal vertegenwoordigt de GEM fracties en kan worden gebruikt voor verdere analyse.