Snelle Colorimetrische Testen om kwalitatief onderscheid RNA en DNA in Biomoleculaire Monsters

Samenvatting

Een reeks colorimetrische testen beschreven voor het snel onderscheiden eiwitten, RNA, DNA, en opnieuw in ducing suikers mogelijk heterogene biomoleculaire monsters.

Samenvatting

Biochemische experimenten vereist doorgaans nauwkeurige kennis in een vroeg stadium van het nucleïnezuur, eiwit en andere biomoleculaire componenten mogelijk heterogene monsters. Nucleïnezuren kan worden gedetecteerd via verscheidene erkende benaderingen, waaronder analysemethoden die spectrofotometrische (bijvoorbeeld A _260), fluorometrische (bijvoorbeeld binding van fluorescerende kleurstoffen) of colorimetrische (nucleoside-specifieke chromogene chemische reacties). ^Een Hoewel het niet gemakkelijk onderscheiden RNA uit DNA, de A ₂₆₀ / A ₂₈₀ verhouding wordt meestal gebruikt, omdat het een eenvoudige en snelle ² evaluatie van de relatieve gehalte aan nucleïnezuur dat voornamelijk absorbeert nabij 260 nm en eiwitten, die absorbeert vooral nabij 280 nm. Ratio <0,8 worden als indicatie 'pure' eiwit specimens, terwijl zuivere nucleïnezuur (NA) wordt gekenmerkt door verhoudingen> 1,5 ^3.

However zijn er nog gevallen waarin het eiwit / NA inhoud kan niet zo duidelijk of betrouwbaar afgeleid van eenvoudige UV-VIS spectrofotometrische metingen. Bijvoorbeeld (i) monsters kunnen een of meer eiwitten die relatief vrij van de aromatische aminozuren die verantwoordelijk zijn voor absorptie bij ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe), zoals het geval is met enkele kleine RNA-bindende eiwitten en (ii) monsters vertonen tussenproduct A ₂₆₀ / A ₂₈₀ verhoudingen (~ 0.8 <~ 1.5), waarbij het ​​eiwit / NA inhoud veel minder duidelijk en zelfs tijdens een hoge affiniteit associatie tussen het eiwit en NA componenten. Voor dergelijke situaties beschrijven we hierin een reeks colorimetrische testen snel onderscheiden RNA, DNA en reducerende suikers in een potentieel mengmonster van biomoleculen. De methoden steunen op het verschil in gevoeligheid van pentosen en andere koolhydraten Benedictus, Bial's (orcinol), en Dische's (difenylamine) reagentia, de gestroomlijnde protocollen kan comafgerond in enkele minuten, zonder extra stappen van het moeten de componenten isoleren. De assays kunnen worden uitgevoerd in parallel te maken tussen RNA en DNA, en de aanwezigheid van vrije reducerende suikers zoals glucose, fructose, en ribose (figuur 1).

Inleiding

Veel van celbiologie gebeurt via moleculaire interacties van DNA en RNA. ⁴ Deze natuurlijk voorkomende nucleïnezuren (NA) met elkaar, ⁵ eiwitten, ⁶ en met een groot aantal kleine molecule verbindingen en liganden in vivo (bijvoorbeeld tweewaardige kationen ^7). De interacties kan van korte of lange duur (kinetisch), kan variëren van hoog tot matig tot lage affiniteit (thermodynamische sterkte), en kan aanzienlijke variatie vertonen ook in chemische eigenschappen en specificiteit - sommige verenigingen zijn vrij specifiek (bv DNA · · · transcriptiefactoren, RNA · · · splicing factoren), terwijl andere interacties zijn noodzakelijkerwijs veel meer generiek (bv DNA · · · bacteriële histon-achtige HU eiwitten ^8). Niet-specifieke interacties met NAS kan praktische gevolgen hebben voor in-vitro-experimenten met mengsels van biomolecules, aangezien het mogelijk en zelfs waarschijnlijk dat sommige NAs zal associëren met biomoleculen plaats, althans onder een deel van de experimentele omstandigheden gebruikt (ionsterkte, pH, enz.).

Beschouw bijvoorbeeld de productie van een eiwit van interesse (POI) via heterologe over-expressie van het recombinant eiwit in Escherichia coli celcultuur; dergelijke procedure wordt routinematig uitgevoerd in vrijwel elke structurele biologie lab ⁹ In voorbereiding op verdere experimenten dergelijke. als biochemische / biofysische karakterisering, kristallisatie, enz. eerste pogingen algemeen gericht op het verkrijgen van een voldoende hoeveelheid van de POI in zo zuiver mogelijke vorm, idealiter als een chemisch homogene en biofysisch monodisperse specimen. Na onderbreking van de gastheercellen, de vroege stadia van een typische zuivering workflow doel de POI isoleren van E. coli eiwitten, nucleïnezuren, celwand puinen andere onderdelen van het cellulaire lysaat. Echter, gastheer NA kan samenwerken zuiveren met de POI voor verschillende fysisch-chemische redenen - een zeer basic POI kan niet-specifiek pull-down gastheer DNA / RNA, de POI kan een generieke NA-bindende activiteit (bijvoorbeeld de eerder genoemde HU); de POI kan een vrij specifieke NA-bindingseiwit maar vertonen kruisreactiviteit met gastheer RNA of DNA zijn; ontvangende NA kan interageren met een chromatografiematrix en daardoor eenvoudig co-elueren met de POI, enzovoort. Willekeurige, hoge affiniteit binden van gastheer NA naar een POI kan vormen een vervelend probleem, omdat de NA onzuiverheden zal waarschijnlijk interfereren met downstream-experimenten (bijv. fluorescentie anisotropie testen van POI • RNA binding ^10). U kunt ook onverwachte POI · · · NA verenigingen kunnen ook toevallig worden bekeken, als dergelijke interacties verlichten de POI's nucleïnezuur-bindend vermogen. Hoe dan ook, of NA zijn belangrijke componenten of verontreinigingen, moet men eerst kwantificeren enidentificeren type (DNA, RNA) van co-zuivering NAs in voorbereiding downstream experimenten.

Aantal analysemethoden aanwezig voor het detecteren en kwantificeren NAs in een monster. De meeste beschikbare methoden fundamenteel of spectrofotometrische (bijvoorbeeld A ₂₆₀ absorptiewaarden en A ₂₆₀ / A ₂₈₀ verhoudingen), fluorometrische (bijvoorbeeld binding van thiazool oranje of andere fluorescerende kleurstoffen NA) of colorimetrische (gevoeligheid van nucleosiden om chemische reacties dit rendement chromoforen absorberen in het UV-VIS gebied van het elektromagnetische spectrum), zoals onlangs beschreven door De Mey et al. ^1. echter de cruciale stap van het identificeren van het type polynucleotide RNA of DNA valt buiten het bestek van veel van deze kwantificering benaderingen. Hier geven we een reeks colorimetrische testen snel de soorten NA componenten identificeren in een eiwit monster.

De protocollen die hier beschreven ceen efficiënt worden uitgevoerd zonder extra stappen van het isoleren mogelijke NA onzuiverheden en afhankelijk assay Benedict voor reducerende suikers ¹¹ de orcinol assay voor pentoses ^{12,13, 14,15} en difenylamine reacties van 2'-deoxypentoses (figuren 1 en 2) . De Benedict's test (figuur 2a) gebruikt het vermogen van de lineaire, open keten (aldehyde) vorm van een aldose suiker Cu ² verlagen ^+, met gelijktijdige oxidatie van carbonyl de suiker om een carboxylaat groep en productie van Cu ₂ O als onoplosbare rood neerslag. Deze reactie positief testen vrije reducerende suikers zoals aldoses en ketoses (die converteren naar de overeenkomstige aldosen via enediol tussenproducten), maar niet met pentose suikers die zijn opgesloten in cyclische vorm als deel van het covalente ruggengraat van een DNA of RNA polynucleotide. Door de minimalistische vereiste van een vrije hemiacetal functionaliteit andere compounds die kunnen positief testen bij deze assay - en dus als potentieel interfererende - onder α-hydroxy-ketonen en korte oligosaccharides (bijvoorbeeld de disaccharide maltose). Zowel de Bial de orcinol (Figuur 2b) en Dische de difenylamine (figuur 2c) reacties zijn gebaseerd op initiële vernietiging van de polynucleotide backbone, via depurinering van de nucleoside en verder zuur of base gekatalyseerde hydrolyse van de ouder nucleotiden aan furan-2 oplevert -carbaldehyde (furfural) derivaten, die derivaten vervolgens reageren met ofwel een polyhydroxy fenol zoals orcinol (Bial's) of difenylamine (Dische's) reagentia gekleurde condensatieproducten van veelal onbekende chemische structuur. De DNA versus RNA specificiteit van de assay Dische komt voort uit het feit dat de pentose suiker moet 2'-zuurstofarme om gevoelig voor oxidatie zijn om ω-hydroxylevulinyl aldehyde, die verder reageert met difenylamineonder zure omstandigheden om een heldere blauwe condensaat (2c figuur) op te leveren. Met de gestroomlijnde protocollen beschreven, hebben we gevonden dat deze suiker-specifieke colorimetrische reacties kunnen maken tussen RNA en DNA, en ook de aanwezigheid van vrije reducerende suikers zoals glucose, fructose, ribose of in een biomoleculaire monster.

Protocol

1. Benedictus Test voor reducerende suikers

1. Bereid een hoeveelheid reagens Benedict's - 940 mM watervrij natriumcarbonaat, 588 mM natriumcitraat dihydraat, 68 mM koper (II) sulfaat pentahydraat. Dit reagens kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur (RT) gedurende ten minste zes maanden geen merkbare reactiviteit.
2. De bovenstaande reagens is 6x. Zo 600 pi reacties, 100 pi reagens Benedict om een schone 1,5 ml microcentrifugebuis (bijvoorbeeld Eppendorf merk) per monster worden getest.
3. Voeg tussen de 10 pl tot 500 pl monster deze buis de optimale volume kan worden bepaald gebaseerd op de intensiteit van kleurvorming in een eerste proef run. Indien voldoende monster beschikbaar is, begint deze proeven op de maximaal mogelijke monstervolume (dwz vijfzesde van het totale reactievolume 500 pl monster in dit geval) en verdun vervolgens in volgende assays.
4. Voeg ddH ₂ O aan de tuzijn voor de definitieve volume tot 600 pi, de oplossing te mengen door vortexen of pipetteren.
5. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten in een kokend waterbad.
6. Verwijder de verwarmde monster uit het bad en laat hem bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten afkoelen.
7. Centrifugeer het monster buis> 9300 xg (~ 10.000 rpm in een FA45-24-11 Eppendorf vaste hoek rotor) gedurende 5 minuten om sediment elk deeltjesvormig materiaal, deze stap is belangrijker voor kwantitatief, geen kwalitatief studies.
8. Aliquot het supernatans van deze buis in een schone cuvet.
9. Blanco de UV-VIS spectrofotometer met water.
10. Meet de absorptie van deze monster bij 475 nm.

2. Orcinol assay voor microbiële pentosesuikers

1. Bereid een geschikte hoeveelheid reagens verse Bial's - 24,2 mM orcinol monohydraat (zie figuur 2b de structuur van deze verbinding), 6 M HCl, 0,025% w / v ferrichloride-hexahydraat. Opmerking:Voor langdurige opslag kan de Bial reagens worden bereid als twee afzonderlijke voorraadoplossingen: (i) Reagent A [0,05% w / v FeCl3 • 6H ₂ O in geconcentreerd HCl] en (ii) Reagent B [422 mM orcinol monohydraat bereid in 95 % ethanol]. Een reagens kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende zes maanden Reagent B kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een maand, bedekt met folie om blootstelling aan licht te beperken. Deze voorraadoplossingen worden gemengd in een 15 (A): 1 (B) v / v-verhouding voor gebruik.
2. De bovenstaande reagens is 2x. Zo 1,0 ml reacties, voeg 500 pi reagens Bial om een ​​schone 1,5 ml microcentrifugebuisje, per monster worden getest.
3. Voeg tussen de 10 pl tot 500 pl monster deze buis. Volgens nota 1,3 (hierboven), indien voldoende monster beschikbaar is, begint het proces reacties met de maximaal mogelijke monstervolume (dwz, de helft van de totale reactievolume 500 pl monster in dit geval) en verdun vanaf daar.
4. Voeg ddH ₂ O om de buis te brengen de fspronkelijke volume tot 1,0 ml; Meng door vortexen of pipetteren.
5. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten in een kokend waterbad.
6. Verwijder de verwarmde monster uit het bad en laat hem bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten afkoelen.
7. Centrifugeer het monster buis> 9300 xg (~ 10.000 rpm in een FA45-24-11 Eppendorf vaste hoek rotor) gedurende 5 minuten om sediment elk deeltjesvormig materiaal, deze stap is belangrijker voor kwantitatief, geen kwalitatief studies.
8. Aliquot het supernatant van deze buis een schone cuvet voor visuele inspectie.
9. Voor semi-kwantitatieve analyse, de blanco UV-VIS spectrofotometer met water en meet de absorptie van de cuvette monster bij 660 nm.

3. Dische's Difenylamine Assay voor 2'-deoxypentose Sugars

1. Bereid een hoeveelheid Dische's difenylamine reagens - 60 mM difenylamine, 11 M ijsazijn, 179 mM zwavelzuur, 62% v / v ethanol. Dit reagens kan voorafvergeleken vooraf opgeslagen bij kamertemperatuur in een donkere container, of bedekt met folie, om blootstelling aan licht te beperken. Vanwege de lichtgevoeligheid reagens niet onbeperkt worden opgeslagen, maar in de praktijk kan worden bereid elke twee tot drie maanden geen duidelijk verschil in reactiviteit.
2. De bovenstaande reagens is 2x. Zo 1,0 ml reacties, voeg 500 pi reagens Dische om een ​​schone 1,5 ml microcentrifugebuisje, per monster worden getest.
3. Voeg tussen de 10 pl tot 500 pl monster deze buis. Volgens nota 1,3 (hierboven), indien voldoende monster beschikbaar is, begint het proces reacties met de maximaal mogelijke monstervolume (dwz, de helft van de totale reactievolume 500 pl monster in dit geval) en verdun vanaf daar.
4. Voeg ddH ₂ O de buis om het eindvolume tot 1,0 ml te brengen; Meng door vortexen of pipetteren.
5. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten in een kokend waterbad.
6. Verwijder de verwarmde monster uit het bad en allow aan afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
7. Centrifugeer het monster buis> 9300 xg (~ 10.000 rpm in een FA45-24-11 Eppendorf vaste hoek rotor) gedurende 5 minuten om sediment elk deeltjesvormig materiaal, deze stap is belangrijker voor kwantitatief, geen kwalitatief studies.
8. Aliquot het supernatant van deze buis een schone cuvet voor visuele inspectie.
9. Voor semi-kwantitatieve analyse, de blanco UV-VIS spectrofotometer met water en meet de absorptie van de cuvette monster bij 600 nm.

4. Verdere Gebruik Notes

1. De volgende klassen van moleculen zijn geschikt referentieverbindingen voor positieve en negatieve controle reacties voor elke assay:
   • Benedict's - Positieve = gratis ribose, fructose, glucose, Negatieve = RNA, DNA, ATP, etc. (Elke saccharide ontbreekt een gratis reducerende suiker functionaliteit)
   • Bial's - Positieve = RNA (bijvoorbeeld bakkersgist extract), ribose, ATP, UMP; Negatieve = runderen serum albumine (BSA) of andere eiwitten
   • Dische's - Positieve = DNA (bv. kalf thymus); Negatieve = RNA, ATP, etc. (Niet-2'-nucleotide deoxygenated)
2. Deze testen zijn gevonden redelijk veerkrachtig verbindingen vaak gebruikt bij eiwitzuivering, bijvoorbeeld, vaak zouten zoals NaCl, _{(NH4) 2 SO4} en K ₂ SO ₄ niet verstoren, en de reacties treden gewoonlijk ongevoelig de inhoud van het verdunningsmiddel. Detergenten of chaotropische middelen, zoals ureum kunnen de reactiviteit van de assays als de pH zeer basisch, neutraal tot zure pH is in het algemeen optimaal voor Bial en Dische de assays door de onderliggende reactiechemie (zie de tekst en de protonen in figuur 2b, c). Potentieel suboptimale reactie-omstandigheden, verdachte interfererende, enz. moeten worden getest op een case-by-case basis, met behulp van positieve en negatieve controle-experimenten wet referentieverbindingen.

Resultaten

Resultaten worden getoond in figuur 3 voor toepassing van deze colorimetrische testen bekende referentieverbindingen. Representatieve kwalitatieve gegevens weergegeven voor de Benedict's (a), orcinol (b) Bial, en Dische de difenylamine (c) assays en standaard curves voor deze drie assays worden getoond in Figuur 4. In panelen 3 (ac), de linker panelen tonen positieve / negatieve controle experimenten met geschikte reactieve / reactief analyten; deze visuele resultaten worden getoond...

Discussie

De colorimetrische testen hier gepresenteerde bieden een eenvoudige benadering snel de chemische aard van biomoleculaire mengsels, zoals worden aangetroffen bij het zuiveren van eiwitten, RNA's of complexen van gehele cellysaat in voorbereiding op verdere studies. Als structurele biologie streeft meer native-achtige samenstellingen, geleidelijk grotere uitdagingen, zoals de voorbeelden heterogeniteit, zullen worden als gevolg van de ingewikkelde en multi-component complexen. Supramoleculaire samenstellingen zi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens of uitrusting	Leverancier / bedrijf	Catalogusnummer	Reacties, notities
Watervrij natriumcarbonaat	Fisher Scientific	S263
Natriumcitraatdihydraat	Sigma	S-4641
Koper (II) sulfaat pentahydraat	VWR	VW3312-2
Orcinol monohydraat	Sigma-Aldrich	O1875
Geconcentreerd HCl	VWR	BDH3030
Ferrichloride hexahydraat	Sigma	F-2877
Difenylamine	Aldrich	112763
IJsazijn	Fisher Scientific	A28
Zwavelzuur	Sigma-Aldrich	258105
Ethanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep bij 1% w / v in H 2 O
Ribonucleïnezuur van bakkersgist (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep Bij 10 mg / ml in H 2 O, bij -20 ° C
Desoxyribonucleïnezuur (natriumzout), van kalf thymus	Sigma	D1501	prep Bij 10 mg / ml in H 2 O; bewaar bij 4 ° C
			Reagentia, apparatuur en Veiligheid Materialen worden vermeld in de following tafel in de volgorde waarin ze in het protocol sectie. Tenzij anders vermeld (hierboven) kunnen alle reagentia worden bewaard bij kamertemperatuur en verlichting. Voor alle items die niet hieronder (bijv. microcentrifugebuisjes), kunnen de gebruikelijke merk / model / variatie gevonden in een standaard biochemische laboratorium worden gebruikt (bijvoorbeeld Eppendorf merk 1,5 ml microfugebuizen). Standaard plastic micro-centrifugebuisjes worden gebruikt gepaard gaat centrifugeren (bijvoorbeeld om sediment deeltjesmateriaal het einde van elk protocol). Geen bijzondere materiaal de voorkeur, zolang de buizen worden afgedicht, de typische polypropyleenbuisjes in biochemie laboratoria werken goed. In termen van bezorgdheid over de veiligheid en afvalverwerking, dient de standaard laboratorium voorzorgsmaatregelen (veiligheidsbril, zuurkasten) worden uitgeoefend in het voorbereiden, het werken met en voor de verwijdering van de oplossingen die geconcentreerd azijnzuur, zoutzuur of zwavelzuur. Voor organische reagentia zoals orcinol of diphenylamine, nitril handschoenen zijn te verkiezen boven de gemeenschappelijke latex (natuurrubber) variëteit.