Non-gerichte metabolietprofilering door ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. Dit artikel schetst een typische werkstroom die wordt gebruikt voor non-gerichte metabolietprofilering van serum, inclusief monsterorganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, data-analyse, kwaliteitscontrole en metabolietidentificatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Non-doelgerichte metabolietprofilering door ultra performante vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. De aanpak biedt een onbevooroordeelde en diepgaande analyse die de ontwikkeling van diagnostische tests, nieuwe therapieën en een betere begrip van ziekteprocessen kan mogelijk maken. De inherente chemische diversiteit van het metabool veroorzaakt aanzienlijke analytische uitdagingen en er is geen enkele experimentele aanpak die alle metabolieten kan detecteren. Bovendien vereist de biologische variatie in individueel metabolisme en de afhankelijkheid van metabolisme van omgevingsfactoren grote steekproeven om het juiste statistische vermogen te bereiken dat nodig is voor zinvolle biologische interpretatie. Om deze uitdagingen aan te pakken, beschrijft deze tutorial een analytische workflow voor grootschalige non-doelgerichte metabolietprofilering van serum door UPLC-MS. De procedure omvat richtlijnen voor steekproeforganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, kwaliteitscontrole en metabolietenidentificatie en zal betrouwbare dataverwerving voor grote experimenten mogelijk maken en een startpunt bieden voor laboratoria die nieuw zijn in non-doelgerichte metabolietprofilering door UPLC-MS.
Inleiding
De termijn "metabolomics" kan veel dingen omvatten. Bijvoorbeeld, een metabolomics experiment kan worden uitgevoerd met behulp van een verscheidenheid aan analytische platforms zoals NMR en zowel gas- als vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie. Bovendien kunnen metabolomics experimenten op een gerichte of niet-gerichte manier worden uitgevoerd, of een combinatie van beide. Een gericht metabolomics experiment zal een gerichte analyse van een panel van moleculen omvatten die belangrijk zijn voor de biologische vraag die ter hand is (bijv. kleine moleculen die betrokken zijn bij de TCA-cyclus zal een nauwkeurige kwantificering van die route mogelijk maken). In deze situatie bepaalt de biologische hypothese de keuze van metabolieten die in de analyse worden gericht en worden de analytische stappen geoptimaliseerd voor de detectie van deze moleculen. Alternatief, een niet-gericht metabolomics experiment genereert hypothesen. In dit geval wordt het experiment op een brede en onbevooroordeelde manier uitgevoerd om de detectie van zoveel mogelijk metabolieten mogelijk te maken. De resultaten van een niet-gericht experiment zullen de volgende stap van het onderzoek aanjagen (wat in veel gevallen een gericht metabolomics werkstroom kan omvatten). Het is ook mogelijk om de twee benaderingen te combineren, in welk geval een experiment op een niet-gerichte manier wordt uitgevoerd terwijl gelijktijdig een panel van bekende moleculen binnen de gegevens wordt gemonitord.
De tutorial die hier wordt gepresenteerd is specifiek gericht op niet-gericht metaboliet profiel van serum. Zoals hierboven beschreven, biedt de niet-gerichte aanpak een onbevooroordeelde weergave van de detecteerbare metabolieten, kan grote hoeveelheden informatie genereren en uiteindelijk nieuwe ontdekkingen mogelijk maken. Het gebruik van deze aanpak, specifiek het gebruik van ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS), wordt wijdverspreid 1, 2, 3 en omvat de volgende stappen: (1) experimenteel ontwerp (2) monsterverzameling (3) monstervoorbereiding (4) data-acquisitie door UPLC-MS (5) data voorverwerking (piekdetectie, integratie, uitlijning en normalisatie) (6) statistische data-analyse (zowel uni- als multivariate) (7) metabolietidentificatie en (8) biologische interpretatie.
Momenteel zijn er geen gevestigde standaardmethoden voor UPLC-MS gebaseerde niet-gerichte metaboliet profiel en daaropvolgende data voorverwerkingsstappen. Dit gebrek aan standaardisatie is deels te wijten aan een van de belangrijkste analytische uitdagingen van metaboliet profiel; de chemische diversiteit van het metaboloom. Vanwege deze diversiteit is het onmogelijk voor een enkele extractiemethode of massaspectrometrie acquisitiemethode om een uitgebreide dekking van alle metabolieten in een enkele analyse te bieden. In concept kan metabolietdekking worden gemaximaliseerd door het gebruik van meerdere extracties (bijv. waterig, methanol, chloroform: methanol, etc.) gekoppeld aan verschillende chromatografische condities (bijv. omgekeerde fase, HILIC, etc.) en verschillende ionisatiemodi (bijv. positieve ion, negatieve ion, chemische ionisatie, etc.). Vaak hebben onderzoekers echter geen vooraf bepaalde voorkeur voor een specifieke chemische klasse en dus is de kosten van het uitvoeren van meerdere extracties en instrumentacquisities niet gerechtvaardigd, vooral voor grootschalige experimenten. Daarom werd de video tutorial die hier wordt gepresenteerd ontworpen om een algemene procedure te bieden voor grootschalige niet-gerichte metaboliet profiel van serum door UPLC-MS. Het zal nieuwe en gevestigde laboratoria in staat stellen om deze soorten experimenten uit te voeren en de bouwstenen waarop ze de aanpak kunnen uitbreiden voor verschillende monstersoorten, specifieke chemische klassen of gerichte analyse. Concreet zal dit protocol de volgende stappen omvatten: serum monstervoorbereiding, monsterorganisatie voor grootschalige studies, UPLC-MS data-acquisitie, kwaliteitscontrole (QC) procedures en metabolietidentificatie. Strategieën voor data voorverwerking en statistische analyse worden ook gepresenteerd.
Het protocol zal zich niet richten op de stappen van experimenteel ontwerp, monsterverzameling of biologische data-interpretatie, aangezien dit buiten het bereik van deze tutorial valt. Er bestaan echter veel bronnen in de literatuur voor deze onderwerpen en de auteurs moedigen onderzoekers die nieuw zijn in metabolomics aan om deze grondig te onderzoeken 4, 5, 6, 7, 8, 9. In het bijzonder is experimenteel ontwerp uiterst belangrijk en is cruciaal voor het succes van een niet-gericht metabolomics experiment. Factoren zoals geschikte biologische replicatie en consistentie in monsterverzameling procedure (bijv. tijd op de werkbank, opslagtemperatuur, opslagtijd, invries-ontdooi-cycli, etc.) moeten worden overwogen om een levensvatbaar onderzoek te garanderen en om een gepaste biologische interpretatie van de gegevens mogelijk te maken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Sample Organisatie
- Om een platenplattegrond voor monstervoorbereiding op een spreadsheet te maken, voer in de eerste kolom een monsterlijst in volgorde van laden. In een tweede kolom voer de locaties van de 96-well platen in met de juiste nomenclatuur voor uw autosamplersoftware.
- Bewaar één well in elke plaat voor QC-monsters.
- Als uw LC-autosampler twee platen tegelijk kan verwerken, verdeel de monsterlijst in batches van 190 en bewaar deze informatie in een tweede werkblad.
- Gebruik binnen elk van deze batches de randomisatiefunctie [opmerking: "=rand()" in Excel] om de injectievolgorde te randomiseren. Kopieer en plak nu uw injectievolgorde in het LC-MS monsterwachtrijsoftwaresysteem. Randomisatie moet plaatsvinden tussen batches, binnen batches en moet uniek zijn over injectiereplica's.
2. Serum en kwaliteitscontrole (QC) monstervoorbereidingsprocedures
- Bereid een 10 ml stamoplossing van QC-monster voor met minimaal vier verbindingen van bekende massa en retentietijden die de chromatografische elutie van het experiment overspannen. (opmerking: cafeïne, reserpine, sulfadimethoxine en terfenadine met een concentratie van 2 μg/ml elk).
- Ontdooi de serummonsters op ijs en vortex voorzichtig gedurende ~5 sec.
- Voorbehandel de punten van een 12-kanaals pipettor met methanol om tip-dripping tijdens het doseren van monsters te voorkomen. Voeg vervolgens 370 μl koude methanol toe aan elk well van een 96-well plaat.
- Breng 100 μl van elk monster over naar de overeenkomstige platenlocatie van de platenplattegronden. Dek de platen af en incubeer gedurende 30 min bij -80 °C om de eiwitten te bezinken.
- Centrifugeer de platen in een 4 °C centrifuge bij 3.200 x g gedurende 30 min. Breng 250 μl supernatant over naar een nieuwe 96-well en herhaal de centrifugatie.
- Breng nu 60 μl aliquoten van het supernatant over naar drie 96-well platen die geschikt zijn voor de UPLC of LC-autosampler.
- Voeg 100 μl QC-monstermix toe aan de gereserveerde wellpositie op de plaat.
- Versluit elke plaat met een kleeffolie. Oplosmiddel kan snel verdampen nadat de well is geprikt, en daarom moeten injecties alleen worden uitgevoerd vanaf elke plaat. Platen in de monsterwachtrij kunnen op korte termijn worden bewaard bij -20 °C.
3. UPLC-MS Dataverwerving
- Stel de autosampler in op 4 °C en plaats de eerste twee platen in de autosampler.
- Stel de verwervingsmethode in met behulp van een van de twee alternatieve reverse phase gradiënten. Gradient A is gericht op niet-polaire moleculen terwijl gradient B een betere dekking zal bieden van matig polaire moleculen.
- Gradient A:
Tijd (min) %A %B curve 0.0 100 0 0.1 100 0 6 1.0 60 40 6 3.0 30 70 6 11.0 0 100 6 17.0 0 100 6 17.1 100 0 6 23.0 100 0 6 - Gradient B
Tijd (min) %A %B curve 0.0 100 0 1 100 0 6 13 5 95 6 16 5 95 6 16.05 100 0 6 20 100 0 6
- Gradient A:
- Stel de massaspectrometer in om gegevens te verzamelen in positieve modus met scannen van 50-1.200 m/z. Aanvullende specifieke instrumentcondities variëren afhankelijk van het gebruikte systeem. Het volgende vertegenwoordigt de condities die worden gebruikt op onze Waters Xevo G2 Q-TOF massaspectrometer: Collision Energy = 6V; Scan Time = 0,2 sec per scan; Capillary Voltage = 2.200 V; Source Temperature = 150 °C Desolvation Temperature = 350 °C Desolvation Gas Flow (N2) = 800 L/hr).
- Injecteer de QC-monsters vijf keer aan het begin van elke batch van twee platen monsters. Na het conditioneren van het UPLC-MS systeem met de eerste twee injecties, controleer de piekgebied (<25% RSD), retentietijden (+/- 0,05 min) en massanauwkeurigheid (+/- 3 ppm) van de derde tot en met de vijfde injecties. Deze parameters kunnen moeten worden aangepast om te passen bij de specificaties van het instrument dat wordt gebruikt voor dataverwerving.
- Als QC-monsters slagen, verzamel gegevens over serummonsters voor die twee platen. Als QC-monsters mislukken, wordt monstersgegevens niet verzameld totdat het probleem is opgelost en de QC-monsters zijn geslaagd. In ons laboratorium hebben we gevonden dat deze parameters constant stabiel zijn
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De basisstappen voor de analyse van een niet-doelgerichte metabolietprofilering via UPLC-MS worden schetsmatig weergegeven in Figuur 1. De ruwe gegevens voor elk monster kunnen worden gevisualiseerd als een base peak-chromatogram. Figuur 2 toont een voorbeeld van een base peak-chromatogram van een serummonster dat is geanalyseerd met gradiëntoptie (a) in de handleiding. Na de hierboven beschreven statistische analyse wordt geprobeerd de metabolieten te identificeren voor alle statistisch...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze tutorial dient als startpunt voor het uitvoeren van grootschalige niet-gerichte metabolietprofilering door UPLC-MS. De workflow is gericht op metabolieten die kunnen worden geëxtraheerd met een waterige methanoloplosmiddel, vastgehouden op een C8 of C18 UPLC-kolom en gedetecteerd als positieve ionen. In de situatie waar er geen vooraf bepaalde voorkeur is voor een specifieke metabolietenklasse en een hypothese genererend globaal profiel gewenst is, is dit protocol waardevol omdat het zal resulteren in de detectie va...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De gepresenteerde tutorial werd uitgevoerd en ontwikkeld binnen de Proteomics and Metabolomics Facility aan de Colorado State University, die gedeeltelijk wordt gefinancierd door de CSU Research Administration Resources for Scholarly Projects.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96 well plates - 500 μl wells | VWR | 40002-020 | Deze worden gebruikt voor monstervoorbereiding |
| 96 well plate mats | VWR | 89026-514 | Deze worden gebruikt voor monstervoorbereiding |
| 96 well plates - 350 μl wells | Waters Corporation | WAT058943 | Deze worden gebruikt voor monsterinjectie |
| 96 well plate mats | Waters Corporation | 186000857 | Deze worden gebruikt voor monsterinjectie |
| 96 well plate heat seals | Waters Corporation | 186002789 | Deze kunnen worden gebruikt voor monsterinjectie of langetermijnopslag |
| 96 well plate heat sealer | Waters Corporation | 186002786 | |
| LC-MS grade methanol | Fluka | 34966 | |
| LC-MS grade acetonitrile | Fluka | 34967 | |
| LC-MS grade aater | Fluka | 39253 | |
| LC-MS grade formic acid | Fluka | 56302 | |
| Multichannel electronic pipettor | VWR | 89000-674 | |
| Pipett tips | Eclipse (aangeschaft via Light Labs) | B-5061/B-4061 | |
| Chilled centrifuge - Allegra X-12R | Beckman Coulter | N/A - contacteer Beckman Coulter | |
| Acquity Ultra performance Liquid Chromatography (UPLC) System | Waters Corporation | N/A - contacteer Waters Corporation | |
| UPLC C8 column (gradient option a) | Waters Corporation | 186002876 | |
| UPLC T3 column (gradient option b) | Waters Corporation | 186003536 | |
| Xevo G2 Q-TOF Mass spectrometer | Waters Corporation | N/A - contacteer Waters Corporation |
Referenties
- Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies. Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).
- Zelena, E., et al. Development of a robust and repeatable UPLC-MS method for the long-term metabolomic study of human serum. Analytical Chemistry. 81, 1357-1364 (2009).
- Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. UPLC-MS-based analysis of human plasma for metabonomics using solvent precipitation or solid phase extraction. Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).
- Kamburov, A., Cavill, R., Ebbels, T. M., Herwig, R., Keun, H. C. Integrated pathway-level analysis of transcriptomics and metabolomics data with IMPaLA. Bioinformatics. 27, 2917-2918 (2011).
- Xia, J., Wishart, D. S. MetPA: a web-based metabolomics tool for pathway analysis and visualization. Bioinformatics. 26, 2342-2344 (2010).
- Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. Challenges and opportunities of metabolomics. J. Cell. Physiol. 227, 2975-2981 (2012).
- Issaq, H. J., Waybright, T. J., Veenstra, T. D. Cancer biomarker discovery: Opportunities and pitfalls in analytical methods. Electrophoresis. 32, 967-975 (2011).
- Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. LC-MS-based metabolomics. Mol. Biosyst. 8, 470-481 (2012).
- Weckwerth, W., Morgenthal, K. Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation. Drug Discov. Today. 10, 1551-1558 (2005).
- Smith, C. A., et al. METLIN - A metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27, 747-751 (2005).
- Culpepper, S. A., Aguinis, H. R is for Revolution: A Cutting-Edge, Free, Open Source Statistical Package. Organ Res. Methods. 14, 735-740 (2011).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3, 211-221 (2007).
- Vuckovic, D. Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 403, 1523-1548 (2012).
- Garcia-Canaveras, J. C., Donato, M. T., Castell, J. V., Lahoz, A. A comprehensive untargeted metabonomic analysis of human steatotic liver tissue by RP and HILIC chromatography coupled to mass spectrometry reveals important metabolic alterations. Journal of Proteome Research. 10, 4825-4834 (2011).
- Nordstrom, A., Want, E., Northen, T., Lehtio, J., Siuzdak, G. Multiple ionization mass spectrometry strategy used to reveal the complexity of metabolomics. Analytical Chemistry. 80, 421-429 (2008).
- Horai, H., et al. MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences. J. Mass Spectrom. 45, 703-714 (2010).
- Wishart, D. S. Advances in metabolite identification. Bioanalysis. 3, 1769-1782 (2011).
- Broeckling, C., Heuberger, A., Prince, J., Ingelsson, E., Prenni, J. Assigning precursor-product ion relationships in indiscriminant MS/MS data from non-targeted metabolite profiling studies. Metabolomics. , 1-11 (2012).
- Kangas, L. J., et al. In silico identification software (ISIS): a machine learning approach to tandem mass spectral identification of lipids. Bioinformatics. 28, 1705-1713 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
