Non-gerichte metabolietprofilering door ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. Dit artikel schetst een typische werkstroom die wordt gebruikt voor non-gerichte metabolietprofilering van serum, inclusief monsterorganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, data-analyse, kwaliteitscontrole en metabolietidentificatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Non-doelgerichte metabolietprofilering door ultra performante vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. De aanpak biedt een onbevooroordeelde en diepgaande analyse die de ontwikkeling van diagnostische tests, nieuwe therapieën en een betere begrip van ziekteprocessen kan mogelijk maken. De inherente chemische diversiteit van het metabool veroorzaakt aanzienlijke analytische uitdagingen en er is geen enkele experimentele aanpak die alle metabolieten kan detecteren. Bovendien vereist de biologische variatie in individueel metabolisme en de afhankelijkheid van metabolisme van omgevingsfactoren grote steekproeven om het juiste statistische vermogen te bereiken dat nodig is voor zinvolle biologische interpretatie. Om deze uitdagingen aan te pakken, beschrijft deze tutorial een analytische workflow voor grootschalige non-doelgerichte metabolietprofilering van serum door UPLC-MS. De procedure omvat richtlijnen voor steekproeforganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, kwaliteitscontrole en metabolietenidentificatie en zal betrouwbare dataverwerving voor grote experimenten mogelijk maken en een startpunt bieden voor laboratoria die nieuw zijn in non-doelgerichte metabolietprofilering door UPLC-MS.
Inleiding
De termijn "metabolomics" kan veel dingen omvatten. Bijvoorbeeld, een metabolomics experiment kan worden uitgevoerd met behulp van een verscheidenheid aan analytische platforms zoals NMR en zowel gas- als vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie. Bovendien kunnen metabolomics experimenten op een gerichte of niet-gerichte manier worden uitgevoerd, of een combinatie van beide. Een gericht metabolomics experiment zal een gerichte analyse van een panel van moleculen omvatten die belangrijk zijn voor de biologische vraag die ter hand is (bijv. kleine moleculen die betrokken zijn bij de TCA-cyclus zal een nauwkeurige kwantificering van die route ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Sample Organisatie
- Om een platenplattegrond voor monstervoorbereiding op een spreadsheet te maken, voer in de eerste kolom een monsterlijst in volgorde van laden. In een tweede kolom voer de locaties van de 96-well platen in met de juiste nomenclatuur voor uw autosamplersoftware.
- Bewaar één well in elke plaat voor QC-monsters.
- Als uw LC-autosampler twee platen tegelijk kan verwerken, verdeel de monsterlijst in batches van 190 en bewaar deze informatie in een tweede werkblad.
- Gebruik binnen elk van deze batches de randomisatiefunctie [opmerking: "=rand()" in Excel] om de injectievolgorde te randomiseren. Kopieer en plak nu u....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De basisstappen voor de analyse van een niet-doelgerichte metabolietprofilering via UPLC-MS worden schetsmatig weergegeven in Figuur 1. De ruwe gegevens voor elk monster kunnen worden gevisualiseerd als een base peak-chromatogram. Figuur 2 toont een voorbeeld van een base peak-chromatogram van een serummonster dat is geanalyseerd met gradiëntoptie (a) in de handleiding. Na de hierboven beschreven statistische analyse wordt geprobeerd de metabolieten te identificeren voor alle statistisch.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze tutorial dient als startpunt voor het uitvoeren van grootschalige niet-gerichte metabolietprofilering door UPLC-MS. De workflow is gericht op metabolieten die kunnen worden geëxtraheerd met een waterige methanoloplosmiddel, vastgehouden op een C8 of C18 UPLC-kolom en gedetecteerd als positieve ionen. In de situatie waar er geen vooraf bepaalde voorkeur is voor een specifieke metabolietenklasse en een hypothese genererend globaal profiel gewenst is, is dit protocol waardevol omdat het zal resulteren in de detectie va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De gepresenteerde tutorial werd uitgevoerd en ontwikkeld binnen de Proteomics and Metabolomics Facility aan de Colorado State University, die gedeeltelijk wordt gefinancierd door de CSU Research Administration Resources for Scholarly Projects.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96 well plates - 500 μl wells | VWR | 40002-020 | Deze worden gebruikt voor monstervoorbereiding |
| 96 well plate mats | VWR | 89026-514 | Deze worden gebruikt voor monstervoorbereiding |
| 96 well plates - 350 μl wells | Waters Corporation | WAT058943 | Deze worden gebruikt voor monsterinjectie |
| 96 well plate mats | Waters Corporation | 186000857 | Deze worden gebruikt voor monsterinjectie |
| 96 well plate heat seals | Waters Corporation | 186002789 | Deze kunnen worden gebruikt voor monsterinjectie of langetermijnopslag |
| 96 well plate heat sealer | Waters Corporation | 186002786 | |
| LC-MS grade methanol | Fluka | 34966 | |
| LC-MS grade acetonitrile | Fluka | 34967 | |
| LC-MS grade aater | Fluka | 39253 | |
| LC-MS grade formic acid | Fluka | 56302 | |
| Multichannel electronic pipettor | VWR | 89000-674 | |
| Pipett tips | Eclipse (aangeschaft via Light Labs) | B-5061/B-4061 | |
| Chilled centrifuge - Allegra X-12R | Beckman Coulter | N/A - contacteer Beckman Coulter | |
| Acquity Ultra performance Liquid Chromatography (UPLC) System | Waters Corporation | N/A - contacteer Waters Corporation | |
| UPLC C8 column (gradient option a) | Waters Corporation | 186002876 | |
| UPLC T3 column (gradient option b) | Waters Corporation | 186003536 | |
| Xevo G2 Q-TOF Mass spectrometer | Waters Corporation | N/A - contacteer Waters Corporation |
Referenties
- Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies. Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).
- Zelena, E., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
