RNA secundaire structuur Voorspelling behulp van High-throughput SHAPE

Summary

High-throughput selectieve 2-hydroxyl acylering geanalyseerd door primerverlenging (SHAPE) gebruikt een nieuwe chemische indringende techniek, reverse transcriptie, capillaire elektroforese en secundaire structuur predictie software om de structuren van RNA bepalen van enkele honderden tot enkele duizenden nucleotiden aan nucleotide resolutie.

Abstract

Inzicht in de functie van RNA betrokken zijn bij biologische processen vereist een grondige kennis van de structuur van RNA. Voor dit doel wordt de methode genaamd "high-throughput selectieve 2-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie" of SHAPE, maakt voorspelling van secundaire structuur van RNA met enkele nucleotide resolutie. Deze aanpak maakt gebruik van chemische stoffen die bij voorkeur indringende acyleren enkelstrengs of flexibele gebieden van RNA in waterige oplossing. Sites van chemische modificatie worden gedetecteerd door reverse transcriptie van het gemodificeerde RNA en de producten van deze reactie worden gefractioneerd door geautomatiseerde capillaire elektroforese (CE). Aangezien reverse transcriptase onderbroken op de RNA nucleotiden gemodificeerd door de SHAPE reagentia, de resulterende cDNA-bibliotheek indirect mapping die ribonucleotiden die enkel zijn gestrand in de context van de gevouwen RNA. Gebruik ShapeFinder software, worden de elektroferogrammen door geautomatiseerde CE verwerkt en omgezet tot nucleotide reactiviteit tabellen die zich omgezet in pseudo-energie beperkingen die in de RNAStructure (v5.3) voorspelling algoritme. De tweedimensionale RNA structuren verkregen door het combineren SHAPE probing met in silico RNA secundaire structuur voorspelling is gevonden dat veel nauwkeuriger dan structuren verkregen bij procedure alleen.

Introduction

Om de functies van katalytische en niet-coderende RNA's die betrokken zijn bij de regulatie van splicing, vertaling, virusreplicatie en kanker te begrijpen, is een gedetailleerde kennis van RNA structuur vereist ^1,2. Helaas, nauwkeurige voorspelling van RNA vouwen vormt een enorme uitdaging. Klassieke indringende agenten lijden veel nadelen, zoals toxiciteit, onvolledige nucleotide dekking en / of doorvoer beperkt tot 100-150 nucleotiden per experiment. Zonder hulp secundaire structuurvoorspelling algoritmen zijn eveneens nadelig, vanwege onnauwkeurigheden als gevolg van hun onvermogen om effectief onderscheid tussen energetisch soortgelijke structuren. Grote RNAs in het bijzonder zijn vaak ongevoelig methoden 3D structuurbepaling zoals röntgenkristallografie en nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie, door hun conformationele flexibiliteit en grote hoeveelheden zeer zuivere monsters voor deze technieken.

HIGH-throughput SHAPE lost veel van deze problemen door een effectieve, eenvoudige benadering sonderen van de structuur van grote RNA in single-nucleotide resolutie. Bovendien, de reagentia voor SHAPE veilig, gemakkelijk te hanteren en in tegenstelling tot de meeste andere chemische sonderen reagentia reageren met alle vier ribonucleotiden. Deze reagentia kunnen doordringen celmembranen, waardoor het mogelijk RNAs in hun in vivo omgeving sonde (s) ^3. Oorspronkelijk ontwikkeld in het laboratorium Weken ⁴ is SHAPE gebruikt voor het analyseren van een breed scala van RNA, het meest opmerkelijke voorbeeld is de bepaling van de totale secundaire structuur van het ~ 9 kb HIV-1 RNA-genoom ^5. Andere opmerkelijke prestaties met SHAPE omvatten opheldering van de structuur van besmettelijke viroïden ^6, menselijk lange niet-coderende RNA's ^7, gist ribosomen ⁸ en ⁹ riboswitches alsook identificeren eiwit bindingsplaatsen virion geassocieerde HIV-1 RNA ^3. While de originele en high-throughput variaties van het SHAPE-protocol zijn elders ^10-12 gepubliceerd, het huidige werk geeft een gedetailleerde beschrijving van de secundaire structuur van RNA bepaling door high-throughput SHAPE met fluorescerende oligonucleotiden, de Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer, en SHAPEfinder en RNAStructure (v5.3) software. Niet eerder gepubliceerde technische details en advies voor problemen zijn ook inbegrepen.

Variaties van de SHAPE

De essentie van SHAPE en variaties blootstelling van RNA in waterige oplossing elektrofiele anhydriden die selectief acyleren 2'-hydroxyl (2'-OH) groepen ribose, waardoor omvangrijke adducten op de plaatsen van modificatie. Deze chemische reactie dient als een middel ondervragen lokale RNA structurele dynamica enkelstrengs nucleotiden zijn meer vatbaar voor conformaties bevorderlijk elektrofiele aanval van deze reagentia aannemen, terwijl base gepaarde of architectonisch constrained nucleotiden zijn minder reactief of ^10. Sites van adduct worden gedetecteerd door reverse transcriptie initiëren van fluorescerend of radioactief gemerkte primers gehybridiseerd met een bepaalde plek op de gemodificeerde RNA (de "(+)" primerverlengingsreactie). Bij reverse transcriptase (RT) nalaat de geacyleerde ribonucleotiden doorkruisen, wordt een pool van cDNA-producten geproduceerd waarvan de lengten samenvallen met sites van de wijziging. A control, "(-)" primerverlengingsreactie gebruik RNA dat niet is blootgesteld aan reagens is bovendien zo uitgevoerd, dat voortijdige beëindiging van DNA-synthese (bijvoorbeeld "stops") door structuur-specifieke RNA-streng breuk, etc, kan RNA. worden onderscheiden van pauze te vervaardigd door chemische modificatie. Tenslotte worden twee dideoxy-sequentie-initiëren van dezelfde primers als merkers reactief nucleotiden correleren met het RNA primaire sequentie na elektroforese.

In de oorspronkelijke aanvraag van SHAPE, dezelfde ³² P-end-gelabelde primer wordt gebruikt voor het (+), (-), en twee sequencing reacties. De in deze reacties worden geladen in aangrenzende putjes in een 5-8% Polyacrylamide slab-gel, en gefractioneerd door denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE, figuur 1). Kwantitatieve analyse van de gel beelden die door conventionele SHAPE kan worden uitgevoerd met SAFA, een semi-automatische footprinting analyse software ^13.

In contrast, high-throughput SHAPE gebruik fluorescerend gemerkte primers en geautomatiseerde capillaire elektroforese. Specifiek, voor elk gebied van RNA onderzochte een viertal DNA primers met een sequentie gemeenschappelijk, maar verschillende 5 'fluorescerende labels worden gesynthetiseerd of gekocht. Deze verschillend gemerkte oligonucleotiden dienen om eerste twee SHAPE reacties en twee sequencing reacties waarvan de producten zijn samengevoegd en gefractioneerd / gedetecteerd door geautomatiseerde capillaire elektroforese (CE). Whereas het reactiviteitsprofiel van nt 100-150 van RNA kunnen worden verkregen uit een reeks van vier reacties met de oorspronkelijke benadering, high-throughput SHAPE resolutie van 300-600 nt uit een samengevoegd monster ^3. Tot 8 sets van reacties kunnen gelijktijdig worden gefractioneerd, terwijl liefst 96 monsters bereid voor fractionering in de loop van 12 opeenvolgende CE runs (figuur 2). Bovendien, de SHAPEfinder software ontwikkeld om gegevens die uit de CEQ en andere genetische analysatoren bewerkt en geanalyseerd, is geautomatiseerd en vereisen minder gebruikersinterventie dan SAFA ¹³ of andere gel-analysepakketten.

Meer geavanceerde high-throughput methodologieën zijn onlangs ontstaan ​​zoals PARS (parallelle analyse van RNA structuur) ¹⁴ en Frag-Seq (fragment-sequencing) ^15, welke structuur-specifieke enzymen in plaats van alkylering reagentia in combinatie met de volgende generatie sequencing technieken te verkrijgen informatin over RNA-structuur. Ondanks de aantrekkelijkheid van deze technieken, de vele beperkingen die inherent zijn aan nuclease indringende nog steeds ^16. Deze problemen kunnen worden omzeild in het SHAPE sequencing (SHAPE-Seq) ¹⁷ ontworpen waarbij next generation sequencing wordt voorafgegaan door chemische modificatie en reverse transcriptie van RNA in een soortgelijke wijze uitgevoerd in conventionele SHAPE. Hoewel deze methoden de toekomst van RNA structuurbepaling vertegenwoordigen, is het belangrijk om te onthouden dat de volgende generatie sequencing is zeer duur, en blijft beschikbaar voor vele laboratoria.

SHAPE Data Analysis

Gegevens die in de genetische analysator wordt gepresenteerd in de vorm van een elektroferogram, waarbij de fluorescentie-intensiteit van het monster (s) die door de capillaire detector wordt uitgezet tegen een index van migratietijd. Dit perceel heeft de vorm van overlappende sporen overeenkomen met de vier fluorescentiekanaals met de verschillende fluoroforen detecteren, en waarbij elk spoor bestaat uit pieken die overeenkomen met individuele cDNA sequentie of producten. Elektroferogram gegevens worden geëxporteerd uit de genetische analyse als een tab-gescheiden tekstbestand en in ShapeFinder transformatie en analysesoftware ¹⁸ geïmporteerd.

ShapeFinder wordt eerst gebruikt om een ​​reeks van wiskundige transformaties op de gegevens zodat migratietijden en piekvolumes nauwkeurig de identiteit en hoeveelheid van de reactieproducten, respectievelijk. Pieken worden vervolgens uitgelijnd en geïntegreerd, en de resultaten in tabellen genoteerd met de primaire RNA-sequentie. Een "reactiviteitsprofiel" de relevante segment van RNA wordt verkregen door controlewaarden van de (+) waarden die bij elke nucleotide RNA, en het normaliseren van de gegevens hieronder beschreven. Dit profiel wordt geïmporteerd in RNAstructure (v5.3) software ^19,20, waarbij de genormaliseerde reactiviteit val converteertwaarden in pseudo-energie beperkingen die zijn opgenomen in de secundaire structuur van RNA vouwen algoritme. Een combinatie van chemische en indringende vouwen algoritmen op deze wijze de nauwkeurigheid van structuurvoorspelling opzichte elke methode alleen ^12,21 verbetert. De uitgang van RNAstructure (v5.3) bevat afbeeldingen van de laagste energie RNA secundaire structuren kleurcodering met SHAPE reactiviteitsprofiel (s), alsmede dezelfde structuren in tekstuele dot-haakjesnotering. Dit laatste kan vervolgens worden geëxporteerd naar software gewijd aan de grafische weergave van de secundaire structuur van RNA, zoals Varna ²² en PseudoViewer ^23.

Figuur 1. Stroomschema van RNA structuurbepaling via SHAPE ^4,10. (A) RNA may worden verkregen uit biologische monsters of door in vitro transcriptie. (B) Afhankelijk van de bron wordt RNA gevouwen of op andere wijze verwerkt en bewerkt met SHAPE reagens. (C) Reverse transcriptie met behulp van fluorescent of radioactief gelabelde primers. (D) cDNA-producten zijn gefractioneerde via ofwel capillaire of slab gel gebaseerde elektroforese. (E) Fragment analyse. (F) RNA structuur voorspelling. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Het hoog-vermogen van CE-SHAPE snelle analyse van meerdere RNA en / of segmenten van hetzelfde RNA. (A) Vertegenwoordigt hoe een RNA kan worden opgedeeld in 300-600 nt secties (kleurcode in groen, blauw en rood) (B) afdelingen van het RNA worden onafhankelijk gesondeerd met behulp van verschillende sets van fluorescente primers (zwarte pijlen) (C) Sets reacties worden samengevoegd en geladen in putten A1, B1, C1, etc, respectievelijk, het verstrekken van volledige dekking voor de ~ 3 kb RNA1. Reactieproducten van RNA's 2, 3, 4, enz. kunnen op dezelfde manier worden bereid voor fractionering in opeenvolgende elektroforetische runs. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Protocol

Primerontwerp en uitbreiding van de RNA 3 'terminus

Om lange RNA analyse door high-throughput SHAPE, moet een reeks van primer hybridisatie sites dat ze (i) worden gescheiden door ~ 300 nt, (ii) 20-30 nt in lengte, en (iii) dat RNA / worden geselecteerd DNA hybriden gemaakt door het gloeien DNA om deze sites een verwachte smelttemperatuur van> 50 ° C. Bovendien moeten segmenten van RNA die voorspeld hoge mate bepaald worden vermeden, maar die constatering vereist enige voorkennis van de structuur van RNA, die vaak niet beschikbaar. DNA-primers die hybridiseren aan deze sites moet dan worden ontworpen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat zij niet zou worden verwacht dat zij een stabiele dimeren of intrastreng secundaire structuren te vormen.

Eenmaal ontworpen, moet primersets ofwel worden aangeschaft (bijv. van Integrated DNA Technologies, Ames, Iowa) of gesynthetiseerd ^24,25. Primers 5'-gelabeld met Cy5, Cy5.5,WellRedD2 (Beckman Coulter) en IRDye800 (Lycor) / WellRedD1 (Beckman Coulter) zijn het best geschikt voor de Beckman Coulter 8000 CEQ, het verstrekken van goede intensiteit van het signaal terwijl het minimaliseren van crosstalk. Gelabelde oligonucleotiden onbeperkt worden opgeslagen in kleine, 10 uM aliquots bij -20 ° C, herhaalde vries / ontdooi cycli te voorkomen.

Met behulp van primers ontworpen op deze wijze is het mogelijk SHAPE gegevens te verkrijgen voor een vrijwel volledige RNA van elke lengte. De sequentie bij of nabij het ​​3'-uiteinde van een RNA altijd ontoegankelijk SHAPE, tenzij het ​​RNA is ontworpen om een 3 bevat-terminale extensie (bijv. "structuur cassette") waaraan een primer kan worden gehybridiseerd ^4.

RNA bereiding door Capillary Electrophoresis

Hoewel RNA's uit biologische monsters kunnen worden gebruikt voor high-throughput SHAPE, wordt het protocol hier gegeven geoptimaliseerd voor RNA geproduceerd door in vitro transcriptie. Commerciële transcription kits zoals MEGAshortscript (Ambion) in combinatie met MegaClear RNA zuivering kolommen (Ambion) zijn zeer geschikt om grote hoeveelheden zuiver RNA produceert. RNA's worden opgeslagen in TE buffer tussen -20 ° C en -80 ° C. Voor de beste resultaten dient RNA homogeen weergegeven door zowel denatureren en niet-denaturerende polyacrylamidegelelektroforese.

1. RNA Folding

1. In een 0,5 ml microcentrifugebuis, verdunnen 12 pmol van RNA tot 18 pl met water en voeg 2 ui 10X renaturatie buffer. Meng goed.
2. Verwarm tot 85 ° C gedurende 1 min, daarna afkoelen tot 4 ° C met een snelheid van 0,1 ° C / sec.
3. Voeg 100 ul water en 30 pl 5X vouwingsbuffer.
4. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30-60 min, afhankelijk van het RNA wordt gevouwen. In het algemeen, Mg ^{2 +-afhankelijke} vouwing van langere en meer gestructureerde RNA's vereisen een langere incubatietijd.
5. Overdracht van een 72 pi aliquot aan elk van de twee 0,5 ml microcentrifugebuisjes: modificatiesed (+) en controle (-).

2. Chemische modificatie van RNA

Goed gekarakteriseerd, SHAPE elektrofiele reagentia omvatten isatoïsch anhydride (IA), N-methylisatoic anhydride (NMIA), 1-methyl-7-nitro-isatoïsch anhydride (1M7) ²⁶ en benzoyl cyanide (BzCN) ^27. Van deze, de meest gebruikt voor high-throughput SHAPE zijn 1M7 en NMIA, en alleen de laatste is in de handel verkrijgbaar (Life Technologies). De eindconcentratie van het modificeren reagens moet worden geoptimaliseerd voor elke RNA om voor een "single-hit" modificatie kinetiek, namelijk de toestand waarin de meeste RNA in oplossing eenmaal zijn gemodificeerd in het gebied van RNA geanalyseerd ^11. Deze optimale concentratie kan worden bepaald door het uitvoeren van verschillende reacties, waarin de concentratie van het reagens wordt gevarieerd in het bereik (n) zoals aangegeven in de tabel in punt 2.1 hieronder. Gebruik de concentratie van het reagens dat een gemakkelijk detecteerbaar signaal produceert, terwijl minimizing het verschil in signaalintensiteit tussen lange en korte DNA-synthese producten (bv. Figuur 3).

Figuur 3. SHAPE elektroferogrammen geproduceerd uit een ~ 360 nt RNA behandeld met (A) 0 (B) 2.5 mM of (C) 10 mM 1M7. Alle elektroferogrammen worden weergegeven op dezelfde schaal. Blauw, groen, rood en zwart sporen corresponderen met (+) reactieproducten (Cy5), (-) reactieproducten (Cy5.5), en de twee sequentie ladders (WellRed D2 en IRDye800), respectievelijk. De RNA gebruikte afbeelding (B) te produceren is behandeld met de optimale hoeveelheid 1M7, tonen goede maximale resolutie en intensiteit, met minimale signaal verval gehele trace (links). Lees lengte maximaal onder deze omstandigheden. In tegenstelling, het ontbreken drager intensity, goed opgelost pieken in (A) suggereert een sub-optimale concentratie van 1M7. Omgekeerd, het signaal verval duidelijk in (C) geeft aan dat enkele treffer kinetiek is niet waargenomen, en het RNA is over-gemodificeerd. In dergelijke gevallen, vooral wanneer RT niet zou worden verwacht dat het 5 'uiteinde van het RNA matrijs tegenkomt, lees lengte zal optimaal zijn.

1. Bereid 10X voorraad van SHAPE reagens (NMIA of 1M7). Dit wordt het best bereikt door toevoeging van een kleine hoeveelheid reagens om een 1,5 ml microfuge buis, vervolgens toevoegen van DMSO in de gewenste concentratie te bereiken. Let op: SHAPE reagens oplossingen moeten watervrij totdat gemengd met RNA. WINKEL DMSO in een exsiccator tot kamertemperatuur en worden voorraadoplossingen onmiddellijk voor gebruik om blootstelling aan heersende waterdamp minimaliseren.

   Reagens	Optimum 10X concentratie (in DMSO)	Tijd omvolledige afbraak van reagens 27
   NMIA	10-100 mM	~ 20 min
   1M7	10-50 mM	70 sec

   
   Tabel 1. Elektrofiele reagentia voor RNA modificatie.
   
2. Voeg 8 pi 10X NMIA/1M7 of watervrij DMSO gemodificeerde (+) en controle (-) mengsels respectievelijk Opmerking:. 2,5 mM heeft bewezen een effectieve beginconcentratie zowel NMIA en 1M7, ongeacht de RNA geanalyseerd.
3. Incubeer bij 37 ° C gedurende 50 min (NMIA) of 5 min (1M7) worden betrokken.
4. Precipitate RNA door toevoeging 8 pl (0,1 vol) van 3 M NaOAc (pH 5,2), 8 pi 100 mM EDTA, 240 pl (3 vol) koude ethanol en 1 pi 10 mg / ml glycogeen. Koel gedurende 2 uur en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Was de pellet twee keer met koude 70% ethanol. Let op: Het is belangrijkminimaliseren koeling tijd, centrifugeren tijd en snelheid om de co-precipitatie van zout te beperken, want dit kan negatieve invloed hebben op de piek resolutie tijdens de elektroforese.
5. Verwijder supernatant met een micropipet en drogen pellet gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
6. Los geprecipiteerde RNA in 10 pl TE-buffer en incubeer 5 min bij kamertemperatuur. Dit is voldoende opgelost RNA voor twee reverse transcriptie reacties. Bewaar het ongebruikte gedeelte bij -20 ° C. Waarschuwing: Mechanisch hersuspenderen van de pellet is gewoonlijk niet nodig, en kan de RNA beschadigen.

3. Reverse Transcriptie

Deze stap genereert het fluorescentie-gemerkte cDNA producten die worden gebruikt om de mate waarin de RNA nucleotiden gemodificeerd door een SHAPE reagens indirecte identificatie. Voor SHAPE, de prestaties van Superscript III (Invitrogen) RT was superieur aan alle andere geteste RTS, en is gekozen voor gebruik met dit enzymprotocol. Oligonucleotiden gelabeld met Cy5 en Cy5.5 worden gebruikt voor de eerste (+) en (-) reacties, respectievelijk. Voor kortere RNA, primers worden gehybridiseerd met een 3'-terminale verlenging van de oorspronkelijke RNA (bijv. een "structuur cassette") om informatie te verkrijgen over de 3 'terminus ⁴ Let:. Vanaf dit punt tot CE, dienen de monsters beschermd licht.

1. Bereid (+) en (-) monsters voor reverse transcriptie in 0,5 ml microcentrifuge buizen. Voor de (+) RT-reactie, mengen 5 ui gemodificeerd RNA (+), 6 pl water en 1 pi Cy5-gelabelde primer (10 uM), de (-) RT-reactie, mengen 5 ui RNA control (-), . 6 pi water, en 1 ui Cy5-gelabelde primer (10 uM) Let op: Sarstedt PCR-buisjes (REF 72.735.002) worden aanbevolen voor deze toepassing.
2. Plaats buisjes in een thermische cycler en primer hybridiseren aan RNA en reverse transcriptie bereiden door toepassing van het volgende programma: 85 ° C, 1 min, 60 ° C, 5 min.;35 ° C, 5 min, 50 ° C, bezit.
3. Tijdens de verouderingsstap, moet dus voldoende 2.5x RT mix voor het aantal reacties te verrichten, plus 50% (bijv. voor twee (+) en twee (-) reacties, schaal 4,5-voudig). Een reactie vereist 8 pi, als volgt: 4 pl 5x RT buffer, 1 ui 100 mM DTT, 1,5 pi water, 1 ui 10 mM dNTPs, 0,5 pi SuperScript III RT. Blijf op ijs. Let op: 5X RT buffer en 100 mM DTT zijn voorzien van de SuperScript III RT.
4. Zodra de temperatuur van de hechtende mengsels bereikt 50 ° C, voeg 8 pl RT mix 2.5X de (+) en (-) reacties Aanbeveling:. Warm het mengsel tot RT 37 ° C gedurende 5 minuten voordat het aan de reactie toe te voegen .
5. Incubeer 50 min bij 50 ° C, daarna afkoelen tot 4 ° C en / of plaats op ijs. Opmerking: Incubatie van de RT reactie langer dan 50 min kan tot afwijkende cDNA producten.
6. Hydrolyseren RNA door toevoeging van 1 pi 4 M NaOH en verwarming tot 95 ° C gedurende 3 minuten. Koele reacties op ijs en vervolgens neutraliseren door toevoeging van 2 pl van 2 M HCl. Let op: Het overslaan van deze stap resulteert in slechte kwaliteit scheiding van cDNA-producten.
7. Combineer (+) en (-) reacties en het neerslaan van de cDNA door 0,1 volume 3 M NaOAc, 0,1 volume van 100 mM EDTA, 1,5 vol koude ethanol en 1 pi van 10 mg / ml glycogeen. Koelkast gedurende 2 uur, centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Was de pellet twee keer met koud 70% ethanol. Let op: Centrifugeren tegen hogere tarieven of voor een langere periode leidt tot moeilijkheden resuspenderen de pellet (s).
8. Resuspendeer pellet cDNA in 40 pl gedeioniseerd formamide door verhitting tot 65 ° C gedurende 10 min, gevolgd door krachtig vortexen gedurende meer dan 30 minuten. Let op: Pellets kunnen onzichtbaar zijn. Gebrek aan of zwak signaal volgende elektroforese kan het gevolg zijn van het niet adequaat los de pellet op in dit stadium zijn.

e "> 4. Voorbereiding van Sequencing Ladder

Sequencing ladders dienen als markers voor het bepalen nucleotide positie tijdens dataverwerking. Deze worden gegenereerd via een USB Cycle Sequencing kit (# 78500), DNA met dezelfde sequentie als het RNA bestudeerd en primers gelabeld met WellRed D2 of D1/Lycor 800. Typisch zullen DNA in deze reactie toegepaste dat als matrijs voor de transcriptie van RNA in kwestie. Hoewel de reactietemperatuur protocol hier gepresenteerde lijkt op die door de fabrikant kit, wordt de reactie opgeschaald verscheidene malen. Terwijl ddA en ddT gebruikt chain termination in de hieronder beschreven reacties, kan elk paar terminators worden gebruikt om de sequentie ladders genereren.

1. Meng 40 ul van de ddA beëindiging mix, 5 pmol template DNA, 4,6 ui 10X Sequenase buffer, 10 pl WellRed D2 gelabelde primer, 4,6 pl Sequenase en water om het totale volume op 82 ui te brengen. Voeg de Sequenase laatste. Voorbereidingopnieuw een tweede sequencing reactie op dezelfde wijze gebruik ddT en Licor IR800 gelabelde primer plaats.
2. Overgaan tot PCR-amplificatie met behulp van USB aanbevolen voorwaarden. Let op: Toevoeging van minerale olie is niet vereist noch aanbevolen voor protocollen / thermocyclers dat een verwarmde deksel te gebruiken.
3. Combineer de ddA en ddT sequentiereacties in een 1,5 ml microfugebuisje (~ 164 pi totaal).
4. DNA precipitaat als volgt: Voeg 16 pl 3 M NaOAc (pH 5,2), 16 ui 100 mM EDTA, 1 pi 10 mg / ml glycogeen en 480 pl 95% ethanol. Meng, incuberen bij 4 ° C gedurende 30 minuten en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
5. Resuspendeer pellet cDNA in 100 ui gedeioniseerd formamide door verhitting tot 65 ° C gedurende 10 min, gevolgd door krachtig vortexen gedurende tenminste 30 minuten.

5. Fractionering van reactieproducten van capillaire elektroforese

Capillaire elektroforese voor gelijktijdigscheiding van cDNA-synthese producten uit vier reacties samengevoegd in een enkel monster. Acht monsters kunnen tegelijkertijd worden gefractioneerd, terwijl liefst 96 monsters gefractioneerd kan zijn tijdens een run (figuur 2).

1. Meng 40 ul van gepoolde SHAPE monsters met 10 ul van de gepoolde sequencing ladders, en transfer naar 96-well sample platen Let op:. Het is noodzakelijk dat Beckman Coulter reagentia en platen (waaronder LPA-I gel, lopende buffer, minerale olie, monster laad-oplossing en het monster en de buffer platen) worden gebruikt met de Beckman Coulter-CEQ 8000 Genetic Analyzer.
2. Programma en de voorbereiding van capillaire elektroforese instrument en initiëren draaien als per instructies van de fabrikant. Opmerking: Voor de beste resolutie van de monsters, gebruik maken van de eerder gepubliceerde CAFA methodeparameters ^28.

Idealiter buiten primer en sterke-stop pieken, signalen voor elke piek in alle vier elektroferogram traces moet worden in het lineaire bereik, een geleidelijke afname in signaal acceptabel is. Soms echter grote pieken (stops) zijn duidelijk, ook in de reactie, en deze kunnen interfereren met daaropvolgende verwerking. Afgeknotte cDNA's die tot deze pieken kan het resultaat van een natuurlijke obstakel tijdens reverse transcriptie (bijv. RNA secundaire structuur), of RNA degradatie. In het eerste geval kunnen additieven zoals betaine RT verwerkbaarheid te verbeteren en RT pauzeren / voortijdige beëindiging.

Gegevensverwerking

ShapeFinder software laat de gebruiker toe om te visualiseren en te transformeren CE sporen en deze omzetten in SHAPE reactiviteitsprofielen ^18. Zodra reactiviteit waarden in de tabel te, worden ze genormaliseerd en geïmporteerd in RNAStructure (v5.3) naar secundair structurele modellen te genereren en te verfijnen.

6. ShapeFinder Software

Een uitbreiding van de BaseFinder trace verwerking platformulier ^29, de gepubliceerde versie van ShapeFinder is gratis beschikbaar voor niet-commercieel gebruik ^18. Gedetailleerde instructies voor data handling op ShapeFinder zijn voorzien van de software documentatie.

1. Electroferogrammen de CEQ ingevoerd in ShapeFinder, waar ze aangepast om te corrigeren voor (i) fluorescente achtergrond, (ii) spectrale overlap tussen fluorescent kanalen, (iii) mobiliteit verschuivingen gegeven door verschillend gelabeld primers, (iv) verschillen in fluorescentie intensiteit voorkomende producten gelabeld met verschillende fluoroforen, en (v) storingsvrij signaal als gevolg van voortijdige beëindiging van reverse transcriptie.
2. Het "Setup" functie van de functie "Lijn en integreren" in ShapeFinder wijst automatisch identiteiten aan individuele pieken en correleert dit aan de RNA-sequentie zoals gedefinieerd door input van de gebruiker en de twee sequencing ladders. Hoewel de eerste opdrachten zijn over het algemeen onvolmaakt, kunnen fouten handmatig worden gecorrigeerd met behulp van de functie "Wijzigen"hetzelfde gereedschap. Ten slotte is de functie "Fit" berekent de gebieden onder de uitgelijnd (+) en (-) reactie pieken en tabulates deze reactiviteit waarden samen met het corresponderende nucleotide nummer in een tab-gescheiden tekstbestand.

Opmerking: De analyse van de gegevens is essentieel voor de nauwkeurigheid van SHAPE en enkele overwegingen zijn belangrijk in deze analyse, inclusief:

• Signaal-ruisverhouding: De signaal-ruisverhouding moet zodanig zijn dat de individuele pieken herkenbaar moet zelfs voor posities met lage reactiviteit zijn. Hoewel ShapeFinder biedt een data smoothing optie; dit alternatief moet uiterst voorzichtig worden gebruikt, als het kan scheef daaropvolgende analyse.
• Regio analyse: Typisch kan betrouwbare gegevens worden verkregen uit cDNA 300-600 nt lang, beginnend bij een gebied van 40-80 nt niet meer primer 3 'uiteinde en eindigend het signaal vervalt maar moeilijk te onderscheiden van achtergrondruis. Gebruik van multiple primer sets nodig zal zijn om langere stukken van RNA te analyseren. In dit geval wordt aanbevolen dat de overlap in betrouwbare signaaloverdracht tussen primer sets in het traject van 30-50 nt. Op kortere RNA, waarbij reverse transcriptase vaak het einde van de RNA-matrijs bereikt, moet erop worden genomen om deze pieken wie signaalruisverhouding wordt beïnvloed door de DNA-synthese sterke stop sluiten.
• Signaal decay: Het signaal decay is gerelateerd aan de mate van RNA modificatie tijdens het experiment als de imperfecte processivity van RT. Idealiter single-hit kinetiek ten opzichte van de regio RNA geanalyseerd worden bereikt om de maximale lengte lezen. Shapefinder bevat een tool die is effectief bij het ​​corrigeren voor signaal verval, maar omdat dit de neiging om fouten te introduceren in de analyse - vooral wanneer enkele treffer kinetiek niet worden nageleefd, wordt het best gebruikt als signaal verval minimaal is (dat wil zeggen, wanneer de verdeling van de pieken is in overeenstemming met enkele treffer kinetics). Onlangs zijn verbeterde algoritmen voor het transformeren signaal signaal verval gepubliceerd ³⁰ en dient te worden onderzocht of het signaal verval is van bijzonder belang in een bepaald experiment.
• Signaal scaling. Ongetwijfeld de willekeurige stap in SHAPE gegevensverwerking, het stuurprofiel worden aangepast zodat de piekintensiteit bij minimaal reactief (+) en (-) sporen gelijk. Schalen controle spoor te grote mate zal leiden tot een overvloed van negatieve reactiviteit waarden in het eerste kwartiel (zie hieronder gegevensnormalisatie). In dit geval dient de schaalfactor dienovereenkomstig worden verlaagd en de data gereïntegreerd.
• Pieken opdracht. In het algemeen geautomatiseerde versie van de piek bij welke werkt goed. Wanneer het mislukt, is het echter noodzakelijk dat de gebruikers te waarborgen dat alle pieken zijn herkent wordt, met name wanneer de signaal-ruis verhouding laag. Schouder pieken bijvoorbeeld verbindingen niet altijd, en G-rijke seties worden vaak gecomprimeerd.

7. Gegevens Normalisatie

Om nucleotide reactiviteitsprofielen nemen in de secundaire structuur algoritme gebruikt RNAStructure (v5.3) software en / of profielen van nauw verwante RNAs vergelijken, moet SHAPE gegevens worden genormaliseerd in een gestandaardiseerde vorm ^12. Dit betekent (i) zonder uitschieters uit latere berekeningen, (ii) het bepalen van de "werkelijke maximum" reactiviteit (dwz het gemiddelde van de hoogste 8% van reactiviteit, exclusief uitschieters), en (iii) normalisatie door deling van alle waarden van reactiviteit de "effectieve maximale", als volgt:

1. Open het tabblad-gescheiden tekstbestand gegenereerd na afstemming en integratie en kopieer de inhoud ervan in een Excel-spreadsheet. De meest rechtse kolom van dit bestand (RX.area-BG.area) bevat de berekende absolute SHAPE reactiviteit waarden voor elke nucleotide van het RNA. De meest linkse kolommen betreffen deze reactiviteit aan het RNA lovertlingen.
2. Berekenen en opslaan van het eerste en het derde kwartiel (dwz, de 25e en 75e percentiel) waarden voor (RX.area-BG.area) met behulp van de Excel-functie "= KWARTIEL (array, quart)"
3. Berekenen en opslaan van de interquartile verschil "= KWARTIEL (matrix, 3)-KWARTIEL (array, 1)"
4. Berekenen en opslaan van de "uitschieter cutoff waarde" met behulp van de formule '= (KWARTIEL, array, 3) 1,5 * ((KWARTIEL (matrix, 3)-KWARTIEL (array, 1)) ". Alle reactiviteit waarden groter dan deze waarde worden uit latere berekeningen uitgesloten.
5. Kopieer de reactiviteit uit (RX.area-BG.area) en plakken in een aangrenzende, lege kolom, vervolgens sorteren deze waarden zodanig dat de grootste aan de top van de kolom.
6. In de nieuw opgerichte "kolom gesorteerde waarden", schrappen waarden groter dan de uitschieter cutoff waarde.
7. Berekenen en opslaan van het gemiddelde van de hoogste 8% van reactiviteit waarden nog in de "gesorteerde waarden column ". Deze waarde is de" effectieve maximum "reactiviteit.
8. Verdeel het ongesorteerde (RX.area-BG.area) van elke nucleotide (inclusief uitschieters) door de "effectieve maximale" reactiviteit waarde aan de "genormaliseerde reactiviteit waarden" te verkrijgen. Bewaar deze in een lege kolom, waardoor een lege kolom links. Kopieer vervolgens nucleotide nummers links van de tafel en plakken in de lege kolom direct links van de "genormaliseerde reactiviteit waarden".
9. Kopieer en plak de nucleotide positie-genormaliseerde reactiviteit waarde-paren in een teksteditor.
10. Elimineer waarden onder -0.09 (dat wil zeggen, laat de ruimtes leeg), zoals deze zijn waarschijnlijk het gevolg van RT pauzeren tijdens cDNA-synthese voor andere doeleinden dan chemische modificatie van de sjabloon redenen. Bovendien geven reactiviteit waarden nucleotiden waarbij sterke pauzeren waar op de gemodificeerde template (zoals bepaald door visueel onderzoek van de "Align en integreren" ShapeFinder profile), worden uitgesloten.
11. Save het bestand met een. vorm extensie voor gebruik in structurele analyse met RNAstructure (v5.3) software.

8. Data Modeling

RNAstructure (v5.3) software wordt gebruikt om experimenteel ondersteunde RNA secundaire structuur (s) te voorspellen met de pseudo-vrije energie beperkingen ontleend SHAPE analyse ^19. De software biedt grafische representaties van de laagste energie 2D-RNA structuren als tekstuele weergave van deze structuren in dot-haakjesnotering. Dit laatste kan worden geïmporteerd in een RNA-structuur kijker van voorkeur van de gebruiker, bijvoorbeeld Pseudoviewer ²³ of Varna ^22, aan publicatie-kwaliteit beelden te produceren.

Opmerking: Er moet worden genomen bij de behandeling van de structuren die door de RNAstructure (v5.3) software. Bijvoorbeeld, kan de software niet tertiaire interacties zoals pseudoknots en kussen lussen op te lossen, noch kan het onderscheid maken of het ontbreken vanreactiviteit in een bepaalde regio door baseparing of sterische bescherming gebonden eiwitten. Als gevolg moeten deze factoren, samen met de energieën gerapporteerd voor de individuele structuren, moeten worden beschouwd bij de presentatie van een definitief structuurmodel.

Results

RNA die het HIV-1 rev-responselement (RRE) en een 3'-eindstandige structuur cassette ⁴ werd bereid uit een gelineariseerd plasmide door in vitro transcriptie, waarna het werd gevouwen door verwarming, koeling, en incubatie bij 37 ° C in aanwezigheid _MgCl2. RNA werd blootgesteld aan NMIA en vervolgens reverse getranscribeerd van een 5'-eindstandig gemerkt DNA primer gehybridiseerd aan het 3 'terminale structuur cassette. De resulterende cDNA-bibliotheek SHAPE, en controle-en seq...

Discussion

We presenteren hier een gedetailleerd protocol voor high-throughput SHAPE, een techniek die secundaire structuur wordt het mogelijk om single-nucleotide resolutie voor RNA's van elke omvang. Bovendien koppeling SHAPE experimentele data met secundaire structuurvoorspelling algoritmen vergemakkelijkt generatie RNA 2D modellen met een hogere nauwkeurigheid dan mogelijk is met deze methoden alleen is. De combinatie van fluorescent gemerkte primers en geautomatiseerde CE biedt aanzienlijke voordelen boven de traditionele...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
N-methylisatoic anhydride (NMIA)	Life technologies	M25	Los op in anhydrisch DMSO
1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7)	zie ref. 22
Superscript III Reverse Transcriptase	Life technologies	18080044	10.000 eenheden
Thermo sequenase cyclus sequencing kit	Affymetrix	78500
Materialen geleverd door de gebruiker
RNA van belang			6 pmol per reactie (de detectielimiet wordt bepaald door het instrument)
Sets van vier 5' gelabelde primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 en WellRed D1/Licor IR800)			Primers zijn complementair aan het RNA en worden gebruikt in reverse transcriptie- en sequencingreacties. De vermelde fluoroforen zijn optimaal voor de Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers kunnen worden gekocht of in huis worden gesynthetiseerd.
DNA-sjabloon			DNA wordt gebruikt voor sequencingreacties en moet de sequentie van het bestudeerde RNA bevatten - inclusief eventuele 3'-terminale extensie, indien aanwezig. Waar van toepassing, is het vaak handig om de RNA-transcriptiesjabloon te gebruiken.
Buffers
10x RNA-renaturatiebuffer			100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA
5X RNA-vouwbuffer			200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2,5 mM EDTA, 650 mM KCl. (Deze buffer kan worden gewijzigd afhankelijk van het geval (bijv. pH, EDTA, Mg, RNase-remmer)
2,5X RT-mix			4 μl 5X buffer, 1 μl 100 mM DTT, 1,5 μl water, 1 μl 10 mM dNTPs, 0,5 μl SuperScript III. Merk op dat de 5X buffer en 100 mM DTT worden geleverd bij de aankoop van SuperScript III (Invitrogen).
GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter)			Let op: Vermijd meerdere vries-ontdooicycli
APPARATUUR
Capillaire elektroforese	Beckman	CEQ8000
Thermocycler	varieert