Methodenartikel

Monitoring Dendritische cel-migratie met behulp van

DOI:

10.3791/50251

⸱

20 maart 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Clinical Research Center, A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Berlin Ultrahigh Field Facility (B.U.F.F.), Max Delbrück Center for Molecular Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volgen van cellen met behulp van MRI heeft opgedaan opmerkelijke aandacht in de afgelopen jaren. Dit protocol beschrijft de etikettering van dendritische cellen met fluor ( 19 F)-rijke deeltjes, de in vivo toepassing van deze cellen, en het toezicht op de omvang van hun migratie naar de drainerende lymfeklier met 19 F / 1 H MRI en 19 F MRS.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voortdurende aanpassing aan nieuwe niet-invasieve beeldvormende modaliteiten zoals magnetische resonantie beeldvorming (MRI) zijn sterk verbeterd ons vermogen om fysiologische of pathologische processen te bestuderen in levende organismen. MRI blijkt ook een waardevol hulpmiddel voor het vastleggen van getransplanteerde cellen in vivo. Aanvankelijke cel labeling strategieën voor MRI gemaakt van contrastmiddelen die de MR relaxatietijden beïnvloeden (T1, T2, T2 *) en leiden tot een verhoging (T1) of uitputting (T2 *) van het signaal wanneer gelabelde cellen aanwezig zijn. T2 * enhancement middelen zoals ultrakleine ijzeroxide agenten (USPIO) zijn gebruikt om cel migratie en sommige zijn ook door de FDA goedgekeurd voor klinische toepassing te bestuderen. Een nadeel van T2 * middelen is het moeilijk om het signaal uitsterven door de gemerkte cellen van andere artefacten zoals bloedstolsels, micro bloedingen of luchtbellen onderscheiden. In dit artikel beschrijven we een nieuwe techniek voor het bijhouden van cellen in vivo datis gebaseerd op labelen van de cellen met fluor (19F)-rijke deeltjes. Deze deeltjes worden bereid door emulgeren perfluor (PFC)-verbindingen en vervolgens gebruikt om het etiket cellen, die vervolgens kunnen worden afgebeeld door 19F MRI. Belangrijke voordelen van PFK voor cell tracking in vivo omvatten (i) de afwezigheid van koolstof-gebonden 19F in vivo, die vervolgens geeft achtergrond-vrije beelden en celbereik selectivityand (ii) de mogelijkheid het celsignaal kwantificeren door 19F MR spectroscopie .

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volgen van cellen in vivo is een cruciaal aspect in verschillende gebieden van de medische biologie. Hiervoor invasieve beeldvormingstechnieken die selectief kunnen localiseren cellen over een periode zeer waardevol. Voorafgaand aan de ontwikkeling van drie-dimensionale magnetische resonantie beeldvorming (MRI), werd het volgen van immune celmigratie beperkt tot microscopische analyses of tissue biopsies. Cell tracking met behulp van MRI heeft opgedaan enorme aandacht in de afgelopen jaren, niet alleen voor immunologen bestuderen immuuncel gedrag in vivo, maar ook voor klinische en onderzoekers stamcellen. Tijdens het midden van de jaren '90, de eerste studies over ijzeroxide nanodeeltjes 1 gestart met een cascade van ontwikkelingen voor het bijhouden van cellen met MRI. Ijzeroxide deeltjes verkorten van de MR relaxatietijd (T2 *) van de gelabelde cellen en dus veroorzaken signaal uitputting in MR beelden. Ijzeroxide deeltjes zijn gebruikt om label macrofagen 2, oligodendrocyte progenitors 3 en vele andere celtypen. Sommige van deze deeltjes zijn ook klinisch goedgekeurd door de FDA voor de etikettering cellulaire vaccins bij melanoompatiënten 4. Aangezien in vivo of ex vivo labeling van cellen met ijzeroxide deeltjes gebaseerd op een verkorting van de T2 *-signaal en het laatste kan ook worden veroorzaakt door in vivo gevoeligheid verband T2 * effecten zoals micro bloedingen ijzeraanslag of luchtbellen, is het misschien moeilijk zijn om gelabelde cellen te identificeren in vivo uit andere achtergrond T2 *-signaal uitsterven 5.

In dit artikel beschrijven we een techniek voor het volgen van dendritische cellen (DC) in vivo door het gebruik 19 F / 1H magnetische resonantie imaging (MRI). Deze cel tracking-technologie werd pas in 2005 6, enkele jaren na de eerste erkende aanvragen voor 19 F in MRI was gemeld 7. Een belangrijke advantage van 19 F over ijzeroxide deeltjes cel etikettering de lage biologische optreden van 19 F in weefsel, dit maakt het mogelijk om cellen zeer selectief bijhouden met vrijwel achtergrond-beelden. Voorts is het mogelijk de 19F MR signaal overlappen van de getransplanteerde cellen met gelabelde anatomische beelden verkregen uit conventionele 1H MRI. 19F / 1 H MRI derhalve aanzienlijk belang voor studies die celmigratie in vivo. Cellen bestudeerd met deze methode zijn gelabeld met 19 F-rijke deeltjes. Synthetisch afgeleide perfluorkoolstoffen (PFC's) die voornamelijk uit koolstof-en fluoratomen worden gebruikt om de deeltjes te bereiden. Deze verbindingen zijn oplosbaar in water en moeten vóór geëmulgeerd de toepassing in vitro of in vivo. De gebruikelijke omvang van de PFC deeltjes die in dienst waren van andere groepen voor in vivo 19 F-MRI-tracking experimentenvarieert tussen 100 nm en 245 nm 6,8-10. We hebben echter aangetoond dat de efficiëntie van labeling dendritische cellen met perfluor-15-kroon-5-ether (PFCE) deeltjes met toenemende deeltjesgrootte (> 560 nm). 11

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierlijke procedures moeten door de lokale institutionele dierenwelzijn commissie voorafgaand aan de uitvoering worden goedgekeurd. Tijdens de MR metingen een adequaat niveau van anesthesie en fysiologische monitoring (lichaamstemperatuur, ademhalingsfrequentie) zijn onmisbare vereisten.

1. Generatie Mouse Bone Marrow-afgeleide dendritische cellen

  1. Extract beenmergcellen van C57BL / 6 muizen zoals eerder beschreven 12. Dit protocol dateert van 1992 13 en werd oorspronkelijk beschreven door de groep van Ralph M. Steinman (1943-2011), ontdekker van de dendritische cel 14.
  2. In het kort, extraheren scheenbeen en kuitbeen snel na offeren muizen. Werken onder de laminaire stroming kap (om microbiële contaminatie te voorkomen), spoelt het beenmerg in een kleine petrischaal met wasmedium (5% FBS, 1% penicilline / streptomycine en 1% HEPES in RPMI) 12.
  3. Breng de celsuspensie door middel van een cel strainer (100 um maaswijdte, nylon) in een steriele 50 ml centrifugebuis om bot en overgebleven weefsel te verwijderen. Na verschillende wassen stappen en een lysisstap 12, tel de levensvatbare cellen met behulp trypanblauw en een hemocytometer.
  4. Resuspendeer beenmergcellen in een concentratie van 400.000 cellen ml-1 in kweekmedium (RPMI gesupplementeerd met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine, 1% HEPES en 1% L-glutamine) met 75 ng ml-1 van de muis granulocyt macrofaag-kolonie stimulerende factor (MGM-CSF) verkregen uit supernatanten van 293FT HEK cellen getransfecteerd met een plasmide muis GMCSF. Breng 10 ml van de celsuspensie (4 x 10 6 cellen) in petrischalen (100 mm x 20 mm) en geïncubeerd in een CO2 incubator (37 ° C, 5% CO2). Op dag 3, aanvullen oude medium met 10 ml vers medium (het houden van eind concentratie van mgm-CSF bij 75 ng ml -1). Op dag 6, verwijder 10 ml oude medium en aan te vullenmet 10 ml vers medium (MGM-CSF eindconcentratie = 75 ng ml -1). Op dag 8, verwijder 10 ml oude medium en aan te vullen met 10 ml vers medium (MGM-CSF eindconcentratie = 150 ng ml -1).
  5. Op dag 10, rijpen de gedifferentieerde DC met 1 ug ml -1 lipopolysaccharide (LPS) voor 24 uur.

2. Labeling van dendritische cellen met 19 F-rijke deeltjes

  1. Tijdens de 24 uur rijping stap (1.5), het etiket van de DC met 1 mM fluor-rijke perfluoro-15-kroon-5-ether (PFCE) deeltjes (500-560 nm) ook voor 24 uur. Bereid grote fluor-gelabelde deeltjes door emulgeren PFCE in Pluronic F-68 (totaal volume 2,5 ml) met behulp van een mobiele verstoren titanium sonotrode en met gebruikmaking van een doorlopende impulsprogramma (amplitude 100%, vermogen = 250 W) gedurende 60 sec.
  2. Gezien het bovenstaande incubatiestappen, oogsten de volwassen en fluor-gelabeld DC met een weefselkweek celschraper, overdracht in een 50 ml centrifugebuis en centrifugeerbij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Te wassen overgebleven deeltjes en dode cellen, laat geoogste cellen te hechten aan poly-L-lysine gerechten. Ter voorbereiding van deze stap, laag petrischalen met poly-L-lysine (1 mg ml-1) bij 37 ° C gedurende 1 uur, daarna wassen van de gebonden poly-L-lysine met PBS.
  4. Incubeer hierboven geoogste cellen op de poly-L-lysine beklede platen in serum-vrij medium en laat cellen hechten (1 uur bij 37 ° C, 5% CO2).
  5. Afwassen de middellange tot niet-hechtende cellen, overgebleven deeltjes en dode cellen weg te gooien en drie keer wassen met voorverwarmde (37 ° C) PBS.
  6. Harvest hechtende cellen door trypsine-EDTA-behandeling (0,25% trypsine-EDTA, 3 min incubatie bij 37 ° C).
  7. Na een wasbeurt centrifugefase resuspendeer de benodigde hoeveelheid rijpe DC in serum-vrij steriel PBS.
  8. Om te bepalen of de cellen met succes zijn bestempeld, is het raadzaam om de physicoche controlerenmical eigenschappen van de cellen met behulp van stromingscytometrie (FACS). De zijwaartse verstrooiing (SSC) moet meer granularity openbaren deze cellen, zoals eerder beschreven 11. Het moet ook in gedachten worden gehouden dat fibroblasten kunnen besmetten de DC culturen en kon ook het nemen van de 19 F deeltjes parallel. Daarom moet de DC zuiverheid wordt bepaald (door meting van het percentage van CD11c + CD11 b + cellen met FACS) voor in vivo toepassing.

3. In vivo toepassing van 19F-gelabelde dendritische cellen

  1. Dien DC (10 juni-10 juli) in een volume van 50-100 pi intracutaan in de achterste ledematen van een C57BL / 6 muis door het plaatsen van de muis in een houder en zorgvuldig plaatsen van een 26 ½ G naald in de bovenste lagen van de huid vóór toepassing (gebruik 0,5 ml tuberculine spuiten met permanent-ingeschreven naalden om dode volume te minimaliseren). Om een ​​te garanderenn passende intracutane applicatie, is het belangrijk dat het ingevoegde gedeelte van de naald gedeeltelijk zichtbaar onder de huid. Als de naald is niet meer zichtbaar, is de naald al te diep ingebracht in de huidlagen. Voor het ongetrainde persoon, kan de intracutane aanvraag worden uitgevoerd onder narcose.
  2. Afbeelding van de ledematen door in vivo fluor (19 F) / proton (1H) MRI (zie volgende paragraaf) 21 uur na de injectie.

4. In Vivo 19 F / 1 H Magnetic Resonance Imaging

De gedetailleerde instructies voor het instellen van de MRI-scans hebben betrekking op een Bruker MR-scanner met behulp van de besturingssoftware Paravison (versie 5.1). Benamingen die verwijzen naar specifieke vendor functies en items zijn gemarkeerd cursief. Voor andere MR-scanners deze stappen eventueel moeten worden aangepast volgens de richtlijnen van de fabrikant.

  1. Schik de toegang tot een specialeklein dier MR-scanner. Voor een adequate beeldkwaliteit, een systeem met een magnetische veldsterkte van 9,4 Tesla of meer en op maat radiofrequentie spoelen (bv. 1 H / 19 F dual-afstembare volume RF-spoel, 35 mm binnendiameter, 50 mm lengte; Rapid Biomed, Würzburg, Duitsland) worden aanbevolen.
  2. Voorafgaand aan MRI, bereiden de setup van de MRI-scanner voor anesthesie en fysiologische monitoring. Zorg ervoor dat de ademhaling masker van het dier bed / houder is aangesloten op de isofluraan systeem en dat de temperatuursensor en de ademhaling pad zijn aangesloten op een remote monitoring-systeem van dieren (bijv. Model 1025, SA Instruments Inc, New York, USA). Deze laatste dient om vitale parameters van het dier zoals lichaamstemperatuur en ademhaling controleren.
  3. Verdoven muizen door inhalatie narcose met een muis kamer aangesloten op een isofluraan systeem. Stel het debiet van lucht-en O 2 bij 0,2 L min -1 en 0,1 L min -1, respectievelijken 3% isofluraan (aangepast van een verdamper) gedurende ongeveer 2 minuten totdat het vereiste niveau van de anesthesie is bereikt (geen reactie volgt teen knijpen). Optimale debieten kunnen variëren afhankelijk van de configuratie wordt gebruikt. Wees ervan bewust dat een groot debiet zou kunnen leiden tot uitdroging. Een zorgvuldige controle van de voorwaarden van de dieren is te allen tijde vereist zoals hierboven vermeld.
  4. Plaats de muis gevoelig op de muis bed / houder van het kleine dier MR scanner (figuur 1).
  5. Terwijl het debiet voor de lucht-en O 2 constant, passen de isofluraan vaporizer tot 0,8-1,5% tot een optimale ademhaling wordt bereikt. Een ademfrequentie van 50-70 ademhalingen per minuut is aanbevolen.
  6. Houd de lichaamstemperatuur bij 36-37 ° C gedurende het experiment door het gebruik van een warm water (of als alternatief warme lucht) circulatiesysteem.
  7. Houd de ogen van de muis vochtig met steriele oog smerende zalf tijdens de meting.
  8. Na het veiligstellen van het dierhet grafisch houder en de verbindingen met het controlesysteem, verplaats de houder naar het midden van de 1 H / F 19 RF spoel (dat is gepositioneerd aan het isocentrum van het dier magneet scanner).
  9. De positie van de muis, zodat de knie zich in het isocentrum van de magneet, of met een geautomatiseerde methode (bijv. met een positionering laser in combinatie met een motor aangedreven dier houder) of door handmatig berekenen van de afstand worden verplaatst de houder moet in de magneet te bereiken de isocentrum.
  10. Voor bevestiging van de juiste positionering van het dier in de scanner en later de planning van het beeld slice geometrie (dwz grootte, positie en rotatie in de ruimte), verwerven scout afbeeldingen in drie standaard oriëntaties (axiaal, coronaal, sagittaal) image snelle en lage resolutie met behulp van acquisitie methoden (bv. TriPilot protocol, dat een FLASH pulssequentie gebruikt).
  11. Stem de RF-spoel om de 1H resonantie frequentie (bv.. 400,1 MHz voor 9,4 T) en de 19F resonantiefrequentie (bijv. 376.3 MHz voor 9,4 T) en overeenkomen met de karakteristieke impedantie van de spoel 50 Ohm met de tuning beeldscherm van het dier MR scanner. Tuning en matching is noodzakelijk om de optimale condities voor transmissie en ontvangst bereiken.
  12. Voer de nodige automatische systeem instellingen inclusief shimming te fine-tunen van de homogeniteit van het magnetisch veld (bijv. ADJ_SHIM), systeem frequentie aanpassingen aan de RF afstemmen op de Lamor frequentie van de muis (bv. ADJ_SF) en verwijzing krijgen naar de RF amplitude (passen bv ADJ_REFG). Al deze instellingen zijn belangrijk voor de statische en variabele magnetische velden (B 0, 1 B) maken in het gebied van belang zo homogeen mogelijk.
  13. Verwerven van een tweede reeks verkenningsbeelden (zoals hierboven) langs de drie orthogonale richtingen, na het gezichtsveld (FOV) zodat beide onderste ledematen ar hebben aangepaste zichtbaar van het bekken naar voet (LxBxH = 50X25X25 mm). Deze beelden dienen om de oriëntaties van de uiteindelijke 3D 1/19 H F scans te plannen.
  14. Het opzetten van een TurboRARE 3D protocol voor 1H-scan: TR / TE = 1500/53 msec, FOV = 50X25X25 mm, Matrix = 400x200x200, ZELDZAME Factor = 16 (. Scantijd ca. 60 min). Pas FOV met de hulp van de scout beelden, start de scan (stoplicht).
  15. Laad een enkele puls FID-sequentie met een TR van minstens 1.000 msec. Open bewerken scannen en stel kern naar 19 F. Gebruik handmatige versterkingsinstellingen door de selectie van de automatische verwijzing winst in de Edit Methode van de Toolbox.
  16. Start meting zonder het registreren van gegevens om een MR-signaal in real-time weergeven met behulp van SAP (ga setup). Als de 19 F spectrale signaal binnen het venster overname te laag is, voeg meer gemiddelden in Edit Method en / of die de puls verzwakker (TX0 of SP0 schuifregelaar) tot een signaal duidelijk zichtbaar. Bepaalt de basisfrequentie om midden de 19 F spectrale piek bij 0 Hz in het venster overname. Breng fundamentele frequentie en druk op Stop. Merk op dat de isofluraan gebruikt als verdoving een achtergrond signaal kan genereren. Bij 9,4 Tesla MRI de chemische verschuiving tussen de 19F-bevattende deeltjes en isofluraan is ongeveer 1800 Hz. Zorg ervoor dat de excitatie bandbreedte is kleiner dan 3600 Hz om spannende de isofluraan samen voorkomen met de 19 F-gelabelde cellen of deeltjes. De basisfrequentie moet correct zijn ingesteld op het signaal gegenereerd door de 19 F-gelabelde cellen. Als alternatief zou een andere werkwijze anaesthesie worden gebruikt als de experimentator goeddunken.
  17. Clone (duplicaat) de TurboRARE 3D-protocol van de vorige 1H scan. Ga naar methode en schakel de automatische referentie-gain (zoals hierboven) bewerken. Set 19 F kern van Bewerken Scan. Verander de matrix 128x64x64en RARE-Factor ten minste 40 (tot 64). Voor een TR / TE 1000/6 msec en 64 gemiddelden, de scan duurt ongeveer 70 minuten. Stel de ontvanger winst tot 101 (gereedschapskist) en start de scan zonder verdere aanpassingen aan met GOP (ga pipeline).
  18. Wanneer de scans klaar zijn trekken met de muis houder van de MR-scanner. Ontkoppel de muis voorzichtig uit de houder. Als de muis niet wordt opgeofferd voor ex vivo analyse (bijv. histologie of spectroscopie, zie hieronder) direct na de MR metingen, nauwlettend volgen totdat deze volledig is hersteld van anesthesie. Lichaamstemperatuur regeling wordt beïnvloed door de narcose, zodat tijdens het herstelproces, zet de muis in een aparte kooi die wordt geplaatst op een warme temperatuur-gereguleerde pad. Zodra de muis volledig is hersteld van anesthesie, dit terug in de kooi en het dier kamer.
  19. Om de 19 F afbeeldingen om 1H beelden overlappen, gebruikt u de menu Beeld option op dezelfde software (Paravison). De Onderstroom functie is te vinden onder correleren. Sla de onderlaag, laadt de nieuwe afbeelding en markeer de 19 F-laag door het definiëren van een nieuwe kleur uit de Look Up Table. Om onderscheid te maken tussen de 19 F en 1 H scans, veranderen de drempel voor de gekozen kleur (cut Look Up Table), zodanig dat het 19 signaal F de de achtergrond H afbeelding 1 gekozen kleur en zullen hebben in grijstinten blijven. Andere post-processing programma's (bijvoorbeeld ImageJ) zijn beschikbaar om de 1 H / 19 F beeldoverlays creëren.
  20. Dient een in vivo kwantificatie van de 19 F-signaal nodig zijn, volgen een eenvoudige kwantitatieve protocol zoals eerder beschreven 15,16. In het kort, kan kwantificering worden uitgevoerd door een referentiebuis met een bekende concentratie van PFCE-emulsie binnen het ZV naast de muis. Na het verwerven van de MR-beelden, quantify de intensiteiten van de signalen met behulp van 19F-gebied van belang (ROI) analyse en vergelijken met de in vitro kalibratiekromme figuur 2.

5. Lymfkliertest Magnetische Resonantie Spectroscopie (MRS)

  1. Na het opofferen van de muis, verwijder de knieholte lymfeklier en doe dit in een kleine 5 mm NMR-buis en voeg 100 ul van 2% PFA.
  2. Installeer een 19 F spectroscopie spoel (bijv. een ringkern spoel) die een opening van ten minste 5 mm voor het houden van de NMR-buis met de lymfeklieren heeft.
  3. Plaats de NMR-buis in de spoel en zet de spoel in de isocentrum van de magneet.
  4. Stem de RF spoel de 19F resonantiefrequentie (bijv. 376.3 MHz voor 9,4 T) en overeenkomen met de karakteristieke impedantie van de spoel 50 Ohm met de tuning beeldscherm van het dier MR scanner. Tuning en matching is noodzakelijk om de optimale condities voor transmissie en signaal bereikenontvangst.
  5. Zet alle shim parameters binnen de shimming Toolbox op 0 en drukt toepassing. Meestal is het niet nodig vulplaten methoden van toepassing, aangezien het volume van het monster is relatief klein. Als een voldoende 19 signaal F is, kan geautomatiseerde werkwijzen worden toegepast vulplaten, netfrequentie en ontvangerversterking zoals hierboven beschreven.
  6. Laad een enkele puls FID sequentie met een TR van minstens 1.000 msec. Open Scan Bewerken en stel de kern tot 19 F. Gebruik handmatige versterkingsinstellingen door de selectie van de automatische verwijzing winst in de Edit Methode van de Toolbox. Stel het aantal gemiddelden naar 1.
  7. Start de reeks met behulp van SAP. Als de 19 F spectrale signaal binnen het venster overname te laag is, voeg meer gemiddelden in Edit Method en / of die de puls verzwakker (TX0 of SP0 schuif) totdat een signaal is duidelijk zichtbaar. Bepaalt de basisfrequentie, zodat de 19 F spectral piek is in het midden van het venster overname bij 0 Hz en toepassen basisfrequentie. Pas weer de pols verzwakker om het signaal, tot 90 ° excitatie bereiken maximaliseren. Wanneer het signaal is op maximale druk op Stop.
  8. Stel de gemiddelden in de Edit Methode tussen 64 en 256 (of meer indien nodig, afhankelijk van het signaal) en start de acquisitie met behulp van GOP. Het gedetecteerde signaal lineair correleert met het aantal gemiddelden. Tijdens kwantificering in gedachten houden dat het gedetecteerde signaal moet worden genormaliseerd op een gemiddelde. Verder kalibratiestandaard van een bekende concentratie of een ijkkromme moet het aantal cellen van de 19 genormaliseerde signaal F (figuur 2) te berekenen.
  9. Zodra de scan is voltooid, verwijdert u het monster, plaatst u het volgende monster en ga verder met stap 5.3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Achttien tot eenentwintig uur na intracutane toepassing, 19 F-gelabelde dendritische cellen (DC) migreren naar de afvoerende knieholte lymfeklier. De beweging van DC via de lymfevaten naar de drainerende lymfeklier politeal duidelijk zal zijn overlappen de 1H anatomische beelden met 19F DC beelden (Figuur 2A). We hebben eerder gerapporteerd voor de migratie van deze cellen in vivo, alsook de invloed van 19F-deeltjesgrootte op DC immunobiology, inclusi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode van toepassing van 19 F / 1 H MRI om de beweging van DC te volgen in de lymfeklier geeft de mogelijkheid om de migratiepatronen van immuuncellen in vivo bestudeerd. Dendritische cellen zijn uitstekende voorbeelden van snel migreren immuuncellen die in staat zijn door middel van drie-dimensionale structuren te manoeuvreren zonder goed hechtende specifieke substraten 17. Hoewel de lage ruimtelijke resolutie (micrometer bereik) van de beschreven techniek is niet vergel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft naar SW (DFG WA 2804) en een universitaire subsidie ​​aan SW van de Experimentele en Klinische Research Center, een samenwerking van het Max Delbrück Centrum voor Moleculaire Geneeskunde en Charite Medische Faculteit in Berlijn. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, dataverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript. Wij danken de heer Robert Westphal voor technische ondersteuning tijdens zijn stage in ons laboratorium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
REAGENTS
C57BL/6 muizenCharles River, Berlijn
RPMIGibco21875-091
FBS SuperiorBiochrom AGS 0615
HEPESGibco-Invitrogen15630-056
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
L-glutamineGibco25030-024
Dulbecco's PBSSigma AldrichD8662
PFASanta Cruzsc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether ChemPur391-1996
Pluronic F-68 Sigma AldrichP5556
Petrischalen (35 x 10 mm)VWR, Duitsland391-1996
27 ½ G spuitenVWR, Duitsland612-0151
Nylon cel zeef (100 μm maaswijdte) VWR, Duitsland734-0004
NMR buizen VWR, Duitsland634-0461
APPARATUUR
DissectiegereedschapFST
CO2 incubator Binder
Klein dier MR systeemBruker Biospin9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisitie en Verwerking Software
1H/19F dubbel-afstelbare volume RF spoel Rapid Biomed, Würzburg, Duitsland35 mm binnendiameter, 50 mm lengte
19F spectroscopie spoel in-houseafstem/match loop spoel, 4 slagen, binnendiameter 5 mm, 10 mm lang, twee condensatoren voor afstemmen en matchen
Isofluraanhalinatie systeemFöhr Medical Instruments GmbH
Dier bewakingssysteem Model 1025SA Instruments Inc., New York, USA

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).
  2. Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging. J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).
  3. Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain. NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).
  4. de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).
  5. Liu, W., Frank, J. A. Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI. Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).
  6. Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).
  7. Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. F-19 Magnetic-Resonance Imaging. Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).
  8. Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. 19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons. FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).
  9. Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. In vivo "hot spot" MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles. Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).
  10. Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).
  11. Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells. PLoS ONE. 6 (7), e21981(2011).
  12. Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773(2008).
  13. Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  14. Lanzavecchia, A., Sallusto, F. Ralph M. Steinman. 1943-2011. Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).
  15. Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F. MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).
  16. Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. (19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).
  17. Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  18. Liu, M. S., Long, D. M. Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography. Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).
  19. Kwiatkowska, K., Sobota, A. Signaling pathways in phagocytosis. Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).
  20. Mitragotri, S., Lahann, J. Physical approaches to biomaterial design. Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).
  21. Hoult, D. I., Richards, R. E. The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment. J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).
  22. Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).
  23. Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy. PLoS ONE. 7 (3), e32796(2012).
  24. Haacke, E. M. Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , John Wiley & Sons. (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluor MRIperfluorcarbon markeringflowcytometrieprotonen MRIbeeldvorming van lymfeklierenceltrackingmagnetische resonantiespectroscopiefluor spectroscopieMRI scanner voor dieren

Gerelateerde artikelen