Zebravis zijn een opkomende systeem voor het modelleren van menselijke aandoeningen van de skeletspieren. We beschrijven een snelle en efficiënte methode om skeletspier myovezels isoleren van embryonale en larvale zebravis. Deze methode levert een high-density myofiber voorbereiding geschikt voor onderzoek met een enkelvoudige skeletspieren vezelmorfologie, eiwit lokalisatie, en spier-fysiologie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van de embryonale en larvale zebravis Skeletal myovezels van Gedissocieerde Voorbereidingen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De zebravis heeft zich bewezen als een waardevol model systeem voor het verkennen van de skeletspier functie en voor het bestuderen van menselijke spierziekten. Ondanks de vele voordelen van in vivo analyse van de skeletspier bij de zebravis, visualiseren het complex en fijn gestructureerde eiwitten milieu belast spierfunctie, vooral gehele embryo, kan problematisch zijn. Deze belemmering vloeit voort uit de geringe omvang van de zebravis skeletspieren (60 micrometer) en de nog kleinere omvang van de sarcomeer. Hier beschrijven we en demonstreren van een eenvoudige en snelle methode voor het isoleren van het skelet myovezels van zebravis embryo's en larven. We hebben ook protocollen die post voorbereiding technieken bruikbaar voor het analyseren van de spier structuur en functie te illustreren. Concreet, we detail de daaropvolgende immunocytochemische lokalisatie van de skeletspieren eiwitten en de kwalitatieve analyse van de gestimuleerde calcium vrijstelling via live cell imaging calcium. Over het algemeen, deze videoartikel geeft een ongecompliceerde en efficiënte methode voor het isoleren en karakteriseren van zebravis skelet myofibers, een techniek die een groot kanaal voor verdere studies spier structuur en functie verschaft.
Inleiding
Skeletspier is een zeer gespecialiseerde weefsel verantwoordelijk zijn voor het genereren van de contractiele krachten die nodig zijn voor de beweeglijkheid. Contractie wordt geïnitieerd via een proces dat bekend staat als excitatie-contractie (EC) koppeling die elektrische signalen omzet naar calcium vrijlating uit intracellulaire opslagplaatsen 1,2. Intracellulair calcium vrijlating activeert de sarcomeer in te korten en het genereren van kracht. De vele specifieke onderdelen van de moleculaire machines die verantwoordelijk is voor het bemiddelen neuromusculaire verbinding transmissie 3, EG-koppeling 4,5, en actine-myosine afhankeli....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van poly-L-lysine gecoate dekglaasjes (: 1 uur)
Coating coverslips zorgt voor een snelle myofiber bezinking en adhesie. Dit kan worden uitgevoerd tijdens de dissociatie stap van de myofiber isolatie (stap 2).
- Knip en plaats Parafilm op de bodem van een 60 mm petrischaal (elk merk).
- Plaats microscoop afdekglas slips (12 mm diameter) op Parafilm in een 60 mm weefselkweek schotel en leg ze niet afzonderlijk in enkele putjes van 24-well platen.
Opmerking 1: Deze kleine ronde dekglaasjes helpen om myofiber nummers concentreren en overmatige gebruik antilichaam verminderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Fluorescerende immunolabeling van myofibers (figuur 2)
Beelden die verwacht fluorescentielabelling patroon van myovezels immunostained na succesvolle isolatie en beplating. De spiervezels zijn gemerkt met ofwel anti-ryanodine receptor (1:100) (Figuur 2A) of anti-α-actinine (1:100) (Figuur 2B) antilichamen, respectievelijk onthullen immunokleuring van de triade en de Z-band. Secundaire antilichamen gebruikt waren Alexa Fluor 555 (1:5.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Zebravis zijn een krachtig gewerveld modelsysteem voor het bestuderen spierontwikkeling en functie in vivo 25,27,28. Ze hebben ook naar voren gekomen als een waardevolle aanwinst voor het modelleren van de menselijke spierziekten 14,15,20,29. Terwijl grote stappen zijn genomen om het gebruik en de toepassing van de zebravis voor de studie van de spierfunctie en spierziekte te bevorderen, is er een constante kritieke behoefte aan tools die meer diepgaande analyse die de genetische, morfolog.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de leden van de Dowling lab (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, en William Telfer) die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van de techniek en de productie van het manuscript bedanken. Dit werk werd gefinancierd door de Taubman Instituut, de afdeling Kindergeneeskunde aan de Universiteit van Michigan, en voor een deel uit subsidies van de Vereniging van de Spierdystrofie (JJD MDA186999) en de National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 24-wells kweekplaat | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Onafhankelijk medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Schapenserum | Sigma | S3772 | |
| Geitenserum | Sigma | G9023 | |
| Glazen dekglasjes | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagens | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antilichaam | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antilichaam | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antilichaam | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri-schaal | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscoopglas | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeïne | Sigma | C0750 |
Referenties
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
