$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Bevestiging
Fixatieven zijn kankerverwekkend, draag handschoenen en omgaan met de fixeermiddelen in een zuurkast. Tenzij anders vermeld, zijn alle incubaties uitgevoerd op ijs en alle oplossingen worden gefiltreerd voor gebruik. Gebruik elektronenmicroscopie-grade reagentia.
Dag 1
- Na experimentele omstandigheden (bijv. virale injectie, drugsbehandeling) moet het membraan met organotypische hippocampus plakken in een 60 x 15 mm polystyreen petrischaal met ijskoude 0,1 M fosfaatbuffer (Sorensen's fosfaatbuffer), pH 7,3. Voeg 1 - 2 ml 0,1 M fosfaatbuffer direct op de plakken te houden koud.
Cruciale stap: Gebruik altijd vers bereid buffers en fixatieven. Controleer of de pH van de buffer binnen gewenste bereik. Een niet te doen zou kunnen beschadigen cellulaire structuren.
- Om de CA1 deelgebied van de slice te isoleren, gebruik dan eenwegwerpbistouri voorzichtig dwars het segment naast de DG, evenwijdig aan de CA1 cellaag (Figuur 1). Snijd vervolgens de resterende segment verticaal om de CA3 deelgebied en de subiculum verwijderen. Snij een hoek van het segment helpen om het bovenvlak van het weefsel.
OPMERKING: Bij geen virale afgifte van eiwit van belang wordt vereist, het gehele weefsel slice kan worden vastgezet nadat de media verwijderd met een zachte spoelen ijskoude buffer. Dit wordt dan gevolgd door het uitsnijden van de CA1.
Kritische stap: Houd de bovenzijde van het weefsel zodat goede snijden van de roosters later.
- Verwijder het weefsel van het membraan met de achterkant van de scalpel. Gebruik een Pasteur pipet om het weefsel voorzichtig naar een 12-well plaat die 0,1 M fosfaatbuffer.
- Verwijder de buffer in de put van de plaat en voeg 500 & mu; l - 1 ml ijskoude fixatief (pH 7,3) bestaande uit: 0,1% picrinezuur, 1% paraformaldehyde en 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer. Incubeer gedurende 2 uur bij 4 ° C.
OPMERKING: Picrinezuur kunnen explosief zijn als het droog. Houd het bevochtigd met water in een goed gesloten verpakking bewaren. Bewaar op een droge en goed geventileerde plaats bewaren.
- Verwijder het fixeermiddel uit de put en spoelmonsters 3 keer (20 min elk) in 0,1 M fosfaatbuffer.
- Incubeer gedurende 40 min in 1% looizuur (w / v) in 0,1 M maleaat buffer, pH 6,0.
- Twee keer spoelen (20 min elk) in maleaat buffer.
- Incubeer gedurende 40 min in 1% uranylacetaat (w / v) in maleaat buffer in het donker. Uranylacetaat is gevoelig voor licht en is radioactief. Dek het bekerglas af met Parafilm bij het oplossen en Bewaar ongebruikte buffer in het donker bij 4 ° C.
- Twee keer spoelen (20 min elk) in maleaat buffer.
- Incubeer gedurende 20 min in 0,5% platina chlooride (w / v) in maleaat buffer.
- Twee keer spoelen (20 min elk) in maleaat buffer. Bewaar de monsters bij 4 ° C tot ze klaar voor verdere verwerking.
2. Uitdroging en Embedding
Propyleenoxide is kankerverwekkend. Vermijd dampen door te werken met het in een zuurkast. Gebruik absoluut, 100% pure ethanol, dat geen spoor van water bevat. Verdun deze absolute ethanol bij verschillende concentraties produceren voor uitdroging.
Dag 2
- Incubeer gedurende 5 min in 50% ethanol en gedurende 5 min in 70% ethanol.
- Incubeer gedurende 15 min in vers bereide 1% p-fenyleendiamine (PPD) in 70% ethanol.
- Driemaal spoelen in 70% ethanol.
- Incubeer gedurende 5 min in 80% ethanol en gedurende 5 min in 95% ethanol.
- Incubeer in 100% ethanol tweemaal 5 min elk.
- Bereid glazen flacons met schroefdop en zorg ervoor dat ze schoon en helemaal droog zijn. Overdracht plakjes om glazen flesjes enbenoem elke flacon eenvoudig en duidelijk.
- Incubeer gedurende 5 min in 1:1 ethanol: propyleenoxide.
- Incubeer in 100% propyleenoxide tweemaal 5 min elk.
- Voeg hars (Epon) aan elk flesje een 1:1 mengsel met propyleenoxide maken. Meng gedurende 2 uur. Schud de flacons te rigoureus om te bellen die kunnen interfereren met inbedding te voorkomen.
- Voeg hars een 3:1 mengsel met propyleenoxide, en meng gedurende 2 uur maken.
- Overdracht naar 100% hars en incubeer O / N.
Dag 3
- Sandwich monsters tussen stroken ACLAR plastic en genezing gedurende 24 uur bij 60 ° C.
3. Snijden en montage op grids
Dag 4
- Snij semi-dunne (0,5 um) secties en vlek met 1% toluidineblauw + 1% borax de juiste oriëntatie van monsters te bepalen.
- Snijd ultradunne secties (60 nm) en op nikkel roosters, een sectie per grid.
4. Immunohistochemie
Alle buffers en water worden gefilterd voor gebruik.
Dag 5
- Breng een druppel (~ 50 pi) van 1% Tween-20/phosphate buffer (T / PB), pH 7,5, op een schoon stuk Parafilm op een vlakke ondergrond. Voorzichtig ophalen rooster met schone pincet door de rand en drijven op de buffer, gedeelte neer en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
- Afvoer overtollige vloeistof uit het net door het plaatsen gedeelte boven op papierfilter en drijven op 50 mM glycine in T / PB 15 minuten bij RT.
Cruciale stap: Om te voorkomen dat overmatig 'carry-over' van oplossingen van de ene oplossing druppel naar het volgende tijdens de incubaties, overtollige vloeistof weglopen door voorzichtig tegen de rand van het rooster op # 1 filtreerpapier tussen elke oplossing verandering. Verwijder ook een oplossing gevangen tussen de armen van de EM pincet houdt het net door zachtjes wicking met een langgerekte strook filtreerpapier tussen de tang armen terwijl ensuring de secties hoeven niet volledig uitdrogen.
- Droog het rooster met filtreerpapier en drijven op blokkeeroplossing die 2,5% BSA en 2,5% serum van het dier van het secundaire antilichaam in T / PB gedurende 30 min bij RT.
- Incuberen met primair antilichaam (in T / PB) bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. De optimale tijd en temperatuur van incubatie en antilichaamconcentratie, moet experimenteel bepaald.
- Was het net drie keer (2 min elk) met T / PB.
- Incuberen met secundair antilichaam (1:20 anti-konijn of anti-muis gekoppeld aan 10 nm goud) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was het residu driemaal (2 min elk) met T / PB.
- Postfix met 2% glutaaraldehyde in T / PB gedurende 5 minuten.
- Was driemaal (2 min elk) T / PB en vervolgens driemaal (2 min elk) met gefilterd water.
- Incuberen met 2% uranylacetaat in water gedurende 10 minuten.
Terwijl het net vlekken, bereiden een CO 2-vrije kamer door placinga stuk Parafilm in het midden van een glazen petrischaal. Leg 4-6 pellets van NaOH in de schaal rond de Parafilm om CO2 te absorberen in de lucht. Houd de top gesloten enkele minuten. Gebruik een Pasteur pipet en zo snel mogelijk een kleine hoeveelheid lood citraatoplossing Reynolds de Parafilm in de glazen petrischaal. Open de bovenste net genoeg om het Pasteur pipet te voegen aan de herintroductie van CO 2 te beperken in de kamer.
OPMERKING: Om loodcitraat Reynold's oplossing te maken, 100 ml gedeïoniseerd water te koken in een magnetron en koel in een luchtdichte container te laten. In een 50 ml maatkolf met stop, mix 1,33 g loodnitraat, 1,76 g natriumcitraat en 30 ml water gekookt door schudden gedurende 1 minuut. Dan tussenpozen schudden gedurende 30 minuten. Deze troebele oplossing, voeg 8 ml 1 M natriumhydroxide en langzaam draaien de kolf enkele keren. Oplossing zal duidelijk worden. Breng de oplossing tot 50 ml met het verhitte water. Bewaar de oplossing goed afgesloten. Als neerslag ontstaat weg te gooien en een nieuwe maken.
- In drie kleinere bekers te bereiden warme, vers gekookt gedeïoniseerd water. Was de uranylacetaat door dompelen het net in de eerste beker en voorzichtig draai hem rond voor 30 sec. Herhaal deze stap in de andere twee bekers.
- Open de bovenkant van de glazen petrischaal net genoeg om het raster te plaatsen op de druppel loodcitraat oplossing Reynolds. Indien mogelijk, draag een masker terwijl je dit doet om de ademhaling op loodcitraat te voorkomen en om de vorming van neerslag te voorkomen. Incubeer gedurende 10 minuten.
- Open de bovenste net genoeg om het rooster te verwijderen. Vermijd inademen van de loodcitraat. Was het net drie keer door dompelen achtereenvolgens in drie bekers met warme, vers gekookt gedestilleerd water. Laat het rooster drogen op een stukje filtreerpapier, sectie omhoog. Het monster kan nu de elektronenmicroscoop.