High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Samenvatting

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

Samenvatting

We presenteren een snelle en goedkope high-throughput screening protocol transcriptionele regulatoren van alfa-synucleïne, een gen geassocieerd met de ziekte van Parkinson te identificeren. 293T cellen transient getransfecteerd met plasmiden uit een array ORF expressiebibliotheek, samen met luciferase reporter plasmiden in een gen-per-well microplate format. Vuurvlieg luciferase activiteit bepaald na 48 uur om de effecten van elke bibliotheek gen op alfa-synucleine transcriptie, genormaliseerd op de expressie van een interne controle construct (een hCMV promoter Renilla luciferase) bepalen. Dit protocol wordt vergemakkelijkt door een tafelmodel robot ingesloten in een bio kast, die aseptisch vloeistofverwerking in 96-well formaat uitvoert. Onze geautomatiseerde transfectie protocol gemakkelijk aanpasbaar voor hoge-doorvoer lentivirale bibliotheek productie of andere functionele screening protocollen ter drievoudige transfecties van grote aantallen unieke bibliotheek plasmiden conjuncties met een gemeenschappelijke set van helper plasmiden. Presenteren we ook een goedkoop en gevalideerd alternatief voor in de handel verkrijgbare, dual luciferase reagentia die PTC124, EDTA, en pyrofosfaat te vuurvliegluciferase activiteit onderdrukken voorafgaand aan de meting van Renilla luciferase telt. Met behulp van deze methoden, gescreend we 7670 menselijke genen en geïdentificeerd 68 regulatoren van alfa-synucleïne. Dit protocol is gemakkelijk aanpasbaar aan andere genen van belang te richten.

Inleiding

De mogelijkheid om belangrijke genetische regulerende elementen en de factoren die inwerken op hen te identificeren is fundamenteel voor de exploratie van talrijke biologische processen. Echter, het identificeren van factoren die de expressie van genen reguleren in zeldzame soorten cellen, zoals specifieke neuronale populaties, kan een uitdaging zijn. Hier presenteren we een protocol voor het identificeren van nieuwe transcriptionele regulatoren van alfa-synucleïne (SNCA), een gen geassocieerd met de ziekte van Parkinson en uitgedrukt in dopaminerge neuronen in de substantianigra pars compacta regio van de middenhersenen. We doen dit met behulp van een high-throughpu....

Protocol

Voor een experimentele overzicht, zie figuur 1.

1. Bereid Reporter plasmiden die de Alpha-Synuclein Promoter

Regelelementen van het alfa-synucleine gen (Figuur 2) omvatten ongeveer 10 kb, van de stroomopwaartse NACP (niet-A beta component van amyloïde peptide) dinucleotide herhalingssequentie ^1,2 tot intron 2 ^3. We nemen een deel van deze regio onze reporter construct. Wij vonden dat de plasmiden die intron 2 vereist speciale procedures voor de groei, zoals hieronder beschreven. De luciferase plasmiden, pGL4.10 en pGL4.75 (figuur 3), zijn c....

Resultaten

Typische luciferase waarden F: R verhoudingen en inductie waarden voor een halve plaat worden getoond in figuur 4 Merk de hit in goed H2, een 32-voudige inductor.. Genen veroorzaken overmatige toxiciteit (bijvoorbeeld goed E3), of putten die slecht werden getransfecteerd, zullen lage waarden voor zowel de vuurvlieg en Renilla luciferases produceren, maar een gemiddelde inductie waarde. Genen waardoor niet-specifieke inductie van luciferaseactiviteit, bijvoorbeeld via interactie met de .......

Discussie

Alpha-synucleïne is betrokken bij de ziekte van Parkinson (PD) als component van Lewy lichamen ^4, intracellulaire inclusies beschouwd pathognomonische voor de ziekte. Tal van genoom-brede associatie studies hebben single nucleotide polymorfismen gekoppeld aan alfa-synucleïne met een verhoogd risico voor sporadische PD ^5,6,7. Hoewel minder algemeen dan sporadische PD, kan familiale PD ook worden veroorzaakt door mutaties in alfa-synucleine ^8, en dubbel en triplicatie van de alfa-synucleïn.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materiaal
QIAQuick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR Micro Kit	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen	K2100-07
Bravo Robot	Agilent	-
Robot Pipet Tips with Filter	Agilent	19477-022
Robot Pipet Tips without Filter	Agilent	19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates	Corning	3610
Reservoirs	Axygen	RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651201
Adhesive Plate Covers	CryoStuff	#FS100
Reagens
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase	Roche	10713023001
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells	Invitrogen	11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265-017
DMEM without Phenol Red	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
Ciprofloxacin	CellGro	61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder	Sigma	93287
Tris-Base Powder	Sigma	93286
Triton X-100 Pure Liquid	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
C–nzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
Luciferin	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003