High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Samenvatting

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

Samenvatting

We presenteren een snelle en goedkope high-throughput screening protocol transcriptionele regulatoren van alfa-synucleïne, een gen geassocieerd met de ziekte van Parkinson te identificeren. 293T cellen transient getransfecteerd met plasmiden uit een array ORF expressiebibliotheek, samen met luciferase reporter plasmiden in een gen-per-well microplate format. Vuurvlieg luciferase activiteit bepaald na 48 uur om de effecten van elke bibliotheek gen op alfa-synucleine transcriptie, genormaliseerd op de expressie van een interne controle construct (een hCMV promoter Renilla luciferase) bepalen. Dit protocol wordt vergemakkelijkt door een tafelmodel robot ingesloten in een bio kast, die aseptisch vloeistofverwerking in 96-well formaat uitvoert. Onze geautomatiseerde transfectie protocol gemakkelijk aanpasbaar voor hoge-doorvoer lentivirale bibliotheek productie of andere functionele screening protocollen ter drievoudige transfecties van grote aantallen unieke bibliotheek plasmiden conjuncties met een gemeenschappelijke set van helper plasmiden. Presenteren we ook een goedkoop en gevalideerd alternatief voor in de handel verkrijgbare, dual luciferase reagentia die PTC124, EDTA, en pyrofosfaat te vuurvliegluciferase activiteit onderdrukken voorafgaand aan de meting van Renilla luciferase telt. Met behulp van deze methoden, gescreend we 7670 menselijke genen en geïdentificeerd 68 regulatoren van alfa-synucleïne. Dit protocol is gemakkelijk aanpasbaar aan andere genen van belang te richten.

Inleiding

De mogelijkheid om belangrijke genetische regulerende elementen en de factoren die inwerken op hen te identificeren is fundamenteel voor de exploratie van talrijke biologische processen. Echter, het identificeren van factoren die de expressie van genen reguleren in zeldzame soorten cellen, zoals specifieke neuronale populaties, kan een uitdaging zijn. Hier presenteren we een protocol voor het identificeren van nieuwe transcriptionele regulatoren van alfa-synucleïne (SNCA), een gen geassocieerd met de ziekte van Parkinson en uitgedrukt in dopaminerge neuronen in de substantianigra pars compacta regio van de middenhersenen. We doen dit met behulp van een high-throughput, dual-luciferase, in vitro reporter scherm om alfa-synucleïne expressie deconstrueren in 293T-cellen. De alfa-synucleïne promoter wordt eerst gekloneerd in een reporter plasmide dat het vuurvlieg luciferase gen. Een commercieel verkrijgbaar plasmide dat het Renilla luciferase onder controle van een constitutief actieve promoter fungeert als een interne controle. These reporter constructen worden co-getransfecteerd in 293T-cellen in microtiterplaten met plasmiden uit een DNA-expressie-bibliotheek, zodat elk putje getransfecteerd met een plasmide bibliotheek. Na 48 uur werd luciferaseactiviteit voor elke reporter achtereenvolgens gemeten met een dual-glans assay. De relatieve expressie van alfa-synucleïne voor iedere bibliotheek gen wordt afgeleid door de verhouding van vuurvlieg: Renilla luciferaseactiviteit in elk putje (F: R verhouding) na plaat gebaseerde normalisatie.

Dit protocol geeft de mogelijkheid om een ​​groot aantal genen (~ 2500 per week) screenen op hun vermogen om een ​​reportergen transactiveren met minimale mankracht (1-2 personen) en minimale kosten (ongeveer $ 3 reagens kosten per microtiterplaat test). Transcriptiefactoren van neuronale genen (bijvoorbeeld alfa-synucleïne), die moeilijk te bestuderen in gekweekte neuronen vuurvaste genetische manipulatie kan worden vergeleken side-by-side in deze directe functionele test. We nemen in onzeprotocol een gedetailleerde methode voor het klonen en de groei van plasmiden die de alfa-synucleïne promotor, omdat we vonden dat plasmiden die deze regio zijn instabiel wanneer ze groeien met conventionele procedures (zie Discussie). We gebruiken ook een goedkoop alternatief voor handel verkrijgbare dubbele luciferase reagentia voor high-throughput assays. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere regelelementen van belang richten, of voor een werkwijze die een hoge-doorvoer transiënte transfecties.

Protocol

Voor een experimentele overzicht, zie figuur 1.

1. Bereid Reporter plasmiden die de Alpha-Synuclein Promoter

Regelelementen van het alfa-synucleine gen (Figuur 2) omvatten ongeveer 10 kb, van de stroomopwaartse NACP (niet-A beta component van amyloïde peptide) dinucleotide herhalingssequentie ^1,2 tot intron 2 ^3. We nemen een deel van deze regio onze reporter construct. Wij vonden dat de plasmiden die intron 2 vereist speciale procedures voor de groei, zoals hieronder beschreven. De luciferase plasmiden, pGL4.10 en pGL4.75 (figuur 3), zijn commercieel verkrijgbaar van Promega en kan worden vermeerderd met behulp van conventionele moleculaire biologie protocollen.

1. Versterken de 2 componenten van het alfa-synucleïne promotor in afzonderlijke PCR's met het recept in tabel 1 en de primers in Tabel 2.
2. Verify PCR-producten op een agarose gel en schoon met de Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen), en geëlueerd in 50 pl TE (Tris-EDTA). Bewaar de geëlueerde 0,9 kb fragment bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.
3. Digest het gehele volume van het 3,4 kb PCR-fragment, en 5 ug pGL4.10 met SacI en XhoI. Behandel de vector met Kalf Darm alkalisch fosfatase (Roche) en gel te zuiveren met behulp van de PureLink Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen).
4. Ligeren fragment en de vector met T4 DNA ligase (NEB). Reinig de voltooide reactie met behulp van de PCR PureLink Micro kit (Invitrogen), eluting in 10 pi TE-buffer.
5. Transformatie 2 pi van de gereinigde, ligatiereactie in 20 ui ElectroMAX Stbl4 competente cellen (Invitrogen) en elektroporatie volgens de instructies van de fabrikant. Schud in een 30 ° C incubator bij 225 rpm gedurende 90 minuten. Spread 2 volumes op LB-platen bevattende 100 mg / ml ampicilline en incubeer bij 30 ° C gedurende 2 dagen.
6. Met behulp van een tandenstoker, selecteer 4-6 kleine kolonies voor enting in 2 ml van TB (Terrific Broth). Groeien deze miniprep culturen in een 30 ° C shaker O / N.
7. Zuiver plasmide-DNA van 1,5 ml van elk miniprep cultuur met behulp van de PureLink HiPure Plasmid Miniprep kit (Invitrogen).
8. Digest de minipreps met BamHI en Electrophorèse op een agarosegel. De correcte kloon moet fragmenten van 2,8 kb en 4,9 kb produceren.
9. Restreak de resterende miniprep cultuur van de juiste kloon op een verse LB (Luria Broth) plaat en groeien bij 30 ° C gedurende 2 dagen.
10. Selecteer een kleine kolonie en te enten een 1,5 ml TB zuursel. Schud O / N bij 30 ° C. Laat de starter cultuur groeien tot verzadiging.
11. Verdun de gehele starter cultuur in 150 ml voorverwarmd TB en schudden bij 30 ° C gedurende 2 dagen. Alvorens over te gaan naar de volgende stap, gebruik 1,5 ml van deze cultuur voor een extra miniprep en de spijsvertering te bevestigen dat de kloon niet muteren tijdens replicati op.
12. Zuiver plasmide DNA van de resterende cultuur met behulp van de PureLink HiPure Plasmid Maxiprep kit (Invitrogen). Verwachte opbrengsten van deze intermediaire plasmide zijn 50-150 mg per 150 ml van de cultuur.
13. Ontdooi de 0,9 kb fragment in stap 1.2 bevroren. Herhaal stap 1.3 tot 1.12 de 0,9 kb fragment te kloneren in de intermediaire plasmide digestie plaats met Kpnl en Sacl. Ligeer, transformeren, selecteren en kweken voor maxipreps als hierboven. Digestie met BamHI moet fragmenten van 5,8 kb en 2,8 kb opleveren. Dit is het plasmide dat wordt gebruikt voor het scherm.

2. Bereid 293T cellen, reporterplasmiden en Bibliotheek DNA voor Screening

293T cellen worden geënt in 96-well uitgeplaat en de volgende dag. Reporter plasmiden en DNA bibliotheek worden verdund in 96-wells platen. We verkregen platen van transfectie-grade bibliotheek DNA uit het DNA Kern van het Massachusetts General Hospital (krijgen = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Dit protocol transfects een bibliotheek plaat in 2 identieke platen van 293T-cellen (Figuur 1), zou dus 2 platen van cellen gezaaid voor elke bibliotheek plaat worden gescreend.

Opmerking: Kweek cellen in medium zonder fenol rood of antibiotica, zoals deze functies de luciferase assays en verhogen toxiciteit tijdens transfectie, respectievelijk.

1. Voor elke plaat bibliotheek te screenen, resuspendeer getrypsiniseerd 293T cellen tot een concentratie van 1,5 x 10 ⁵ cellen / ml in DMEM met 14% FBS. Giet in een steriele reservoir (Axygen).
2. Plaats het reservoir 2 heldere bodem en 96 putjes (Corning), en een doos filter pipetpunten (Agilent) op de robot dek. Pipetteer 100 ul cellen in elk putje van twee platen, een dichtheid van 1,5 x 10 ⁴ cellen per putje.
3. Centrifugeer de cellen platen bij 50 xg gedurende 2 minuten, met lage helling snelheden van waarborgenceldichtheid gedurende elk putje. Incubeer bij 37 ° C en 10% _CO2 O / N.
4. Verdun de vuurvlieg en Renilla reporterplasmiden tot 5 ng / ul in serumvrij medium. Combineer de verdunningen in een verhouding van 05:03 tot vuurvlieg Renilla plasmide (in volume) in een 15 ml conische buis.
5. Pipet de gecombineerde plasmiden in elk putje van een 96-well plaat, doseren 17 ul per bibliotheek plaat, plus 2-10 ul overtollige, in elk putje.
6. Verkrijgen transfectie-grade DNA-bibliotheek platen zoals hierboven en verdun tot 13,3 ng / ul met endotoxine-vrij water. Het minimale volume per putje moet 28 pl.

3. Voer Transfecties

Op dag 2 van het scherm, worden reporterplasmiden en bibliotheek DNA getransfecteerd in 293T-cellen.

1. Voor elke bibliotheek plaat, meng 107.5 pl RT Optifect (Invitrogen) met 4,3 ml serumvrij medium (1:40 verdunning) in een polystyreen buis. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, enn afzien 44 pi (per bibliotheek plaat) in elk putje van een 96-well, polystyreen V-bodem plaat (Greiner).
2. Plaats de plaat van verdunde Optifect, reporterplasmiden (Stap 2.5), bibliotheek DNA's (Stap 2.6), en een doos met pipet tips over de robot dek.
3. Aspireren 17 ul van reporterplasmiden, 43 pl verdund Optifect, en 26 ul van DNA-bibliotheek, het invoegen van een 5 pl luchtspleet tussen elke aspiratie. De bibliotheek DNA moet als laatste worden opgezogen om kruisbesmetting te voorkomen. Doseer de inhoud van de tips in een nieuwe polystyreen met V-vormige plaat, mengen, deksel, en zet opzij voor 20 min om lipide / DNA-complexen te vormen. Als transfecteren meerdere bibliotheek platen, vervang dan de pipet tips en bibliotheek plaat, en herhaal.
4. Ontdek de Optifect / DNA mengsel bord en plaats het op de robot dek met 2 pitten van 293T-cellen. Met behulp van een enkele doos van pipet tips, aspireren 80 ul van de Optifect: DNA mengsel en langzaam afzien 40 pi op elke plaat van cellen. Als transonverminderd meerdere bibliotheek platen, herhaal voor alle Optifect: DNA platen. Bedek cellen.
5. Centrifugeer de cellen platen bij 1200 xg gedurende 30 minuten. Bedek en ga terug naar de incubator.
6. Incubeer de cellen gedurende 4-6 uur. Tijdens deze incubatie bereid vers medium door het mengen van 12 ml DMEM met 10% FBS en 10 ug / ml ciprofloxacine (Cellgro) voor elke bibliotheek getransfecteerde plaat. Giet verse media in een steriele reservoir.
7. Plaats 2 dozen van robot tips, een enkele plaat van cellen, het reservoir met vers medium, en een verspilling reservoir op de robot dek. Aspireren 100 ul van de media uit de cellen en afzien in het afval reservoir gedeeltelijk gevuld met 70% ethanol. Met verse tips, aspireren 100 ul vers medium en langzaam afgeven op de cellen. Herhaal dit voor alle platen van cellen.
8. Terug platen in de incubator gedurende 48 uur.

4. Voer Dual-luciferasetests

Op dag 4 van het scherm, devuurvlieg en Renilla luciferasetests worden uitgevoerd.

Opmerking: de dual-luciferase assay vereist de sequentiële toevoeging van 2 assay buffers, 3X vuurvlieg testbuffer en 3x Renilla testbuffer, zoals beschreven in Tabel 3 Firefly en Renilla luciferasen niet uitgescheiden, waardoor cellen worden gelyseerd voor het meten van luciferase-activiteit. . Firefly assay buffer lyseert cellen en zorgt substraat voor de vuurvliegluciferase; Renilla proefbuffer lest de vuurvlieg signaal en voorziet substraat voor de Renilla luciferase.

1. Voor elke bibliotheek plaat, bereiden 8 ml 3X vuurvlieg proefbuffer uit voorraad oplossingen zoals beschreven in Tabel 3, en afzien van 82 ul in elk putje van een 96-well-V-vormige plaat.
2. Voor elke bibliotheek plaat, ook bereid 12 ml 3X Renilla testbuffer en verdeel 122 pl in elk putje van een 96-well V-vormige plaat. Gereserveerd zowel devuurvlieg en Renilla assay buffers.
3. Plaats een doos met pipet tips, een afvalreservoir, en 2 pitten van cellen (getransfecteerd van dezelfde bibliotheek plaat) op de robot dek.
4. Aspireren 60 ul van de media van elke plaat en gooi het afval reservoir gedeeltelijk gevuld met 70% ethanol. Afdekplaten en zet apart. Als transfecteren meerdere bibliotheek platen, herhaal voor alle sets van platen.
5. Plaats 2 dozen van pipet tips, de plaat van 3X vuurvlieg assay buffer, en een set van platen staan ​​op de robot dek.
6. Aspireren 40 pl 3X vuurvlieg assay buffer en voeg deze toe aan de eerste plaat van cellen, grondig mengen. Omschakelen naar een nieuwe pipet tips, herhaal voor de tweede cel plaat. Plaats cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten tot lysis te voltooien. Als transfecteren meerdere bibliotheek platen, vervang dan de dozen van tips en celplaten, en herhaal.
7. Record luminescentie uit elk putje van elke cel plaat op een lichtmeter, opname voor 1 sec per well. Terug platen de robotdek.
8. Plaats 2 dozen van pipet tips, de plaat van 3X Renilla assay buffer, en een set van platen staan ​​op de robot dek.
9. Aspireren 60 ul van 3X Renilla assay buffer, en voeg deze toe aan de eerste plaat van cellen, grondig mengen. Overschakelen naar een nieuwe doos van pipet tips, herhaal voor de tweede cel plaat. Als transfecteren meerdere bibliotheek platen, herhaal voor alle sets van celplaten.
10. Record luminescentie van alle platen op een lichtmeter, het opnemen van elk goed voor 1 sec als hierboven. Gooi platen.

5. Data Analysis

1. Bereken de vuurvlieg: Renilla luminescentie ratio ("F: R-verhouding") voor elk putje door het verdelen van de graven van vuurvlieg signaal door de graven van Renilla signaal.
2. Bereken de inductie waarde door deling van het F: R verhouding van elk putje van de gemiddelde F: R verhouding van de plaat, de hoogste en laagste 25% van de putjes.
3. Het gemiddelde van de inductie waarden over replicavoor een enkele getransfecteerde bibliotheek plaat. Genen induceren of onderdrukken van alfa-synucleïne meer dan drie plooien worden beschouwd als "hits" in dit scherm en zijn onderhevig aan verdere validatie en secundaire beeldschermen.

Resultaten

Typische luciferase waarden F: R verhoudingen en inductie waarden voor een halve plaat worden getoond in figuur 4 Merk de hit in goed H2, een 32-voudige inductor.. Genen veroorzaken overmatige toxiciteit (bijvoorbeeld goed E3), of putten die slecht werden getransfecteerd, zullen lage waarden voor zowel de vuurvlieg en Renilla luciferases produceren, maar een gemiddelde inductie waarde. Genen waardoor niet-specifieke inductie van luciferaseactiviteit, bijvoorbeeld via interactie met de ...

Discussie

Alpha-synucleïne is betrokken bij de ziekte van Parkinson (PD) als component van Lewy lichamen ^4, intracellulaire inclusies beschouwd pathognomonische voor de ziekte. Tal van genoom-brede associatie studies hebben single nucleotide polymorfismen gekoppeld aan alfa-synucleïne met een verhoogd risico voor sporadische PD ^5,6,7. Hoewel minder algemeen dan sporadische PD, kan familiale PD ook worden veroorzaakt door mutaties in alfa-synucleine ^8, en dubbel en triplicatie van de alfa-synucleïn...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materiaal
QIAQuick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR Micro Kit	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen	K2100-07
Bravo Robot	Agilent	-
Robot Pipet Tips with Filter	Agilent	19477-022
Robot Pipet Tips without Filter	Agilent	19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates	Corning	3610
Reservoirs	Axygen	RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651201
Adhesive Plate Covers	CryoStuff	#FS100
Reagens
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase	Roche	10713023001
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells	Invitrogen	11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265-017
DMEM without Phenol Red	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
Ciprofloxacin	CellGro	61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder	Sigma	93287
Tris-Base Powder	Sigma	93286
Triton X-100 Pure Liquid	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
C–nzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
Luciferin	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003