Generatie van Aligned Functionele myocardweefsel Door microcontact afdrukken

Samenvatting

De generatie van uitgelijnde myocardiale weefsel is een belangrijke voorwaarde voor het aanpassen van de recente ontwikkelingen in de stamcel biologie om klinisch bruikbare doeleinden. Hierin beschrijven we een microcontact afdrukken benadering voor de nauwkeurige controle van cellulaire vorm en functie. Met behulp van zeer zuivere populaties van embryonale stamcellen afgeleid cardiale voorlopercellen, we dan het genereren van anisotrope functionele myocardium.

Samenvatting

Geavanceerde hartfalen is een belangrijke onvervulde klinische uitdaging, die voortvloeien uit het verlies van levensvatbare en / of volledig functionele hartspiercellen. Ondanks optimale medicamenteuze therapie, hartfalen is een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit in de ontwikkelde wereld. Een belangrijke uitdaging in de ontwikkeling van geneesmiddelen is de identificatie van cellulaire assays die nauwkeurig recapituleren normale en zieke menselijke hartspier fysiologie in vitro. Ook de grote uitdagingen in de regeneratieve cardiale biologie draaien rond de identificatie en isolatie van patiënt-specifieke cardiale voorlopercellen in klinisch relevante hoeveelheden. Deze cellen moeten vervolgens worden samengevoegd tot functioneel weefsel dat lijkt op het oorspronkelijke hartweefsel architectuur. Microcontact afdrukken het mogelijk maakt van nauwkeurige micropatterned eiwit vormen die lijken structurele organisatie van het hart, waardoor geometrische signalen om celhechting ruimtelijk controleren. Hierinbeschrijven we onze aanpak voor de isolatie van sterk gezuiverde myocardiale cellen van pluripotente stamcellen differentiëren in vitro, het genereren van celgroei oppervlakken micropatterned met extracellulaire matrix eiwitten en de montage van de stamcel-afgeleide hartspiercellen in anisotrope myocardium.

Inleiding

Ondanks de recente vooruitgang in de medische therapie, geavanceerde hartfalen blijft een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit in de ontwikkelde wereld. De klinische komt voort uit het verlies van functionele myocardiaal weefsel en vervolgens een onvermogen van het hart om niet de metabolische behoeften van getroffen individuen voldoen. Aangezien het hart heeft een beperkte regeneratievermogen, autologe harttransplantatie is de enige huidige klinisch geaccepteerde therapie direct gericht op het aanvullen van verloren functioneel hartweefsel. Belangrijke nadelen van harttransplantatie, waaronder een beperkt aantal donorharten en de noodzaak van langdurige immunosuppressieve therapie, het wijdverbreide gebruik van deze therapie voorkomen. Dientengevolge heeft de medische therapie de steunpilaar van behandeling voor patiënten met hartziekte. Een belangrijke uitdaging in de ontwikkeling van geneesmiddelen is de identificatie van cellulaire assays die nauwkeurig normale en zieke myocard fysiologie vatten in vitro.

De recente convergentie van stamcel biologie en tissue engineering technologie roept nieuwe veelbelovende perspectieven voor cardiale regeneratie. Het genereren van functionele myocardweefsel uit een hernieuwbare patiënt-specifieke bron zou een belangrijke stap vooruit in het veld. Dit zou het mogelijk maken de ontwikkeling van de ziekte-specifieke cellulaire assays voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en ontdekking en zou de basis voor cardiale regeneratieve geneeskunde te leggen. Menselijke embryonale stamcellen (ES)-cellen en, nog belangrijker, de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een potentieel hernieuwbare patiënt-specifieke bron van ventriculaire progenitor cellen en volwassen ventriculaire myocyten. De combinatie van stamcelbiologie en tissue engineering strategieën lost dit probleem door het genereren van functionele hartweefsel in vitro kan worden gebruikt bij de ontwikkeling van cellulaire assays voor drug discovery of cardiale regeneratieve benaderingen voor de behandeling van hartfalen.

_content "> Een centrale uitdaging van de cardiale regeneratie is de identificatie van een optimale celtype. Een breed scala aan cellen zijn ^een bestudeerd, echter tot op heden, hoewel er verschillende multipotente cardiogene voorlopers uit verschillende bronnen zijn ontdekt, de identificatie van een cel bron die kritische eisen zoals betrokkenheid bij de myogene lot van de cel komt, is handhaving van het vermogen om in vivo of in vitro en samenstelling expanderen tot een functionele myocardweefsel bewezen een centraal probleem ^2. We hebben eerder een dubbel transgene muizen beschreven waarmee de isolatie van sterk gezuiverde populaties betrokken ventriculaire voorlopers (CVP) uit ES-cellen differentiëren in vitro. We genereerden a novel dubbel transgene muis die de rode DsRed fluorescent eiwit tot expressie brengt onder de controle van een Isl1-afhankelijke enhancer van het gen en MEF2c het versterkt groen fluorescent eiwit onder de controle vande hart-specifieke enhancer Nkx2.5. Op basis van deze twee kleuren fluorescerende reporter systeem, eerste en tweede hart gebied voorlopercellen uit ontwikkelingslanden ES cellen kunnen worden geïsoleerd door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) volgens hun expressie van Nkx2.5 MEF2c en genen. CVP lijken hartmyocyten gebaseerd op de expressiepatronen van myocardiale markers en structurele en functionele eigenschappen ^3, wat biedt veelbelovend voor hartweefsel regeneratieve doeleinden.

Hoewel er veel vooruitgang op het gebied van tissue engineering, het nabootsen van inheemse cellulaire architectuur blijft een belangrijke uitdaging. Conventionele methoden om deze uitdaging zijn zaaien biologische of synthetische scaffolds met cellen in vitro. Door een aantal nadelen van steigers, waaronder een snelle afbraak beperkte fysische en mechanische stabiliteit en lage celdichtheid ^1,4,5, hebben we geprobeerd scaffold-less weefselingenieur. Although hartcellen hun lokale micro wijzigen door de uitscheiding van extracellulaire matrix eiwitten, hebben een beperkte capaciteit om zich te organiseren om staafvormige hartmyocyten in afwezigheid van extracellulaire signalen. Aldus wordt een sjabloon dat cellen geschikte ruimtelijke en biologische aanwijzingen functioneel hartspierweefsel samenstellen biedt vereist. Microcontact afdrukken lost dit probleem op een eenvoudige en goedkope techniek om nauwkeurig celvorm, organisatie en functie ^6-8, die allemaal essentieel voor het genereren van functionele lijn myocardium. Het omvat het gebruik van microtextured polydimethylsiloxaan (PDMS) stempels feature variërend tot 2 urn ⁹ dat de afzetting van extracellulaire matrix eiwitten toestaat op PDMS substraten in nauwkeurige patronen en aldus celadhesie ruimtelijk beïnvloeden.

Hierin stellen we voor om weefsel bio-ingenieur technologie te combineren met steel cell biologie tot anisotrope functionele myocardweefsel te genereren. Daarom tonen we hier onze onlangs benadering voor: (1) het genereren van micropatterned eiwitoppervlakken on PDMS substraten microcontact afdrukken voor het genereren van een sjabloon voor uitgelijnd myocardweefsel, (2) de isolatie van sterk gezuiverde cardiale voorlopercellen uit ES cellen differentiëren in vitro, en (3) de combinatie van beide technieken te genereren uitgelijnd functionele myocardium.

Protocol

Het protocol bij uitgelijnde functionele myocardweefsel genereren kan worden onderverdeeld in drie grote delen. De fabricage van de micropatterned meester met behulp van zachte lithografie technieken wordt niet beschouwd als een deel van het volgende protocol, maar kan worden gemaakt op basis van vaste methode ^6.

1. Microcontact afdrukken van fibronectine op PDMS Substraten

1. Meng Sylgard 184 (Dow Corning) PDMS elastomeer op een 10:1 basis om verharder verhouding en ontgas de montage met behulp van een exsiccator om eventuele luchtbellen te verwijderen.
2. Cure PDMS opzichte van een vooraf vervaardigd master met 20 urn breed en 2 urn lang ribbels, gescheiden door 20 micrometer afstand voor op 2 dagen bij kamertemperatuur of 4 uur bij 65 ° C microtextured PDMS stempels worden.

* Uitharding in een exsiccator is ten zeerste aanbevolen om eventuele luchtbellen te verwijderen.

3. Spin jas PDMS op glas dekglaasjes (bijv.22x22 mm) bij 5.000 rpm gedurende 2 min met een Headway spin coater om dunne gelijkmatige PDMS substraten van 15 urn dikte heeft.
4. Reinig postzegels met 70% ethanol om stof en vuil te verwijderen. Laat ze drogen.

* Stamps meerdere malen kan worden gebruikt, maar vernieuwt PDMS stempels regelmatig aanbevolen vanwege een oppervlak slijtage tijd.

5. Plaats stempels in een SPI Plasma-II Prep Plasma Cleaner en werkwijze voor 1 min bij 275 mTorr te maken PDMS oppervlakken hydrofiel.

* Zuurstof plasma behandeling moet worden bekeken. Langere behandelingstijd kan leiden tot scheuren van het elastomeer.

6. Steriliseer postzegels met 70% ethanol gedurende 1 minuut. Droog snel met perslucht.

* Verdere stappen moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast om de steriliteit te behouden.

7. Bedek stempel oppervlakken met Fibronectin oplossing (50 ug / ml in ddH ₂ O). Laten adsorberen ten minste 10 minuten.
8. Schud Fibronectine oplossing van stempels en droog snel met perslucht.
9. Tot stand conform contact tussen stempels en PDMS substraten voor 2 min en stevig aandrukken.
10. Spoel micropatterned substraten met ddH ₂ O. Opslaan in ddH ₂ O maximaal 2 weken bij 4 ° C tenzij oorspronkelijk gebruikt. Bewaar PDMS stempels in ddH ₂ O.

2. Onderhoud van dubbel transgene embryonale stamcellijnen

Ten eerste, de voorbereiding van de volgende media voor het kweken van muis ES cellen:

Muis embryonale Fibroblast (MEF)-Medium: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% foetaal runderserum (FBS) ES cel-differentiatie of-grade, 1% penicilline-streptomycine (P / S)

Embryonale stamcel (ESC)-Medium: DMEM, 15% FBS ES cel-grade,1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% leukemieremmende factor (LIF), 0,0007% 2-Mercaptoethanol (2-ME)

1. Coat 6-well platen met steriele 0,1% gelatine in ddH ₂ O en laat adsorberen 15 min bij 37 ° C.
2. Voeg MEFs van een ontdooide aliquot van 50 ml PBS in een conische buis en centrifugeer ze op 1000 rpm gedurende 5 min. Resuspendeer MEF's in MEF-medium.
3. Na adsorptie, aspiraat overtollige gelatine en voeg MEFs in de putjes. Laat MEF 1 dag tot hechten.

* Een aliquot van 10 miljoen MEFs voldoende voor 3 6-well platen.

4. Wanneer MEFs hebben gehecht, voeg ES cellen uit een monster ontdooid tot 50 ml PBS in een conische buis en centrifugeer ze op 1000 rpm gedurende 5 min. Resuspendeer ES-cellen in ESC-medium en voeg ze toe aan de putjes die MEFs. Cultuur ES-cellen in ESC-medium tot samenvloeiing wordt bereikt.

* Eenmaal ES-cellen hebben bereikt samenvloeiing, is passage requvoor hot om overgroei te voorkomen en ES celkolonies handhaven.

5. Bereid ES cellen voor passage. Zuig ESC-medium en een keer met steriele PBS te wassen.
6. Aspireren PBS en voeg 500 ul trypsine. Process 3,5 min bij 37 ° C.
7. Pipetteer de trypsine-oplossing op en neer een paar keer af te breken ES-cel kolonies en het neutraliseren met 500 pi van ESC-medium.
8. Passage ES-cellen op basis van uw gewenste verhouding, bijvoorbeeld overdracht 33 ul naar een ander goed met eerder bereid MEF om de doorgang 1/30. Behoud ES-cellen in ESC-Medium.

* Een passage verhouding van 1/30 kan ES cellen confluentie bereiken binnen 3 dagen. Passage ES cellen volgens een in vitro differentiatie schema.

3. In vitro differentiatie van dubbel transgene embryonale stamcellijnen en Isolatie en zaaien van Cardiac voorouders

Ten eerste, de voorbereiding van de following media voor de in vitro differentiatie van ES cellen:

Aanpassing-Medium: Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM), 15% FBS ES cel-grade, 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% LIF, 0,0007% 2-ME

Differentiatie-Medium: IMDM, 15% FBS Differentiatie-grade. 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,35% 0,1 M ascorbinezuur, 0,0007% 2-ME

1. Start in vitro differentiatie als ES-cellen hebben bereikt samenvloeiing. Coat 10 cm kweekschalen met steriele 0,1% gelatine in ddH ₂ O en laat adsorberen 15 min bij 37 ° C.

* Let op de duur van de in vitro differentiatie proces. Het duurt 8 dagen tot cardiale voorlopercellen geïsoleerd kunnen worden. Plan uw experimenten.

2. Harvest ES cellen voor. Na adsorptie, aspiraat overtollige gelatine en voeg ongeveer 1/3-1/2 van de ES-cel suspensie bereide voedingsbodemsschotels op basis van aanpassing-medium. Kweekcellen gedurende 2 dagen.

* Kies de hoeveelheid van ES-cellen voor aanpassing op basis van uw experimenten.

3. Harvest aangepast ES cellen in een 50 ml conische buis met PBS met 1. 5 ml trypsine. Centrifuge gescheiden ES cellen bij 1000 rpm gedurende 5 min en resuspendeer in deze differentiatie-medium.
4. Maak embryo organen (EBS) van ongeveer 1.000 cellen per 10 ul daling van 15 cm de cultuur gerechten met een multi-channel pipet. De platen om en cultuur EB als opknoping druppels gedurende 2,5 dagen bij 37 ° C.
5. Na 2,5 dagen, EB pool 6-8 15 cm kweekschalen in een met differentiatie-medium en kweken ervan nog eens 3,5 dagen bij 37 ° C.
6. Na 3,5 dagen verzamelen EBS een conische 50 ml buis en laten zakken naar de bodem gedurende ongeveer 5 minuten. Zuigen het supernatant en was EVSA's met steriel PBS. Laat EVSA weer zinken naar de bodem voor ca.oximately 5 min.
7. Distantiëren EVSA's door ze te verwerken met 2. 5 ml trypsine gedurende 2 minuten in een waterbad bij 37 ° C de buis zacht schudden. Voeg vervolgens 2. 5 ml steriel PBS om trypsine oplossing en het op en neer pipetteren met een pipet 10 ml serologische ongeveer 8-10 maal te breken cel clusters. Neutraliseer Trypsine met 10 ml FACS buffer die 7,5% FBS ES cel-differentiatie of-grade en 0,01% DAPI in PBS.
8. Centrifugeer gedissocieerd EVSA bij 1000 rpm gedurende 5 min en resuspendeer ze in ongeveer 1 ml FACS buffer. Pipet op en neer met een 1 ml pipet ongeveer 8-10 maal te breken cel clusters.

* Voeg FACS buffer volgens het geraamde bedrag van gedissocieerde EVSA's. Te sterk geconcentreerd cellen kunnen verstoppen tijdens FACS en te laag geconcentreerde cellen kunnen FACS tijd onnodig te verlengen.

9. Breng cellen naar een steriele rondbodem buis met een 35 urn celzeef te verkrijgeneen enkele celsuspensie.
10. Soort gedifferentieerde ES cellen door een FACSAria Flow Cytometer en verkrijgen gezuiverd populaties CVP.

* Wij ontwikkelden een meerstaps gating strategie sterk gezuiverd gekleurde cellen te isoleren. In het kort, we eerste poort op Forward Scatter Amplitude (FSC-A) en Side Scatter Amplitude (SSC-A) (Figuur 1A). Hierdoor kunnen wij hele cellen scheiden van celresten. Vervolgens hebben we gate op FSC-A en Forward Scatter-Breedte (FSC-W) (Figuur 1B). Dit laat ons toe cel singlets te isoleren van wambuizen en andere cellulaire aggregaten. Vervolgens gate on SSC-A en Side Scatter-Breedte (SSC-W) (Figuur 1C). Dit verhoogt de helderheid van cel singlets. Vervolgens poort op DAPI kleuring om levensvatbare cellen (DAPI-negatieve) isoleren van niet-levensvatbare cellen (figuur 1D). Vervolgens poort op Phycoeryhthrin Amplitude (PE-A) en PE-cyaninekleurstof 7 Amplitude (PE-Cy7-A) om echte rode positieve ⁽⁺ R verkrijgen ) en echte rood-negatief (R ^-) cellen en aan autofluorescente rode-negatieve cellen (figuur 1E) uit te sluiten. R ⁺ en R ^- cellen worden vervolgens gated afzonderlijk op Fluoresceïne isothiocyanaat Amplitude (FITC-A) en PE-A om echte groene-positieve (G ⁺⁾ en echte groene-negatieve (G ^-) sorteren cellen binnen deze populaties (Figuur 1F + 1G). Dit resulteert in 4 populaties van cellen als volgt: R ⁺ G ^+, R ⁺ G ^-, R ^- G ⁺ en R ^- G ^- (Figuur 1H).

11. Passiveren micropatterned substraten met 1% Pluronic F-127 in ddH ₂ O 10 minuten. Daarna was ze 3x met steriel PBS.

* Pluronic F-127 is een surfactant die blokken celadhesie. Het ondersteunt opsluiting van celhechting aan micropatterned gebied.

12. Bevestig PDMS pakkingen rond de patroon regioen druk deze stevig. Dan, zaad CVP op fibronectine micropatterned substraten.

Resultaten

FACS-zuivering van in vitro gedifferentieerde ES cellen toonde vier verschillende populaties van voorlopers (figuur 1). De aanwezigheid van fibronectine micropatterned werd bevestigd door immunofluorescentie microscopie dat een volledige overdracht van continue fibronectine (Figuur 2) weergegeven. Uitplaten van FACS-voorlopercellen geïsoleerd op fibronectine micropatterns resulteerde in uitlijning van de R ⁺ G ⁺ en onderdeel van de R ^- G ^+<...

Discussie

In dit protocol stelden we een methode om gezuiverde populaties van cardiogene progenitors isoleren en om zaad ze op micropatterned Fibronectine substraten wat hen toelaat uitlijnen en neem een ​​cardiale myocyten-achtige staafvorm. Normale cellulaire organisatie is essentieel voor normale weefselfunctie ^8,10, in het bijzonder voor myocardium. Hartmyocyten is aangetoond dat verbeterde mechanische eigenschappen en elektrofysiologische ^{11,12 11,13} ontwikkelen bij het ​​vormen anisotrope cel arrays. A...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Stofnaam	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
L-Ascorbinezuur	Sigma-Aldrich	A4544	Bereid 0,1 M oplossing in ddH 2 O
Exsiccator, Vacuum 10 inch	Nova-Tech International, Inc	55206
4 ',6-diamidino-2-fenylindool, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Scientific	SH30022.01
DPBS	Gibco	14190
FACSAria II Flow Cytometer	BD Biosciences
Fetal Bovine SerumES cel-grade	Tweeling Bio-Products	100 tot 106
Foetaal runderserum Differentiation-grade	Tweeling Bio-Products	1-500
Fibronectine plasma van runderen	Sigma-Aldrich	F4759	Solubiliseren tot 1 mg / ml in ddH 2 O
Fisherfinest Premium Cover Glas 22x22mm	Fisher Scientific	12-548 B-
Gelatine uit varkens huid	Sigma-Aldrich	G1890	Bereid 0,1% oplossing in ddH 2 O
Headway Spin Coater	Headway Research, Inc	PWM32-PS-CB15
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Thermo Scientific	SH30228.01
Leukemieremmende factor	ZelfBereid uit LIF-uitscheidende cellijnen		Bereid 500x stockoplossing
MEM niet-essentiële aminozuren	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Muis embryonale fibroblasten	Geoogst van dag 12 tot 15 muis embryo's
Penicilline-streptomycine	Gibco	15140-122
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Bereid 1% oplossing in ddH 2 O
Ronde bodem Tube met 35 micrometer cel zeef	BD Biosciences	352235
SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner	SPI Supplies	11005-AB
Sylgard184 siliconelastomeerfase Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
0,25% trypsine-EDTA	Gibco	25200-056
Pneumatisch lagedrukmeettoestel	SPI Supplies	11019-AB