Methodenartikel

Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen In vivo

DOI:

10.3791/50291

⸱

2 september 2013

 ,  , 
1Institute for Behavioral Genetics, University of Colorado Boulder, 2Department of Psychology and Neuroscience, University of Colorado Boulder

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De recente ontwikkeling van de neurowetenschappen tools die genetica en optica combineren, aangeduid als "optogenetics", stelt de controle over neurale circuit activiteit met een ongekend niveau van ruimtelijke en temporele resolutie. Hier bieden wij een protocol voor de integratie in vivo opnemen met optogenetic manipulatie van genetisch gedefinieerde subsets van de prefrontale cortex en subicular piramidale neuronen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetic methoden hebben zich ontwikkeld tot een krachtig hulpmiddel voor het ophelderen van neurale circuit activiteit ten grondslag liggen aan een gevarieerde set van gedragingen in een breed scala van soorten. Optogenetic instrumenten van microbiële oorsprong bestaat uit lichtgevoelige membraan eiwitten die in staat zijn om de neurale activiteit ingenetically gedefinieerde celtypen dan gedragsmatig relevante tijdschalen activeren (bijv. channelrhodopsin-2, ChR2) of stilte (bijv. halorhodopsin, NpHR) zijn. We eerst aantonen dat er een eenvoudige benadering voor adeno-geassocieerd virus gemedieerde levering van ChR2 en NpHR transgenen aan de dorsale subiculum en prelimbische regio van de prefrontale cortex in de rat. Omdat ChR2 en NpHR genetisch richtbare beschrijven we het gebruik van deze technologie om de elektrische activiteit van specifieke populaties van neuronen (bijvoorbeeld, piramidale neuronen) ingebed in heterogene weefsel met hoge temporele precisie regelen. We beschrijven hierin de hardware, software op maatgebruikersinterface en procedures die het mogelijk maken voor gelijktijdige lichte levering en elektrische opname van getransduceerde piramidale neuronen in een verdoofde in vivo voorbereiding. Deze licht reagerende tools bieden de mogelijkheid voor het identificeren van de causale bijdragen van verschillende celtypes te informatieverwerking en gedrag.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen binnen een neuraal circuit in een tijdelijk nauwkeurige wijze te activeren of stilte een specifiek celtype is cruciaal om te begrijpen hoe neurale circuits verwerken verschillende soorten informatie onderliggende emotie en cognitie. Experimentele controle over intacte neurale activiteit loss-/gain-of-function tools (bijvoorbeeld, elektrische stimulatie, farmacologische modulatie, laesie) die niet voorzien in dienst van de selectief nodig voor het regelen van specifieke populaties van neuronen, hetzij op een tijdelijke of ruimtelijke schaal. Direct aanpakken van deze technologische uitdagingen, heeft de ontwikkeling en toepassing van genetisch-codeerbare lichtgevoelige instrumenten neurowetenschappers nodig om de elektrische activiteit van geselecteerde celtypes gedurende welomschreven gedragsmatige gebeurtenissen te controleren. Veel van deze lichtgevoelige eiwitten zijn van microbiële oorsprong, met het licht-gated kation kanaal, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, en ​​het licht-aangedreven chloride pomp, halorhodopsin (NpHR) 2,3, op grote schaal gebruikt.

Een groot voordeel van optogenetics is de mogelijkheid om genetisch doelspecifieke celpopulaties in heterogene hersengebieden en de techniek is met succes toegepast op een aantal modelorganismen (ongewervelde niet-menselijke primaten) 4-6. Veel optogenetic transgene dieren zijn gegenereerd en zijn commercieel verkrijgbaar 7,8 echter oprichting transgene lijnen kan arbeidsintensief en onbetaalbaar zijn. Hier beschrijven we een protocol voor viraal-bemiddelde aflevering van ChR2 en NpHR genen onder de CaMKIIα promotor in ratten prelimbic cortex en dorsale subiculum met een recombinante adeno-geassocieerde virus (AAV) vector. Binnen de voorhersenen, CaMKIIα uitdrukking is exclusief voor glutamaat piramidale neuronen 9. AAV wordt vaak gebruikt voor fundamenteel onderzoek vanwege het relatieve gemak van productie en gebrek aan pathogeniciteit, evenals de sterke en persistent transgenexpressie die is bereikt met deze vectoren 10. Daarnaast schetsen we de stappen en hardware voor gelijktijdige lichte levering en opname in verdoofde-hoofd vast ratten.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Virus opslag en voorbereiding

  1. Het gebruik van replicatie-incompetent AAV-vectoren voor het leveren opsin genen knaagdierhersenen is goedgekeurd voor Biosafety Level 1 (BSL-1) en vereist een goede bescherming en procedures voor de behandeling zoals beschreven in de publicatie Amerikaanse regering, bioveiligheid in Microbiologie en Biomedische Laboratories, beschikbaar op de Centers for Disease Control website bij ( http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm ).
  2. Om herhaalde vries-dooi cycli, pipet virus uit flacon fabrikant in kleinere porties te werken in een klasse II bioveiligheid kabinet en op te slaan in een -80 ° C vriezer voorkomen.
  3. Voorafgaand aan stereotactische injectie, waardoor een hoeveelheid te ontdooien op ijs en vervolgens kort spin down met een bench top centrifuge.
  4. Langzaam weer vullen van een Hamilton glas spuit en naald met een kleine hoeveelheid siliconen of minerale olie.Zorg ervoor dat er geen zichtbare luchtbellen in de spuit. Plaats de spuit in een microinjector pomp en bevestig de pomp direct op de verticale stereotaxisch arm (dwz stereotaxisch manipulator).
  5. Laat de stereotactische arm totdat de punt van de naald de bodem raakt van de hoeveelheid virus buis. Gebruik de controller voor de microinjector pomp om het gewenste volume van het virus (1,5 pl voor een 1 pi injectie) in te trekken.
  6. Alle materialen en oppervlakken die in contact komen met het virus worden ontsmet met een ontsmettingsmiddel zoals chloor (10%).

2. Chirurgie en Virusinjectie

  1. Verdoven dier met een ketamine (rat, 125 mg / kg, ip) - xylazine (rat, 10 mg / kg, ip) cocktail. Om de effectiviteit van de anesthesie te meten, te controleren op een reflex reactie op een teen knijpen en geef aanvullende doses ketamine indien nodig. Met behulp van standaard aseptische chirurgische methoden, plaats dier in een stereotaxische apparaat (David Kopf Ininstrumenten).
  2. Maak een middellijn incisie door de huid op de top van de dierlijke schedel met kleine chirurgische schaar of scalpel. Voorzichtig te scheiden van het bindweefsel en het reinigen van de bovenkant van de schedel met een kleine bot schraper.
  3. Controleer of de kop van het dier zodanig niveau dat de z-coördinaten van bregma en lambda gelijk. Bepaal de stereotactische coördinaten voor de doelgroep hersengebied van een brein atlas zoals The Rat Brain in Stereotaxische Coördinaten (George Paxinos en Charles Watson, Academic Press, 2007) of The Mouse Hersenen in Stereotaxische Coördinaten (Keith BJ Franklin en George Paxinos, Academic Press , 2007). Markeer de beoogde injectieplaats met een chirurgische pen.
  4. Zorgvuldig dun de schedel over het doelgebied met een handboormachine en stoppen wanneer de boor de bodem van de schedel bereikt. Met behulp van een paar extra fijne tang, verwijder het bot uitgedund om de dura bloot.
  5. Plaats de naald van de spuit over de doelgroep zijneen en laat de naald tot tegen de dura en gebruik dit punt te berekenen de z-coördinaat. Zeer langzaam de injectienaald in de hersenen tot de juiste z is bereikt. In dit protocol, de prelimbische gebied van de mediale prefrontale cortex (2.7 mm anterior naar bregma, ± 0,5 mm lateraal van de middellijn, en -2,2 mm van dura) of de dorsale subiculum (-6,0 mm anterior naar bregma, ± 3,0 mm lateraal aan de middellijn, en -2,0 mm van dura) is gericht op een volwassen Sprague Dawley mannelijke ratten (ca. 275 g).
  6. Injecteer virus bij een snelheid van 0,1 ul / min. Na de injectie is voltooid wacht 10 minuten voordat de naald om terugstromen van het virus te voorkomen naar de hersenen oppervlak.
  7. Gebruik een naai hechtdraad met aangehechte naald aan de huid af te dichten en antibiotica van toepassing op de wond.
  8. Het tijdsverloop van ChR2 en NpHR functionele expressie van AAV-vectoren is afhankelijk proefopzet en virale titer. Voor dit experiment in vivo opnames werden uitgevoerd 18-21 dagen na de injectie.

3. Licht Levering en In vivo Opname van ChR2 of NpHR expressie Neuronen

  1. Bevestig een wolfraam elektrode (~ 1-1,5 MQ, microzuilen) om een ​​glazen capillair (Fisher Scientific) met behulp van superlijm.
  2. Gebruik een fiber striptang (Thorlabs) aan de kale einde van een multimode glasvezel (200 micrometer diameter kern, Thorlabs) en schoon vezelpunt met ethanol bloot. Zeer licht scoren vezelpunt met een wigvormige diamantmes (Thorlabs) en verwijder voorzichtig de overtollige vezels (bijv. met fijn pincet). De vezel moet gemakkelijk splitsen in de score.
  3. Sluit het FC uiteinde van de vezel naar de PC aansluiting op de uitgang van 200 mW enkele diode laser ( www.Lumiphy.com ) met de gewenste golflengte. Zorg ervoor dat de juiste oogbescherming wordt gedragen ten alle tijden bij het werken met lasers.
  4. Meet de laser intensiteit bij het ​​uiteinde van de optische vezel met een optische vermogensmeter ( www.Lumiphy.com ). Voor in vivo opnamen kunnen lichtintensiteit slechts 20-100 mW / mm 2 betrouwbaar roepen ChR2 of NpHR gemedieerde activatie of silencing respectievelijk van neuronale activiteit.
  5. Plaats de optische vezel in het capillaire buisje. Plaats de vezelpunt ongeveer 500 pm boven de punt van wolfraam elektrode en bind een dunne hechtdraad twee keer op een paar punten in de buurt van de top, zodat de elektrode en de vezels zijn recht. Zorg ervoor dat de afstand tussen de punt van de elektrode en de dichtstbijzijnde knoop lang genoeg inbrengen om het doelgebied.
  6. Bereid het dier als in de stappen 2.1 en 2.2. Gebruik de eerste craniotomie als een gids voor een nieuwe, schone klein venster te maken in de schedel voor het positioneren van de optrode ( www.Lumiphy.com ). Maak een kleine incisie op de dura met een fijne naald.
  7. Verlagen zorgvuldig de optrode door de schedel raam en in de hersenen om de getransduceerde regio met behulp van een micromanipulator (Narishige). Vooruit dan de optrode langzaam in 10-50 micrometer stappen tot het ontstaan ​​van een licht-responsieve cel.
  8. Een aangepaste software user interface (NeuroLux Pro www.Lumiphy.com ) geschreven in LabVIEW (National Instruments) wordt gebruikt om de enkele diode laser te controleren en te visualiseren en op te nemen lopende neurale activiteit. Opgenomen signalen worden vastgelegd met een voorb-20K (Kation Scientific) versterker band-pass gefilterd (0,3-8 kHz) en een National Instruments analoog naar digitaal bord (NI USB-6009). De NeuroLux Pro gebruikersinterface maakt de keuze van de analoge ingangen (kies twee kanalen voor de neuronale en TTL-signaal) en digitale uitgang. De gebruiker kan de sampling rate (20 kHz), de referentieperiode (pre-licht), en post-licht periode te definiëren. De gebruiker kan de TTL laser stimulati definiërenop pulsbreedte, frequentie en stimulatie periode (als de frequentie is 20 Hz en stimulatie periode is 500 msec, zijn 10 laserpulsen met een gedefinieerde puls breedte geleverd). De gebruiker kan ook continu licht levering te kiezen (bijv. figuur 1). Voor herhaalde opnamen, de gebruiker kan ook het aantal pulstreinen en het interval tussen treinen definiëren. Gegevens kunnen worden verkregen met of zonder opname op de harde schijf.
  9. Na opname worden de dieren verdoofd met ketamine / xylazine cocktail en transcardiaal geperfuseerd met fysiologische zoutoplossing en paraformaldehyde (4%) om optrode plaatsing en opsine expressie controleren.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont een screenshot van de software op maat (NeuroLux Pro) ontwikkeld in LabVIEW omgeving (National Instruments) voor een gelijktijdige registratie van neuronale activiteit en regelen van licht pulsparameters (dwz pulsfrequentie, pulsbreedte, stimulatie periode). Het softwareprogramma stuurt een commando signaal naar een digitaal acquisitie apparaat dat TTL pulsen genereert om de controle over de enkele diode laser. Daarnaast is het softwareprogramma displays en slaat de opgenomen neuronale activiteit en geleverd TTL-signalen. Deze signalen worden gedigitaliseerd door de overname apparaat bij een bepaalde sample rate (bijv. 20 kHz). Opgenomen signalen worden opgeslagen als een twee-dimensionale dubbele precisie array in een binair bestand.

Figuur 2 toont de gewoonte optrode bestaat uit een wolfraam elektrode verbonden met een optische vezel. Een optische vezel wordt aan de elektrode met dunne hechtdraad driepunten. Indien nodig, kan superlijm worden gebruikt om ze hechten. Vermijd echter permanent vaststelling van de optische vezel om de elektrode want hoewel de elektrode herhaaldelijk, lichttransmissie kan worden hergebruikt door de vezel zal degraderen bij herhaald gebruik en moet worden gesplitst en gereinigd of vervangen om het inbrengen in de hersenen.

Links panelen van Figuur 3 tonen fluorescerende beelden van verbeterde geel fluorescerend eiwit, met vermelding van de werkelijke ChR2 en NpHR expressie. Deze foto's tonen vertegenwoordiger NpHR expressie in rat dorsale subiculum (figuur 3A) en ChR2 expressie in prelimbic cortex (Figuur 3B). Virale expressie werd meestal beperkt tot de dorsale subiculum en prelimbic cortex (bijv. sommige fluorescentie werd waargenomen in dentate gyrus (Figuur 3A, links)). De sporen van de elektrode (dunne spoor, pijlpunt) en glasvezel (dikke track pijl) werden ook waargenomen.

linkerpaneel van Figuur 4 toont dat ChR2 veroorzaakte tijdelijk precieze stekelige in rat prelimbic cortex. Figuur 4A is een voorbeeld spoor van ChR2-triggered actiepotentialen in reactie op 20 Hz levering van 10 msec blauwe lichtpulsen te prelimbische rat cortex. Raster plot (Figuur 4B) toont ChR2-geïnduceerde activatie in zes representatieve neuronen. Alle opgenomen neuronen toonde licht opgewekte stekelige met een perfecte trouw. In tegenstelling tot ChR2, NpHR snel en reversibel zwijgen spontane activiteit in vivo bij ratten prelimbic cortex (rechterpaneel van figuur 4). Figuur 4C is een voorbeeld traceren met dat permanente 532 nm verlichting (10) van de prelimbische cortex expressie NpHR onder CaMKllα promotor elimineert spontane single-eenheid activiteit in vivo. Merk op dat de volledige silencing van prelimbische piramidale cel activiteit-tijd afgesloten om de 10 sec continu licht levering. LaagER raster plot (Figuur 4D) toont NpHR-geïnduceerde silencing in zes representatieve neuronen. Zowel in vivo opnamen typerend uit volwassen Sprague-Dawley ratten die AAV-gemedieerde afgifte van microbiële genen opsin opgetreden 18-21 dagen voor.

Figuur 5 toont het resultaat van herhaalde ChR2 stimulatie van een rat prelimbische piramidale neuronen. Blauw licht puls (10 msec) werd afgeleverd op 20 Hz voor 5 sec (100 pulsen totaal). Spanning sporen van het licht opgewekte stekelige werden keer om de 2 min verworven tijdens een 2 uur durende opnamesessie (61 herhalingen totaal). Zelfs bij gebruik van deze repetitieve stimulatie protocol ChR2 geïnduceerde stabiel en robuust stekelige reactie op het licht levering.

Figuren 6 en 7 tonen de resultaten van NpHR-geïnduceerde fotoinhibitie en ChR2-driven fotoactivering van rat subicular neuron activiteit. Net als in prelimbische cortex, NpHR en ChR2 kondenbemiddelen het licht geïnduceerde-tijd opgesloten remming en activering van de-opsin getransduceerde subicular neuronen met een hoge reproduceerbaarheid.

figure-results-1
Figuur 1. Screenshot van de NeuroLux Pro software-interface voor gelijktijdige lichte levering en elektrofysiologische opname. Afgebeeld trace laat NpHR geïnduceerde silencing van spontane activiteit van de rat prelimbische piramidale cel in reactie op 10 sec van continue 532 nm licht levering. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-2
Figuur 2. Afbeelding hoge vermogen van aangepaste optrode. Een optische vezel wordt ingebracht in glazen capillair buisje verbonden met een wolfraam elektrode en de elektrode bevestigd middels hechtdraad. De hart-op-hart afstand tussEEN punt van de elektrode en de vezel tip is ongeveer 500 micrometer.

figure-results-3
Figuur 3. Virale expressie en optrode plaatsing. (Links) Foto's tonen vertegenwoordiger NpHR expressie in dorsale subiculum (A) en ChR2 expressie in prelimbic cortex (B). (Rechts) Schematische de locatie waar elke foto werd genomen vertegenwoordigt. De pijlpunt en pijl in elke foto de vestigingsplaats van de wolfraam elektrode en glasvezel, respectievelijk. SUB: subiculum, DG: dentate gyrus, PL:. Prelimbic cortex Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-4
Figuur 4. In vivo elektrofysiologische opnames van ChR2 of NpHR-getransduceerde prelimb ratic cortex. (A) Voorbeeld spoor van ChR2-triggered actiepotentialen in reactie op 20 Hz levering van blauw (473 nm) lichtpulsen (10 msec, blauwe balk). (B) Raster grafiek die ChR2-geïnduceerde stekelige in zes representatieve neuronen. Elke eenheid activiteit wordt uitgezet als een stip. (C) Voorbeeld spoor van NpHR-geïnduceerde onderdrukking van spontane activiteit bij continu groen (532 nm) licht verlichting (10 sec, groene balk). (D) Raster grafiek die NpHR-geïnduceerde silencing in zes representatieve neuronen. Elke eenheid activiteit wordt uitgezet als een stip. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-5
Figuur 5. Repetitive 20 Hz ChR2-driven stekelige een rat prelimbische piramidale neuron in vivo. (A) Voltage sporen van het licht opgewekte stekeligeverkregen bij de tijdstippen 0, 30, 60, 90, 120 minuten na het begin van de opnamen. (B) Raster perceel met daarop alle 61 herhalingen (2 min inter-trial interval, 120 min totaal) van de licht-geïnduceerde activatie. Elke eenheid activiteit wordt uitgezet als een stip. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-6
Figuur 6. In vivo elektrofysiologische opnames van NpHR-getransduceerde rat dorsale subiculum. (A) Voorbeeld trace waaruit blijkt dat 10 sec continue 532 nm verlichting (groene balk) van de dorsale subiculum uiten NpHR elimineert spontane activiteit. (B) Gemiddeld golfvormen van de twee opgenomen eenheden uit het bovenstaande trace. De amplitude drempel werd gebruikt ter identificatie van twee verschillende neuronen. (C) Raster perceel met vijf herhalings van NpHR-geïnduceerde silencing van deze eenheden. Elke eenheid activiteit wordt uitgezet als een stip.

figure-results-7
Figuur 7. Repetitive 20 Hz-CR2 gedreven stekelige een rat dorsale subicular neuron in vivo. (A) Voltage sporen van licht opgewekte spiking verworven de tijdstippen 0, 30, 60, 90, 120 minuten na het begin van de opnamen. Inzet: typische barsten activiteit van deze cel. (B) Raster perceel met daarop alle 61 herhalingen (2 min inter-trial interval, 120 min totaal) van de licht-geïnduceerde activatie. Elke eenheid activiteit wordt uitgezet als een stip. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een breed scala aan technieken beschikbaar zijn voor genetisch-targeting microbiële opsin genen discrete hersengebieden bij knaagdieren. Virale gen delivery biedt een relatief goedkope en snelle aanpak voor het bemiddelen ChR2 en NpHR expressie met celtype-specificiteit. AAV vector systemen zijn een gemeenschappelijke keuze voor gebruik in optogenetic experimenten vanwege de hoge productiekosten titers die tijdens de opslag, het gebrek aan pathogeniciteit en het vermogen om op lange termijn genexpressie 10 produceren stabiel blijven. Veel van de opsin constructen met celtype-specifieke promotors zijn commercieel verkrijgbaar in een verscheidenheid van AAV serotypen van vector kernfaciliteiten zoals de Universiteit van Pennsylvania ( http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) of de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill ( http://genetherapy.unc.edu ). Een nadeel van AAV-technologie is debeperkte verpakkingscapaciteit (~ 4,7 kb), die een beperking legt op het transgen cassette formaat dat kan worden gebruikt voor de celspecifieke targeting. Als alternatief, lentivirale vectoren, die een grotere verpakkingen capaciteit, kunnen opsin richten onder de controle van grotere promotorsequenties tegemoet.

Het gebruik van een optrode een betrouwbare detectie van elektrofysiologische signalen in combinatie met tijdelijk nauwkeurige levering licht. Zoals hierboven beschreven, echter voldoende zorg nodig in de bouw. Omdat de gesplitste optische vezel is kwetsbaar, het binden van de hechtdraad te strak kan de vezel breken. Hoewel de optrode kan worden gebruikt voor meerdere opnamen moeten de elektrode en optische vezels worden gereinigd (of handmatig gesplitst bij de optische vezel blote einde) voor het inbrengen omdat de impedantie van de elektrode en de kwaliteit van het geleverde licht zal degraderen bij herhaald gebruik.

Tijdens electrophysiological opnamen is het belangrijk dat de optrode langzaam gevorderd. De optrode hier gebruikt heeft ongeveer 350 micrometer dik (wolframelektrode: 125 micrometer; kern van optische vezel: 200 pm) en het verlagen van het snel kunnen leiden tot verplaatsing van hersenweefsel. Licht-geïnduceerde artefacten kunnen eveneens worden overwogen met bijzondere opname en lichte levering set-ups 11-12. Hoewel we vonden geen licht-geïnduceerde artefacten in onze experimentele conditie kan opnamen buiten de getransduceerde hersengebied eventueel worden gebruikt als controle voor lichte voorwerpen. Een andere overweging tijdens het opnameproces is de benodigde lichtintensiteit voor het waarnemen van veranderingen in ChR2-of NpHR expressie neuronen, vooral voor lange duur opnames. Sterke laser intensiteit en lange laser verlichting kan door de weefselschade en / of een verminderde reactie op latere geleverde licht 12-13. Voor gedrags experimenten het gebruik van een controle virale vector is vereist eliminating enig effect door warmte geleverd door de vezel. Voor veel van de commercieel beschikbare optogenetic constructen zijn er aanvullende controle constructen waarin de opsin gensequentie is verwijderd.

Opgemerkt zij dat ontworpen ChR2 varianten met verbeterde eigenschappen en kinetiek ontwikkeld samen met andere silencing opsins die beter geschikt voor bepaalde experimentele bevat 14-15 zijn. Bijvoorbeeld, een nieuwe variant ChR2 ingesteld bij gerichte mutagenese, aangeduid als "Cheta" kan hifi neuronale spiking rijden bij frequenties (tot ten minste 200 Hz) boven die van het oorspronkelijke ChR2 14.

De combinatie van in vivo licht levering en gelijktijdige opname van neuronale respons is een cruciale stap bij het ​​vaststellen van causale verbanden tussen patroon activiteit in genetisch gerichte celpopulaties en overeenkomstige tijd opgesloten gedragsmatige gebeurtenissen. De procedures en hardware hier geschetste bieden een eenvoudige aanpak voor de uitvoering van optogenetics voor in vivo-head vaste opnames bij knaagdieren.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het National Institute on Drug Abuse (NIDA) subsidie ​​R01 DA24040 (DCC), Universiteit van Colorado Innovatieve Seed Grant (DCC), en NIDA opleiding subsidie ​​T32 DA017637 (MVB).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Spuit Hamilton7653-0110 μl
Verwisselbare NaaldHamilton7803-0331 gauge, afgeschuinde tip
Microinjector PompWorld Precision InstrumentsUMP3
PompcontrollerWorld Precision InstrumentsSYS-MICRO4
Silicone OlieAlfa AesarA12728
Laser Beschermende BrilKentekKMT-4501
Multimode Optische VezelThorlabsBFL37-200200 μm diameter kern, 0.37 NA
Vezel Strip ToolThorlabsT12S21voor 200 μm diameter kern multimode vezel
Optisch Vermogen MeterLumiphy LLCwww.lumiphy.com
FotodetectorNewport818-SL/DB
Blauwe Laser (445-473 nm, 100-200 mW)Lumiphy LLCwww.lumiphy.comgekoppeld aan een 200 μm multimode vezel met FC/PC adapter
Groene Laser (532 nm, 100-200 mW)Lumiphy LLCwww.lumiphy.comgekoppeld aan een 200 μm multimode vezel met FC/PC adapter
Wolfraam/Vezel OptrodeLumiphy LLCwww.lumiphy.comLumitrode
Glazen Capillaire BuisFisher Scientific22-362-566
Hydraulische MicromanipulatorNarishigeMO-22
VersterkerKation ScientificExAmp-20K
Data Acquisitie ApparaatNational InstrumentsNI USB-6009
Rodent Hoofdbescherming voor OpnameLumiphy LLCwww.lumiphy.com
Stereotaxische Eenheid voor Kleine DierenDavid Kopf InstrumentsModel 963

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  2. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), e299(2007).
  3. Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  4. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  5. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  6. Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
  7. Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  8. Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).
  9. Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, eg Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).
  10. McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).
  11. Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
  12. Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).
  13. Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
  14. Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
  15. Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Channelrhodopsine 2Halorhodopsinevirale vectortoedieningstereotactische injectieglasvezelelektrodesimultane opnamein vivo elektrofysiologielichttoediening

Gerelateerde artikelen