Bepaling van maaglediging Niet-invasieve [ 13 C]-octaanzuur ademtest voor het opsporen van gastroparese bij vrouwelijke NOD LTJ muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beoordeling van de maaglediging in niet-obese diabetische muizen met behulp van een [
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Maaglediging studies in muizen zijn beperkt door het onvermogen om maaglediging veranderingen in hetzelfde dier te volgen aangezien de meest gebruikte technieken vereisen doden van de dieren en postmortem herstel van de maaltijd 1,2. Deze aanpak voorkomt dat longitudinale studies om te bepalen veranderingen in de maaglediging met de leeftijd en de progressie van de ziekte. De meest gebruikte [13 C]-octaanzuur ademtest voor mens 3 is aangepast voor gebruik in muizen ratten 4-6 en 7 en we eerder aangetoond dat deze test betrouwbaar en reageren op veranderingen in maaglediging in respons op geneesmiddelen en tijdens diabetes progressie 8. In deze video presentatie van het beginsel en de praktische uitvoering van deze gewijzigde test wordt uitgelegd. Evenals in de vorige studie worden NOD LTJ muizen gebruikt, een model van type 1 diabetes 9. Een deel van deze muizen ontwikkelen symptomen van gastroparese, een complicatie van diabetes gekenmerkt door vertraagde maaglediging zonder mechanische obstructie van de maag 10.
Dit document laat zien hoe de muizen trainen voor het testen, hoe de test maaltijd te bereiden en het verkrijgen van 4 uur maaglediging data en hoe de verkregen gegevens te analyseren. De koolstofisotopen analyzer gebruikt in de onderhavige studie is geschikt voor de automatische monstername van de luchtmonsters tot wel 12 muizen op hetzelfde moment. Deze techniek maakt de longitudinale opvolging van maaglediging van grotere groepen van muizen met diabetes of andere langdurige ziekten.
Inleiding
Deze publicatie beschrijft de technische en methodologische overwegingen betrokken zijn bij niet-invasieve meting van maaglediging bij muizen. Door het volgen van het protocol hier beschreven, onderzoekers kunnen betrouwbaar en reproduceerbaar veranderingen in de maaglediging als gevolg van de ontwikkeling van de ziekte te volgen, vooral de invloed van farmacologische middelen op de maaglediging en volg de respons van de maaglediging op de behandeling van een ziekte of gebreken 6,8, 11,12. In eerdere publicaties de toepassing van 13C octaanzuur ademtesten bleek een nuttige manier meten maaglediging bij mensen en dieren 3,8 zijn. Dit document beschrijft in detail de procedures die nodig zijn om betrouwbare gegevens te verkrijgen over de 6 tot 8 maanden nodig zijn voor een longitudinale studie van de maaglediging bij muizen met diabetes. De voordelen van deze volgende protocol vergeleken met eerder gepubliceerde methoden zijn dat de onderzoeker kan de data obtaine verzekerdd zal zijn betrouwbaar en reproduceerbaar. Bovendien het automatische systeem voor het verzamelen en analyseren van de gasmonsters hier beschreven verhoogt het aantal dieren dat tegelijk kan worden gevolgd in een studie. Over het geheel genomen het doel van deze paper is het identificeren van de belangrijkste factoren die gewenning van de muizen op de proef en dat de variabiliteit te verminderen in de verkregen resultaten te handhaven.
Voor de in vivo meting van maaglediging, worden muizen overnacht gevast en in de transparante plastic testkamers met constante luchtstroom. Na de muizen krijgen gewend aan de buizen, basislijn uitgeademde 13 CO 2-gehalte wordt bepaald en luchtstroom overeenkomstig aangepast. Vervolgens beheren wij een testmaaltijd bestaande uit eidooier gemengd met 13 C-gelabelde octaanzuur. Omdat de muizen gevast en getraind, zij over het algemeen eten de testmaaltijd binnen 2 minuten. De toegediende octaanzuur niet wordt geabsorbeerd in de maag, maar wordt opgenomen in het duodenum eend krijgt in de lever in 13 CO 2 uitgezonden en uitgeademd, waardoor een verrijking van 13 CO 2 in de omgevingslucht. Luchtmonsters worden verzameld op bepaalde tijdstippen en geanalyseerd door de koolstofisotoop analyzer. De snelheidsbepalende stap in dit proces is maaglediging en de pulmonale uitscheiding van 13 CO 2 direct overeenkomt met maaglediging van het gelabelde maaltijd.
Figuur 1. Schema van maaglediging inrichting. Na een nacht vasten, worden muizen geplaatst in transparante kamers waardoor ze te bewegen en vrij kunnen draaien. Een inlaatbuis kan frisse lucht en constante stroom en een uitlaat leidt tot het isotoop analyzer het meten van de 13 C-to-12C verhouding in de uitgeademde lucht. De kamer heeft ook een centrale poort voor de voedselproducten met [13C]-octaanzuur.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Training en gewenning van de muizen
- Vóór analyse zet alle muizen in de testkamers voor 2-4 uur met constant debiet om ze wennen aan de testomstandigheden. Dit vermindert aanzienlijk stress die anders zouden kunnen leiden dat afwijkende detectie van vertraagde maaglediging. Behandel de muizen op dezelfde wijze als de maaglediging experiment werd uitgevoerd. Bereid eidooier (zie verder) zonder toevoeging octaanzuur en voeden 0,2 g aan elke muis.
- Herhaal dit proces totdat de muizen voldoende scholing (meestal 2-3 keer). De muizen doorgaans gemakkelijk gewend zolang de omgevingsomstandigheden zijn gelijk gehouden.
Opmerking: Niet-gewende muizen blijven bewegen voor ongeveer 1 uur na overschrijving naar de kamer, en en poepen urineren vaak, terwijl gewende muizen snel stil te vestigen in hun nieuwe omgeving en rust.
Geente: Tijdens het experiment: Monitor dieren op tekenen van verlies van gewenning, zoals teveel plassen, ontlasting, gebrek aan interesse in het eten van het ei. Als dit het geval heroverwegen habituating in een lege kamer 1-2 keer voordat deze maaglediging data. Consistentie is uiterst belangrijk terwijl het doen van dit experiment. Dingen doen op precies dezelfde manier elke keer is de enige manier om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te krijgen. Dit omvat waarbij behandeling (bijvoorbeeld insuline) elke dag op hetzelfde tijdstip, niet scheiden van de muizen uit de kooi mates niet absoluut noodzakelijk, de muizen vasten en starten van de maaglediging test tegelijkertijd recentelijk de muizen op dezelfde manier.
2. Voorbereiding van de isotoop die test-Meal
- Begin met een gewicht van 5 g van eigeel in een 50 ml falcon buis. Herhaal deze stappen elke experimentele dag om een frisse toets maaltijd te bereiden.
- Voeg 10 ul van octaanzuur met een concentratie van 2 ul / g in de 50 ml falcon-buis met de eieren toe en meng grondig gedurende 1 min met een spatel in de falcon-buis.
- Het ei wordt dan overgebracht naar een glazen beker en verhit met een bunsenbrander totdat het stolt en de samenhang is geschikt voor kleine ballen. Dit duurt gewoonlijk ongeveer 30 sec.
Opmerking: De ballen van eigeel moet 0,2 g af te wegen per muis. Dit is belangrijk om de cumulatieve dosis constant te houden in alle muizen.
3. Starten van het Experiment
- Eenmaal getraind en klaar voor de maaglediging, snel de muizen 's nachts (12 uur) op een metalen "mesh-bottom" vasten rack te coprophagia te voorkomen. Zorg ervoor dat ze hebben gratis toegang tot drinkwater. Aangezien diabetische muizen gebruikt in het huidige experiment, moeten ze niet vasten langer dan 16 uur.
- Begin met het opzetten van de maaglediging kamers. Gebruik schone kamers en covers die zijn lucht gedroogd. Ook eventuelebuizen verbinden de kamers naar de analyser of het CO 2 luchttoevoer moet vochtvrij, water kan interfereren met het signaal door het meetsysteem
- Sluit de kamers om de inlaatbuizen dat een constante lucht toe. Sluit vervolgens de uitlaatbuizen van de kamers aan de machine. Sluit de buizen en schakel de luchtstroom.
Opmerking: Breng een zeer kleine hoeveelheid Vaseline eind van het deksel deksels zodat ze gemakkelijk sluiten en veilig gesloten. Deze afdichting is noodzakelijk om alle kooldioxide door de muizen te verzamelen.
4. Experimentele Procedures
- Begin door weging van elke muis. Lichaamsgewicht is een maat voor hun voortdurende goede gezondheid. Plaats dan elke muis in de juiste kamer. Het is uiteraard belangrijk om het hebben stroomt in de kamers op dit moment.
- Om de meting te starten, zodat de muizen naar de kamers laten wennen voordat passenING de lucht niveaus.
- Zodra de muizen lijken kalme, kan dat een paar minuten duren, past u het luchtdebiet voor elke muis kamer. Dit kan voor elke muis. Typisch wordt de luchtstroom ingesteld op het begin van het experiment te waarborgen dat uitgeademde CO 2 bereikt vlak vast welke apparatuur wordt gebruikt, en ervoor te zorgen dat het niveau blijft laag genoeg gezonde lucht omzet te waarborgen. We maken gebruik van de eerste CO 2-uitstoot tussen de 1.000 en 1.500 delen per miljoen.
- Als problemen met aanpassingen, controleer op luchtlekkage. Dan herhaal het proces voor elk van de kamers en kijken voor een nieuwe ronde van de metingen om te zien of aanpassingen van de luchtstroom gecorrigeerd het CO 2-niveau. Het is belangrijk om een vlakke basislijn lezen voordat de muizen te voeren. We maken gebruik van een machine met een zelf kalibratie. Indien dit niet het geval kalibratie te controleren.
- Wanneer dit is bereikt, het beheer van de ei maaltijdnaar de eerste muis en neem de tijd elke muis krijgt het voedsel.
- We lopen de procedure voor het 4 uur om voldoende waarden te verkrijgen voor de montage van de 13 CO 2 verrijking curve voor elke muis. Controleer op de muizen elke 30-60 min om ervoor te zorgen dat de CO 2-niveaus nog steeds veilig zijn voor de muizen.
- Bereid nieuwe dozen met levensmiddelen vóór het einde van de test dat de muizen kan gaan eten direct na de test is.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een representatieve gegevensreeks uit drie verschillende muizen wordt weergegeven in figuur 2. De zwarte grafiek geeft de datapunten van een muis met normale maaglediging. Het toont de fractie van 13 C die wordt teruggewonnen in de uitgeademde lucht, uitgedrukt als een percentage van de toegediende dosis per uur uitgedrukt als een functie van tijd. De blauwe curve is van een muis met een versnelde maaglediging met een T half waarde van 40 min en de rode curve is van een muis met een vertraagd...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De beschreven techniek maakt hierin voor herhaalde of niet-invasieve in vivo meting van vaste maaglediging in muizen. Dit systeem heeft het voordeel dat de dieren niet beperkt in de meetkamer, zodat ze bewegen en vrij kunnen draaien. Aangezien dit een onbekende omgeving, de muizen moeten nog worden opgeleid en gewend aan het testen kamers om de effecten van stress te voorkomen op de maaglediging. In het algemeen we aannemen dat de maaglediging data betrouwbaar is als de intra-muis variabiliteit tussen opeenvolg...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Deze video publicatie is mogelijk gemaakt door financiële steun van het Nationaal Instituut voor Diabetes en Maag-, Darm-en nierziekten (NIDDK) voor het Programma projectsubsidie "Pathobiologie van het enterische systeem" DK 68055. Christopher T. Creedon werd ondersteund door het Rochester Public Schools mentorschap programma.
Wij danken de heer Gary Stoltz voor technische bijstand, mevrouw Kristy Zodrow voor secretariële ondersteuning en Dr Douglas Baer uit Los Gatos Research, Inc (Mountain View, CA).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| NAAM | BEDRIJF | CAT NUMBER | OPMERKINGEN |
| Een bron van constante luchttoevoer, flow en samenstelling | centrale luchttoevoer in de onderzoeksfaciliteit | ||
| 130 ml monsterkamer die luchtinlaat, luchtuitlaat, en voedsel administratie opening heeft Kunststof buizen voor luchttoevoer | In-huis gebouwd | ||
| Octaanzuur | Cambridge isotopenlaboratoria (Andover, MA) | CLM-293-1 | |
Om het ei maaltijd te bereiden:
| Elke leverancier | Probeer tein overeenstemming met het ei leverancier sinds de smakelijkheid en voedingswaarde van de eieren en maaglediging inname van de maaltijd beïnvloeden | |
| Kooldioxide isotoop analyzer | Los Gatos Research Inc (Mountain View, CA) |
Referenties
- Yeung, C. K., McCurrie, J. R. A simple method to investigate the inhibitory effects of drugs on gastric emptying in the mouse in vivo. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 45, 235-240 (2001).
- Osinski, M. A., Seifert, T. R., Cox, B. F., Gintant, G. A. An improved method of evaluation of drug-evoked changes in gastric emptying in mice. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 47, 115-120 (2002).
- Ghoos, Y. F., et al. Measurement of gastric emptying rate of solids by means of a carbon-labeled octanoic acid breath test. Gastroenterology. 104, 1640-1647 (1993).
- Symonds, E., Butler, R., Omari, T. Noninvasive breath tests can detect alterations in gastric emptying in the mouse. Eur. J. Clin. Invest. 32, 341-344 (2002).
- Symonds, E. L., Butler, R. N., Omari, T. I. Assessment of gastric emptying in the mouse using the [13C]-octanoic acid breath test. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 27, 671-675 (2000).
- Verhulst, P. J. Role of ghrelin in the relationship between hyperphagia and accelerated gastric emptying in diabetic mice. Gastroenterology. 135, 1267-1276 (2008).
- Schoonjans, R., et al. The 13C-octanoic acid breath test: validation of a new noninvasive method of measuring gastric emptying in rats. Neurogastroenterol. Motil. 14, 287-293 (2002).
- Choi, K. M., et al. Determination of gastric emptying in nonobese diabetic mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 1039-1045 (2007).
- Atkinson, M. A., Leiter, E. H. The NOD mouse model of type 1 diabetes: as good as it gets? Nat. Med. 5, 601-604 (1999).
- Camilleri, M. Clinical practice. Diabetic gastroparesis. N. Engl. J. Med. 356, 820-829 (2007).
- Choi, K. M., et al. Heme oxygenase-1 protects interstitial cells of Cajal from oxidative stress and reverses diabetic gastroparesis. Gastroenterology. 135, 2055-2064 (2008).
- Kashyap, P. C., et al. Carbon monoxide reverses diabetic gastroparesis in NOD mice. Am. J. Physiol. GI. G298, G1013-G1019 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
