Methodenartikel

Onderzoek van Macrophage Polarisatie behulp beenmerg afgeleide Macrofagen

DOI:

10.3791/50323

⸱

23 juni 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Animal Science, Texas A&M University, 2Department of Biology, Texas A&M University, 3Department of Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het artikel beschrijft een gemakkelijk gemakkelijk adaptieve In vitro Model om macrofaag polarisatie te onderzoeken. In aanwezigheid van GM-CSF/M-CSF worden hematopoietische stam / progenitorcellen uit het beenmerg gericht in monocytische differentiatie, gevolgd door M1 of M2 stimulatie. De activatie status kan worden gevolgd door veranderingen in celoppervlakteantigenen, genexpressie en signaaltransductie wegen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het artikel beschrijft een gemakkelijk gemakkelijk adaptief in vitro model om macrofaag polarisatie te onderzoeken. In aanwezigheid van GM-CSF/M-CSF worden hematopoietische stam / progenitorcellen uit het beenmerg gericht in monocytische differentiatie, gevolgd door M1 of M2 stimulatie. De activatie status kan worden gevolgd door veranderingen in celoppervlakteantigenen, genexpressie en signaaltransductie wegen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderscheiden van klassieke ontstekingsreacties macrofagen die weefsels infiltreren vertonen vaak gepolariseerd activeringsstatus die een cruciale rol in het regelen gastheerweefsel fysiologische functies 1-8 speelt. Na stimulatie kunnen macrofaagactivering worden gesorteerd in classic (M1) en alternatieve (M2) activering 2, 4, 9. M1 macrofaag activatie afhankelijk Toll-achtige receptoren (TLRs) en activering van nucleaire factor kappa B (NFKB) / c-Jun N-eindstandige kinase 1 (JNK1), wat leidt tot de productie van inflammatoire cytokines, zoals TNF-α en IL- 1β en activering van iNOS dat resulteert in verhoogde productie van reactieve zuurstofsoorten zoals nitride oxide (NO) 10, 11. Daarentegen M2 macrofaag activatie werft PPARy, PPARö of IL-4-STAT6 wegen, waardoor alternatieve, anti-inflammatoire (M2) activatie die is geassocieerd met verhoogde expressie van CD206 mannose receptor en arginase 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Sup>.

Beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM) presenteren een ideaal in vitro model om de mechanismen die polarisatie van geactiveerde macrofagen 15 begrijpen. Specifiek, kan de activering van macrofagen M1 worden geïnduceerd door lipopolysacchariden (LPS) stimulatie, terwijl polarisatie M2 macrofagen kunnen worden geïnduceerd door IL-4 en / of IL-13. Ouder beenmerg macrofagen en geactiveerde macrofagen kunnen worden geïdentificeerd aan flowcytometrie-analyse voor expressie van oppervlakte-antigenen, waaronder CD11b, F4/80, CD 11 c, CD206, CD69, CD80 en CD86 9, 16, 17. Bovendien kunnen veranderingen in cytokine productie en mobiele signaalwegen verbonden macrofaag polarisatierichting gemeten door kwantitatieve RT-PCR en Western-blotting, respectievelijk. Samenvattend kan muis beenmerg macrofagen dienen als een relevant model te bestuderen polarisatie macrofagen in vitro.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isolatie van beenmergcellen

  1. Isoleer bovenbeen en onderbeen botten 6-8 weken oude muizen, afspoelen haar en vervolgens opengesneden het bot.
  2. Gebruik een 21G naald en 10 ml spuit voor het spoelen van merg in koud PBS 2% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) (3-5 ml / muis).
  3. Passeren merg door een 21G naald 4-6 keer om de cellen te scheiden.
  4. Passeren cellen door een 70 um cel zeef om celklonten, botten, haar en andere cellen / weefsels te verwijderen.
  5. Voeg 3 volume van NH4 Cl oplossing (0,8% NH4Cl-oplossing, Stemcell Technology) en incubeer op ijs gedurende 10 min om rode bloedcellen te verwijderen.
  6. Spin down cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  7. Resuspendeer de celpellet in koude PBS +2% FBS (20-50 ml, afhankelijk van de hoeveelheid cellen).

2. Inductie BMDM Formation

  1. Resuspendeer de geïsoleerde beenmergcellen in BMDM groeimedium (2x10 6 cellen / ml).

BMDM groeimedium:

Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM) + 10% FBS + 15% gefiltreerd (0,2 urn) L-929 cellen (ATCC, CCL-1) kweek supernatant (dat monocyt-koloniestimulerende factor, M-CSF) of 10 ng / ml M -CSF.

Opmerking: L-929 celsupernatant bevat M-CSF 18. Om de effectieve activiteit van geconditioneerd medium, 5 zorgen X 10 5 L-929 cellen gezaaid in T75 cm2 kolven gedurende 6-7 dagen wordt het geconditioneerde medium verzameld en door een 0,45 uM filter voor gebruik. Medium aliquots kan onmiddellijk voor 1-2 maanden worden toegepast of opgeslagen in -80 ° C.

  1. Zaadcellen in 6 of 12 putjes weefselkweekplaten (afhankelijk van de proefopzet) (Corning Costar).
  2. Wijzig verse BMDM groeimedium op dag 3.
  3. Op dag 7, wordt de vorming van rijpe BMDM geëvalueerd middels flowcytometrie-analyseen fluorofoor geconjugeerde antilichamen te detecteren cellen die CD11b en F4/80.

3. BMDM gepolariseerde Activering

  1. Op dag 7, veranderen vers stimuleringsmedium: M1 voor activatie gebruikt IMDM dat 10% FBS en 100 ng / ml LPS of 100 ng / ml LPS bij 50 ng / ml IFNy, M2 voor activatie gebruikt IMDM dat 10% FBS met 10 ng / ml IL-4 en / of 10 ng / ml IL-13.
  2. Verzamel BMDMs gestimuleerd door deze los van de schaal met warm 0,05% trypsine, gevolgd door tweemaal wassen van de cellen met PBS bevattende 10% FBS.

Opmerking: Om los te maken en opnieuw in suspensie volwassen macrofagen na differentiatie, 0,05% trypsine-oplossing (bevattende 0,48 mM EDTA, Invitrogen) of 2-5 mM EDTA in Ca-en Mg-vrij PBS of gebalanceerde buffer Hank's (HBSS) kunnen worden gebruikt. Bij gebruik spijsvertering medium met trypsine worden cellen behandeld bij 37 ° C gedurende minder dan 10 min tot verlies sur voorkomengezicht eiwitten als gevolg van over-vergisting.

  1. Gebruik antilichamen voor expressie detecteren van celoppervlak antigenen, zoals CD11b, F4/80, CD 11 c, CD206, CD69, CD80 of CD86 op verschillende tijdstippen onder toepassing van standaard stroming cytometrie kleuringen.
  2. Bepaal expressie van genen kenmerkend geactiveerde M1 en M2 macrofagen waaronder IL-1β, TNF-α en IL-6 (M1 activering) of IL-10, IL-13, arginase1 en PPARy (M2 activatie) met qRT-PCR. Bepaal activering van cell signaling pathways betrokken bij de activering van de M1 of M2 macrofagen door western blotting analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische beschrijving van de generatie procedure BMDM wordt weergegeven (figuur 1). Zuiver van volwassen macrofagen kunnen worden waargenomen op dag 7 wanneer deze hoeveelheden 95-99% van CD11b + F4/80 + cellen (Figuur 2). Gepolariseerde macrofagen kunnen worden onderzocht met behulp van antilichamen tegen CD11b, F4/80, CD11c en CD206 gevolgd door flowcytometrie-analyse. Zoals getoond in figuur 3, worden M1 macrofagen gedetecteerd als CD11b + F4/80 CD11c + CD206...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij rapporteren hier een eenvoudige en gemakkelijk aanpasbaar vitro procedure activatie van macrofagen afgeleid van beenmerg cellen. Deze procedure kan worden gebruikt voor het onderzoek van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor polarisatie van macrofagen. De zuiverheid van volwassen macrofagen verkregen met dit protocol gemiddeld 95-99%, en geen extra zuivering vereist zijn. Om de functie van specifieke genen van belang te onderzoeken in het kader van macrofaag polarisatie, ectopische expressie of gens...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (BGIA 7.850.037 aan Dr Beiyan Zhou).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
IMDMThermo ScientificSH30259.01
Foetaal bovien serumInvitrogen10438-026
Murine GM-CSFPeproTech315-03
NH4ClStemCell Technologies7850
L-929ATCCCCL-1
70 μm celstrainerBD Biosciences352350
10 x PBSThermo ScientificAP-9009-10
Anti-muis CD11b-APCeBioscience17-0112-81
Anti-muis F4/80-FITCeBioscience11-4801-81
Anti-muis CD69-PEeBioscience12-0691-81
Anti-muis CD86-PEeBioscience12-0862-81
Propidium JodideInvitrogenP3566

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
  2. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
  3. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  5. Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
  6. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
  7. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
  8. Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
  11. Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
  12. Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
  13. Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
  14. Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
  15. Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
  16. Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
  17. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
  18. Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
  19. Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
  20. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FlowcytometrieReal time PCRWestern blotCeloppervlakteantigenenGenexpressieanalyseM1 M2 activatieCytokinedetectieCelstroompaden

Gerelateerde artikelen