Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

15.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50329

⸱

2 april 2013

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago , 2Department of Anesthesiology, University of Illinois at Chicago

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Samenvatting

Interactie van geactiveerde bloedplaatjes en leukocyten (neutrofielen voornamelijk) op het geactiveerde endotheel bemiddelt trombose en vasculaire inflammatie. 1,2 Tijdens trombusvorming op de plaats van verwonding arteriolaire, bloedplaatjes adherent aan het geactiveerde endotheel en subendotheliale matrix eiwitten ondersteunen neutrofiel hechting walsen en 3. Omgekeerd, onder venulaire inflammatoire aandoeningen, kan neutrofielen aanhanger van de geactiveerde endotheel ondersteunen hechting en de accumulatie van circulerende bloedplaatjes. Heterotypische bloedplaatjes aggregatie neutrofiel heeft sequentiële processen die specifieke receptor-counter receptor interacties tussen cellen. 4 Het is bekend dat geactiveerde endotheelcellen adhesiemoleculen zoals von Willebrand factor los wordt geïnitieerd bloedplaatjesadhesie en accumulatie onder hoge afschuifkrachten. 5 Ook geactiveerde endotheelcellen ondersteunen neutrofiele rollen en adhesie met het uitspreken van selectines eend intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectievelijk onder lage afschuifkrachten. 4 Platelet P-selectine neutrofielen door interactie met P-selectine glycoproteïne-1 ligand (PSGL-1), en veroorzaakt daardoor activatie van neutrofielen β2 integrines en stevig hechting tussen twee celtypes. Ondanks de vooruitgang in in vitro experimenten waarin heterotypische bloedplaatjes neutrofiel interacties bepaald in volbloed of geïsoleerde cellen, 6,7 studies die niet manipuleren oxidant stress tijdens vasculaire ziekte. In dit verslag met fluorescentie-gemerkt, specifieke antilichamen tegen een muis bloedplaatjes en neutrofielen marker beschrijven we een gedetailleerde intravitale microscopische protocol heterotypische interactie van bloedplaatjes en neutrofielen op de geactiveerde endotheel volgen tijdens TNF-α-geïnduceerde ontsteking of na laser geïnduceerde letsel bij cremaster spier haarvaten van levende muizen.

Protocol

1. Bereiding van intravitale microscoop (Figuur 1A)

  1. Bereid superfusie buffer (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 en 17 mM NaHCO3, pH 7,4).
  2. Zet een circulatoire waterbad temperatuur van buffer en een thermo-gecontroleerde deken te handhaven op 37 ° C. Beluchten buffer met stikstofgas (5% CO2 evenwicht met stikstof).
  3. Zet de microscoop systeem (Sutter Lambda DG-4 hoge snelheid golflengte-wisselaar, werkstation, Olympus BX61W microscoop, MPC-200 multi-manipulator, ROE-200 stage controller, high speed camera, en versterker).
  4. Voor de vasculaire ontsteking model, gebruik maken van een 100% dichroïsche spiegel. Trombose induceren door laser schade vervangen 100% spiegel met een 50/50% spiegel en zet een Micropoint laserablatie systeem.

2. Bereiding van Cremaster Muscle voor intravitale microscopie (figuur 1B)

  1. Verdoven van eenmannelijke muizen (6-8 weken oud, C57BL / 6) door ip injectie van ketamine (125 mg / kg lichaamsgewicht (BW)) en xylazine (12,5 mg / kg BW). De Universiteit van Illinois Institutionele Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd alle dierlijke zorg en experimentele procedures. Een inflammatoire model injecteren murine TNF-α (0,5 ug in 250 pl zoutoplossing) in een muis intrascrotally 3 uur voorafgaand aan beeldvorming (2-2,5 uur voorafgaand aan de operatie).
  2. Plaats de muis op een thermo-gecontroleerde deken bij 37 ° C op een intravitale microscoop lade.
  3. Trek de huid op het oppervlak van de nek met behulp van een tang en insnijden horizontaal de middellijn van het nekvel tot 1 cm met een schaar.
  4. Open voorzichtig de cervicale spieren met behulp van stompe schaar en verwijder de spieren rond de luchtpijp.
  5. Canule een PE90 buis in de luchtpijp om de ademhaling te moeilijk te elimineren.
  6. Verwijder de linkerkant van cervicale spier en isoleren de halsader van de omringende weefsels.
  7. C Annulaat een PE10 tube in de linker halsader voor infusie van antilichamen en extra verdoving.
  8. Verwijder voorzichtig en horizontaal insnijden van de scrotum huid. Om weefsel integriteit gedurende het experiment te houden, werd voorverwarmde buffer superfused over het chirurgische veld.
  9. Druk op de onderbuik met een pincet en trek voorzichtig een testikel met de andere pincet.
  10. Verwijder het omringende bindweefsel rond de testis.
  11. Verticaal Incise de cremaster spier en plat de spier over een glazen dekglaasje op een intravitale microscoop lade door pinning de periferie.
  12. Laat 10-20 minuten voor de spier om voorafgaand aan de verzameling van gegevens te stabiliseren. Cremaster spierarteriolen (voor trombusvorming) en venules (voor vasculaire ontsteking) met een diameter van 30-45 urn werden gekozen voor de studie.
  13. Aan anesthesie te onderhouden, giet 30-50 ml van dezelfde verdoving ongeveer elke 30 min door de halsader cannulus.

3. Intravitale microscopie voor TNF-α-geïnduceerde vasculaire ontsteking

  1. Na het plaatsen van de muis op de intravitale microscoop, open SlideBook 5.0-software en klik op "Focus Window" op de menubalk om de juiste optiek en doelstelling (60X) in te stellen.
  2. Infundeer Dylight 488-geconjugeerd rat anti-muis CD42c (0,1 ug / g BW in 100 ul zoutoplossing) en Alexa Fluor 647-geconjugeerd rat anti-muis Gr-1-antilichamen (0,05 ug / g BW in 100 ul zoutoplossing) via een jugulaire cannulus .
  3. Ga naar de menubalk, en klik op "Beeld vastleggen" op de werkbalk.
  4. Een nieuw menu zal verschijnen; In "Image", selecteer "Bin Factor" als 1x1 en selecteer "640" van de breedte en "460" op de hoogte.
  5. In "Filter Set", markeert u het selectievakje voor de kanalen die u wilt blootstellen en stel de belichtingstijd voor elk. Bijvoorbeeld, open kanaal: 10 ms, FITC-kanaal: 50 msec, en Cy5 kanaal: 50 msec.
  6. Selecteer "Time-Lapse Capture" om het aantal tijdstippen en aan te passen. For de ontsteking model, wordt het aantal tijdstippen op 1000-1500 met een interval van 200 msec (totale verstreken tijd: 5 min).
  7. Klik op "Test" om een ​​single-plane afbeelding te zien op de opgegeven belichtingstijd voor dat kanaal. Pas belichtingstijd en / of microscoop licht totdat het histogram een ​​adequate intensiteitsverdeling (Voor multi-channel capture, herhaal dit proces voor elk kanaal) toont.
  8. Zodra alle parameters zijn ingesteld (kanalen, belichtingstijden, enzovoort) in het "Beeld vastleggen", selecteer "Start" om het vastleggen te beginnen.
  9. Monitor rollen en aanhanger bloedplaatjes en neutrofielen gedurende 5 min in de bovenste helft van een ontstoken cremaster venule in de vasculaire ontsteking model. Acht tot tien verschillende venulen worden opgenomen in een muis.
  10. Beelden werden genomen met een totale vergroting van 60x (1,0 NA water immersie objectief) die een venstergrootte van 157 um x 118 um.
  11. Na voltooiing van het experiment werden de muizen gedood via cervicale dislocation.

4. Data Analyse voor de venulaire Ontsteking Model

  1. Open SlideBook 5.0-software en klik op "Map" in de menubalk om een ​​bestand te openen.
  2. Klik op het drop-down menu Kanaal en selecteer "Open, FITC, Cy5, enz."
  3. Klik op "renormalize (rood en groene balken)" en selecteer het kanaal. Sleep de rode en groene balken naar links of rechts tot ongeveer optimaliseren fluorescentiesignaal.
  4. Klik op "Apply" en "OK" om het beeld bij te werken.
  5. Klik op "Thumbnail Button" om de huidige weergave als standaard te selecteren.
  6. Speel gevangen Timelapse beeld, en tel rollen en aanhanger neutrofielen gedurende de periode van 5 minuten.
  7. Om bloedplaatjes trombusvorming te analyseren, ga naar "Mask" en selecteer "Create".
  8. Noem een ​​masker en markering "In het huidige beeld".
  9. Klik op "Large potloodpictogram" in "Marquee Tool" in de hoofdweergave.
  10. Kleur een gebied buiten het schip in de hoofdweergave opslaan om een ​​achtergrond masker in te stellen.
  11. Ga to "Mask", klik op "Kopieer dit vliegtuig", "Kopiëren masker in de huidige tijdpunt" en selecteer "Alle tijdstippen", en klik op "OK".
  12. Om achtergrondsignaal te berekenen, gaat u naar "Statistieken" en klik op "Mask Statistieken".
  13. Klik op "Huidige 2D Time Lapse of 4D Image (s)" in Afbeelding Scope, en selecteer "Volledige Mask" in Mask Scope. In Features, selecteert u "Verstreken tijd (uu: mm: ms)" onder Data Capture, selecteert u "Area (pixels)" onder morfometrie, "Maximum Intensity" onder Intensiteit, en klik op "Export" (Deze statistiek methode stelt ons in staat om berekenen auto-fluorescentie-intensiteit (achtergrond signaal)).
  14. Open het tekstbestand in MS Office Excel en bereken de gemiddelde waarde van de achtergrond signaal gedurende de registratieperiode. Dit is de achtergrond fluorescentie-intensiteit.
  15. Om trombus intensiteit vast te stellen, klikt u op "Large potloodpictogram" weer in de "Marquee Tool" in de hoofdweergave.
  16. Kleur in het vat in de hoofdweergave van de bloedplaatjes-signaal in te stellen.
  17. Ga naar "Mask", klik op "Kopieer dit vliegtuig", "Kopiëren masker in de huidige tijdpunt" klikt, selecteert u "Alle tijdstippen", en klik op "OK".
  18. Ga naar "Statistieken" en klik op "Mask Statistieken".
  19. Klik op "Huidige 2D Time Lapse of 4D Image (s)" in Afbeelding Scope, en selecteer "Volledige Mask" in Mask Scope. In Features, selecteert u "Verstreken tijd (uu: mm: ms)" onder Data Capture, selecteert u "Area (pixels)" onder morfometrie, selecteer "Som Intensity" onder Intensiteit, en klik op "Export" (Deze statistiek methode ons in staat stellen berekenen de fluorescentie-intensiteit in het vat).
  20. Open het tekstbestand in MS Office Excel. Fluorescentiepiek van bloedplaatjes wordt berekend door de gemiddelde waarde van x achtergrondintensiteit Area (pixel) van de som intensiteit van het inwendige van het schip. Dit is de fluorescentie-intensiteit van de bloedplaatjes thrombus.
  21. Herhaal deze in 30 verschillende venules 3-5 verschillende muizen. Vervolgens berekent gemiddelde waarde van de fluorescentiesterkte van bloedplaatjes.
  22. Naarhet analyseren van de neutrofiele rollen en adhesie, werd de rollende instroom van neutrofielen bepaald over 5 min in elke venule en gepresenteerd als het aantal cellen per minuut. Het aantal adherente neutrofielen die waren stationair> 30 sec en langzaam kroop (<10 pm meer dan 30 seconden), maar niet omrollen, werden geteld en weergegeven als het aantal cellen per 5 minuten.

5. Intravitale microscopie voor Laser-induced arteriolaire trombose

5-1 Kalibratie van ablatie laser

  1. Plaats een gespiegelde dia op microscoop podium, breng een kleine druppel gedestilleerd water tot de bovenkant van de glijbaan, en pas de intensiteit en scherpstellen met de oculair.
  2. Open "Focus Window" en selecteer de "FRAP" tab in SlideBook 5.0 software.
  3. Zet de laser vermogen bij 40-50, en stel beide "Dubbelklik herhalingen" en "Dubbelklik size" tot 8. Markeer op de "Guide" box te brengen tot een set van dradenkruis.
  4. Selecteer de "Pijl" icoon van de taakbalk on de bovenkant van het scherm.
  5. Onder de "FRAP Uitlijning" tab, klik op "Fire next". Een klein plekje moeten verschijnen bij de linker benedenhoek van de monitor. Zodra de vlek verschijnt, dubbelklikt u op het midden van het. Wanneer u hierop klikt, moet een andere plek boven verschijnen en aan de rechterkant van de eerste plek; dubbelklik op het. Herhaal dit voor 16 punten (de 16 e plek verschijnt in de rechter benedenhoek.) Klik op "Opslaan" wanneer u klaar bent om de kalibratie parameters bij te werken.
  6. Om de nauwkeurigheid van de kalibratie te testen, klikt u op de "Center" knop-een klein plekje moet worden weergegeven in het midden van het scherm. Zo niet, herhaal de kalibratie tot de gewenste nauwkeurigheid is bereikt.

5-2 Laser-induced arteriolaire trombusvorming

  1. Plaats een verdoofde muis (zie procedure van 2-2 tot 2-12) op de microscoop podium.
  2. Onder de "Capture" venster, selecteer een protocol of een nieuwe maken. De standen zijn als volgt: CY5 (70 msec blootstelling), Open (10 MSEc belichting) en FITC (50 msec blootstelling). Opname wordt gemaakt dan 20 minuten (ongeveer 2.400 tijdstippen met een interval van 500 msec).
  3. Infundeer Dylight 488-geconjugeerd anti-muis CD42c en Alexa Fluor 647-geconjugeerd anti-muis Gr-1 antilichamen zoals hierboven beschreven.
  4. Optimaliseer microscoop parameters, inclusief fluorescentie-intensiteit en helderveld beeld zoals beschreven in 3-3 om 3-7.
  5. Klik op de knop "Test" om een ​​goede helderveld intensiteit of antilichaam-signaal, arteriole plaatsing en scherpstelling.
  6. Klik op "Start" om het beeld vast te leggen op gang te brengen.
  7. Voor de ontploffing de ablatie laser, zorg ervoor dat de muisaanwijzer icoon is geselecteerd en dat de vaatwand is in duidelijke focus.
  8. Om de laser schieten, dubbelklikt u op een plek twee tot drie micrometer intern vanaf de vaatwand. Beschadiging van de arteriolaire endotheelcellen veroorzaakt een visueel vormverandering dat moet duidelijk zijn in het helder veldbeeld, gevolgd door bloedplaatjes accumulatie. Monitor trombusvorming gedurende 5 minuten na de laser letsel.
  9. Vijf minuten na de laser letsel (de trombus omvang moet nu stabiel) pauzeren en annuleren de vangst. Vervolgens start een capture met 2400 tijdstippen met een interval 500 msec adherente bloedplaatjes, voortschrijdend / hechtende neutrofielen opgenomen gedurende 20 minuten. Drie tot vijf arterioles worden in een muis.
  10. Na voltooiing van het experiment werden de muizen gedood via cervicale dislocatie.

6. Data Analyse voor de arteriolaire Trombose Model

  1. Ga over de stappen 4.1 tot 4.5.
  2. Als u de achtergrond fluorescentie-intensiteit te verkrijgen tijdens bloedplaatjes trombusvorming, gaan over de stappen 4,7 tot 4,14.
  3. Ga naar "Mask", klik op "Segment", selecteer FITC in kanaal, en steek de gemiddelde waarde van de achtergrond signaal op Laag. Klik op "Apply" en "OK".
  4. Om de fluorescentie-intensiteit van bloedplaatjes thrombus (Dylight 488-geconjugeerd anti-CD42c antilichaam) analyseren gaan over de stappen 4,18 tot 4,19. Aan het antilichaam signaal berekenen, "Sum Intensity" wordt afgetrokken door het achtergrondsignaal ("Maximum Intensity" x "Area (pixels)"). Dit is de fluorescentie-intensiteit van de bloedplaatjes thrombus.
  5. Om de rollen en aanhanger neutrofielen kwantificeren, spelen de timelapse en tel het aantal cellen die zichtbaar rollen over de bloedplaatjes trombus meer dan 20 minuten. Rollen wordt gedefinieerd als een afname in neutrophil snelheid tijdens de interactie met de bloedplaatjes trombus minstens 2 sec. Hechtende neutrofielen worden gedefinieerd als neutrofielen die aan de bloedplaatjes trombus voor ten minste 2 minuten. Het aantal rollen en aanhanger neutrofielen werd gepresenteerd als het aantal cellen per 20 minuten. Rolling snelheid werd berekend met behulp van een deeltje tracking systeem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Behulp van een gedetailleerde intravitale microscopie analyse heterotypische bloedplaatjes neutrophil interacties op het geactiveerde endotheel werden gevisualiseerd door infusie van fluorescent gelabelde antilichamen tegen bloedplaatjes (CD42c) of neutrofielen marker (Gr-1) in levende muizen.

In een model van TNF-α-geïnduceerde ontsteking venulaire werden de meeste rollen neutrofielen stabiel gehecht aan het endotheel vermoedelijk door interactie van geactiveerde β2 integrinen met ICAM-1 ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor real-time fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire ontsteking en trombose. Voorheen soortgelijke fluorescentiemicroscopische benaderingen werden gemeld aan het moleculaire mechanisme van trombusvorming en vasculaire ontsteking te bestuderen. 8,12 Sinds de heterotypische cel-cel interactie van belang kunnen zijn voor de vaso-occlusie van de schade site...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (P30 HL101302 en RO1 HL109439 naar JC) en de American Heart Association (SDG 5270005 naar JC). A. Barazia werd ondersteund door een T32HL007829 NIH training subsidie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
NaClFisher Scientific7647-14-5
KClSigma-Aldrich7447-40-7
CaCl2 2H2OSigma-Aldrich10035-04-8
MgCl2 6H2OFisher Scientific7791-18-6
NaHCO3Fisher Scientific144-55-8
0,9% NaCl SalineHospira0409-4888-10
KetamineHospira0409-2051-05
XylazineLloyd
Intramedic Tubing (PE 90)BD Diagnostics427421
Intramedic Tubing (PE 10)BD Diagnostics427401
Murine TNF-αR&D Systems410-MT
Dylight 488- gelabeld rat anti-muis CD42b-antilichaam Emfret AnalyticsX488
Alexa Fluor 647-geconjugeerd anti-muis Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antilichaamBioLegend108418
NESLAB EX waterbad/circulatorThermo-Scientific
Olympus BX61W microscoopOlympus
TH4-100 PowerOlympus
Lambda DG-4Sutter
MPC-200 multi-manipulatorSutter
R–-200 stage controllerSutter
C9300 hogesnelheidscameraHamamatsu
IntensifierVideo Scope International
Ablation LaserPhotonic Instruments, Inc.
SlideBook 5.0Intelligent Imaging Innovations

Referenties

  1. Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
  2. Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
  3. Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
  4. Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
  5. Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
  6. Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
  7. Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
  8. Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
  9. Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
  10. Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
  11. Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
  12. Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
  13. Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
  14. Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
  15. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
  16. Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Intravitale microscopiefluorescente antilichamencremasterspierTNF alfalaserschade
Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.