Methodenartikel

Een

18.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50332

⸱

12 juni 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, University of Heidelberg

In dit artikel

Samenvatting

Monocyt-afgeleide macrofagen belangrijke cellen van het aangeboren immuunsysteem. Hier beschrijven we een eenvoudig te gebruiken In vitro Model om deze cellen te genereren. Met behulp gradiëntcentrifugatie, negatieve kraal isolatie en specifieke cel kweekomstandigheden, kan monocyt-afgeleide macrofagen worden gegenereerd voor fenotypische en functionele studies.

Samenvatting

Monocyt-afgeleide macrofagen een belangrijke celtype van het aangeboren immuunsysteem. Muismodellen bestuderen macrofaag biologie lijden de fenotypische en functionele verschillen tussen muizen en humane monocyt-afgeleide macrofagen. Daarom beschrijven we hier een in vitro model voor primaire humane macrofagen produceren en te bestuderen. Kort na dichtheidsgradiënt centrifugering van perifeer bloed getrokken uit een onderarm ader, monocyten geïsoleerd uit perifeer bloed mononucleaire cellen met negatieve magnetische bead isolatie. De monocyten worden vervolgens gekweekt gedurende zes dagen in bepaalde omstandigheden verschillende macrofaag differentiatie of polarisatie induceren. Het model is gemakkelijk te gebruiken en omzeilt de problemen veroorzaakt door species-specifieke verschillen tussen muis en mens. Bovendien is dichter bij de in vivo omstandigheden dan het gebruik van geïmmortaliseerde cellijnen. Kortom, de hier beschreven model is geschikt om te studeren macrophage biologie, identificeren ziektemechanismen en nieuwe therapeutische doelwitten. Hoewel niet volledig experimenten met dieren of menselijke weefsels verkregen post-mortem vervangen, de hier beschreven model maakt de identificatie en validatie van de ziekte mechanismen en therapeutische doelwitten die zeer relevant zijn voor verschillende ziekten bij de mens kunnen zijn.

Inleiding

Monocyt-afgeleide macrofagen een belangrijke cellulaire component van het aangeboren immuunsysteem en bijdragen aan vele acute of chronische ontstekingsprocessen 1. Macrofagen spelen een belangrijke rol in vele inflammatoire ziekten zoals atherosclerose of kanker 2. Macrofagen een hoge plasticiteit en kunnen verschillende fenotypes afhankelijk van de plaatselijke micromilieu 3 nemen. Aldus bestuderen macrofaag differentiatie en heterogeniteit is essentieel voor het verhogen van de kennis van de pathofysiologie van vele ziekten en identificatie van nieuwe therapeutische doelwitten en ontwikkeling van nieuwe therapieën mogelijk.

In veel gevallen worden muismodellen gebruikt om de pathofysiologie van bepaalde ziektebeelden. Echter, het bestuderen macrofaag biologie gebruikt muismodellen vergezeld door verscheidene tekortkomingen: (1) Het aantal leukocyten deelverzameling getallen (bijvoorbeeld monocyten en granulocyten) in raHeral bloed van muizen of mensen verschilt sterk suggereert verschillende rollen van monocyten in muizen en menselijke pathofysiologie. (2) Er bestaan ​​aanzienlijke verschillen in genexpressie tussen muis en mens perifere bloed monocyten suggereert substantiële verschillen in hun functie tijdens gezondheid en ziekte 4. (3) een aantal markers die worden gebruikt om murine monocyten en macrofagen (F4/80, LYC, etc.) Identificeren bestaat niet in humane myeloïde cellen, die de overdracht van de bevindingen in muismodellen de menselijke situatie nogal moeilijk.

Dus, om ons inzicht in macrofaag differentiatie en ongelijkmatig menselijke ziekte te verhogen, moeten we gebruik van modellen werken met menselijke macrofagen maken. Daarom beschrijven we hier een model van menselijke primaire macrofagen generatie die gemakkelijk te gebruiken en maakt studie van humane monocyt-afgeleide macrofagen in vitro onder verschillende omstandigheden die leiden tot verschillende macrofaag posatie types. In verscheidene studies hebben we de in vitro model van monocyt-afgeleide primaire humane macrofagen macrofaag biologie en het potentiële relevantie voor de menselijke atherosclerose 5-7 analyseren.

Hoewel niet volledig experimenten met dieren of menselijke weefsels verkregen post-mortem vervangen, de hier beschreven model maakt de identificatie en validatie van de ziekte mechanismen en therapeutische doelwitten die zeer relevant zijn voor verschillende ziekten bij de mens kunnen zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Protocol

  1. Buffers Bereid als volgt:
    1. Bereid buffer voor PBMC isolatie: "Was buffer" = 0,02% EDTA in PBS (gebruik 0,5 M EDTA).
    2. Bereid buffer voor monocyt isolatie: "MACS spoelbuffer" = 0,5% BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 pl) + PBS (50 ml). Degas de buffer.
    3. Bereid buffer voor FACS kleuring en opslag van cellen: "FACS buffer" = 10% FCS in PBS en "fixatie buffer" = 1% PFA in PBS.
  2. Trek 30 ml bloed uit een ader onderarm. Gebruik EDTA als antistollingsmiddel.
  3. Isoleer PBMC (histopaque) als volgt:
    1. Bereid twee steriele 50 ml buizen (geen poly-styreen).
    2. Verdunnen het bloed van stap 2 met PBS 01:01.
    3. Voeg 25 ml histopaque + 25 ml bloed / PBS per tube. Zorg ervoor dat histopaque en bloed gaan niet samen.
    4. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder rem.
    5. Aspireren plasma en gooi het weg.
    6. Aspireren ondoorzichtige interface en pipet in schone 50 ml bade.
    7. Voeg 20 ml van 0,02% EDTA in PBS.
    8. Centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    9. Gooi supernatant.
    10. Voeg 10 ml van 0,02% EDTA in PBS.
  4. Telling cellen als volgt:
    1. Meng goed door vortexen gedurende 10 sec.
    2. Neem 200 pi celsuspensie + 300 pi 0,02% EDTA in PBS + 500 pi van trypan blauw (200-500 cellen/10 pleinen, anders verandert verdunningsfactor).
  5. Voer negatieve isolatie van monocyten als volgt:
    1. Centrifugeer cellen verkregen in stap 3.10 gedurende 10 min, 120 x g. Gooi supernatant.
    2. Wassen celpellet 2x met 10 ml PBS + 0,02% EDTA en centrifugeer gedurende 10 min, 120 x g.
    3. Voeg 9 ml steriel water voor 3 seconden, voeg 1 ml 10X PBS.
    4. Nogmaals wassen met PBS + 0,02% EDTA en centrifugeer 10 min, 120 x g.
    5. Telling tijdens centrifugeren.
    6. Verdunnen EasySep buffer bij 5 x 10 7 / ml.
    7. Voeg 50 ul / ml monocyten verrijking pikstaart.
    8. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    9. Vortex kralen voor 30 sec.
    10. Voeg 50 ul / ml korrels.
    11. Incubeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    12. Vul met EasySep buffer volume van 2,5 ml voltooien. De oplossing lijkt nu bruinachtig.
    13. Zet in magneet.
    14. Wacht 2,5 min bij kamertemperatuur. Gedurende deze tijd niet-monocytcellen gebonden aan de magnetische kraal zal verhuizen naar de buiswand en plakken daar.
    15. Giet buffer met niet-bindende monocyten in de frisse steriele buis. Deze oplossing ziet er witachtig.
    16. Was eenmaal met PBS + 0,02% EDTA en centrifugeer gedurende 10 min, 120 x g.
  6. Cellaag in een plastic schaal of meerwandige plaat bij een dichtheid van 0,5 x 10 6 / cm 2. Voeg 1 ml kweekmedium / 1 x 10 6 cellen.
  7. Cultuur cellen onder omstandigheden van belang zijn voor 6-14 dagen.
  8. Wijzig media na 3 dagen door het vervangen van 50% van de media met verse media (zie tabel 1 voor details).
  9. Na zes dagen oogst cellen voor mRNA isolatie, flowcytometrie, Western blotting, etc.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met de hierboven beschreven protocol, we routinematig 25,1 x 10 6 ± 2,2 x 10 6 monocytes/100 ml bloed (gemiddelde ± standaard fout van 26 onafhankelijke experimenten, figuur 1A) te verkrijgen. Monocyt zuiverheid zoals bepaald door flow cytometrische kleuring voor CD14 is routinematig meer dan 95% (97.1 ± 0.4%, gemiddelde ± standaard fout van 3 onafhankelijke experimenten, figuur 1B). Levensvatbaarheid van vers geïsoleerde monocyten cel zoals bepaald door trypan bla...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Monocyt-afgeleide macrofagen vertegenwoordigen de belangrijkste celtype van het aangeboren immuunsysteem. Zij spelen een belangrijke rol in vele ontstekingsziekten waaronder atherosclerose of kanker 2. Aldus bestuderen macrofaag biologie is essentieel voor het vergroten van onze kennis over de pathofysiologie van vele ziekten en ontwikkeling van nieuwe therapieën mogelijk.

Vele studies toepassing van muismodellen overexpressie of ontbreken bepaalde genen van belang. Bij monocyt-af...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hoeven niet te eventuele belangenconflicten bekendmaken.

Dankbetuigingen

Wij danken Nadine Wambsganss voor een uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) en deels door een subsidie ​​van het Innovatiefonds FRONTIER (Universiteit van Heidelberg) naar CAG

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
50 ml centrifuge tube (steriele)Fisher055398
D-PBS (1X), vloeibaar (geen calcium of magnesium)Invitrogen14190-250
EDTASigmaT9285
BSASigmaA-8806
FCSInvitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment KitStemCell Technologies19059
EasySep MagnetStemCell Technologies18000
FACS tubesFisher352008
Macrophage-SFM (1X)Invitrogen12065-074
Penicillin-streptomycinSigmaP-4458
Nutridoma-SPRoche11011375001
menselijke M-CSF 10 μgPeprotech300-25
Cell Culture Plates 6-wellFisher07-200-80

Referenties

  1. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  2. Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
  3. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  4. Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
  5. Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
  6. Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
  7. Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
  8. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
  9. Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
  10. Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656(2012).
  11. Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
  12. Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
  13. Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
  14. Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
  15. Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
  16. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668(2010).
  17. Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  18. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  19. Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Monocytenisolatiedichtheidsgradi ntcentrifugatienegatieve bead isolatiemacrofaagpolarisatieflowcytometriekwantitatieve PCRopname van geoxideerd LDLM1 M2 markersmononucleaire cellen uit perifeer bloed

Gerelateerde artikelen