De ventriculaire cerebrospinale vloeistof (CSF) baadt de neuro-epitheliale en cerebrale corticale progenitorcellen tijdens de vroege ontwikkeling van de hersenen in het embryo. Hier beschrijven we de methode ontwikkeld om ventriculaire CSF isoleren van knaagdieren embryo's van verschillende leeftijden om zijn biologische functie onderzoeken. Daarnaast tonen wij onze cerebrale corticale explantatie dissectie en cultuur techniek die voor explantatie groei mogelijk maakt met een minimale hoeveelheid voedingsoplossing of liquor.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van de cerebrospinale vloeistof uit Knaagdieren Embryo's voor gebruik met Ontleed cerebrale corticale Explantaten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het CSF is een complexe vloeistof met een dynamisch variërende proteoom tijdens de ontwikkeling en in de volwassenheid. Tijdens de embryonale ontwikkeling de ontluikende CSF opzichte van het vruchtwater na sluiting van de voorste neurale buis. CSF volume neemt dan de daaropvolgende dagen als de neuro-epitheliale stamcellen langs de ventrikels en de choroidea plexus genereren CSF. De embryonale CSF contacten de apicale, ventriculaire oppervlak van de neurale stamcellen van de ontwikkelende hersenen en het ruggenmerg. CSF biedt cruciaal vloeistofdruk voor de uitbreiding van de zich ontwikkelende hersenen en distribueert belangrijke groeibevorderende factoren om neurale progenitorcellen in een tijdelijk-specifieke wijze. Het onderzoeken van de functie van de CSF, is het belangrijk om zuivere monsters van embryonale CSF isolaat zonder contaminatie van bloed of de ontwikkeling telencephalic weefsel. Hier beschrijven we een techniek relatief zuivere monsters van ventriculaire embryonale CSF dat gebruikt kan worden voor isolerendiverse experimentele proeven, waaronder massaspectrometrie, eiwit elektroforese, en cellen en primaire explantaatkweek. We laten zien hoe te ontleden en cultuur corticale explantaten op poreuze polycarbonaat membranen om de ontwikkeling van corticale weefsel groeien met verminderde volumes van media of CSF. Met deze methode kunnen experimenten uitgevoerd met CSF van verschillende leeftijden of voorwaarden om de biologische activiteit van de CSF proteoom onderzoeken op doelcellen.
Inleiding
Het CSF is een complexe vloeistof die de ontwikkeling van neuro-epitheel één-zes baadt en biedt essentiële druk 7 en groeibevorderende aanwijzingen voor de zich ontwikkelende hersenen 8-12. Om de CSF te bestuderen in de loop van ontwikkeling van de hersenen, we technieken ontwikkeld om ventriculaire CSF te isoleren van het ontwikkelen van rat of muis embryo's tijdens de verschillende stadia van ontwikkeling 6,9. Vorige methoden van isolatie opgenomen met behulp van een glazen micro-naald en het isoleren van de CSF met behulp van een micro-injector 1,2. Onze methode maakt gebruik van een glazen micro-capillaire pipet wiens tip is getrokken om een ultrafijne punt voor een betere penetratie te creëren. De glazen micro-capillaire pipet is verbonden met een aspirator zodat ventriculaire CSF verzameling kan worden bediend met lichte veranderingen in druk. Om de stamcellen invloeden van CSF signalen te onderzoeken, ontleden we cerebrale corticale explantaten, leg ze op polycarbonaat membranen, en drijven ze op juiste culture medium aangevuld met CSF monsters 9. Met deze techniek verminderde hoeveelheden media cultuur voldoende zijn om het weefsel, waardoor een efficiënt gebruik van CSF 9.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Embryo Isolatie / Voorbereiding
Deze techniek kan worden gebruikt voor muis of rat. In dit protocol demonstreren we de CSF collectie techniek en cerebrale corticale explantatie dissectie met muis embryonale hersenen. We zullen reageren op een belangrijke verschillen voor ratten versus muizen die bestaan binnen de algemene technieken. Voor de embryonale leeftijd staging systeem, E1 geclassificeerd als de dag van de plug voor ratten en E0.5 is geclassificeerd als de dag van de plug voor muizen.
- Bereid een micro-dissectie schotel met Sylgard Silicone elastomeer. Sylgard 184 siliconelastomeerfase wordt geleverd als een tweedelige vloeibare component, deel A en deel B. Deel A en deel B worden gemengd in een verhouding 10:1 naar gewicht of volume. Nadat de vloeibare componenten worden gemengd, giet de Sylgard elastomeer in een petrischaal het gehele oppervlak van de schaal te dekken. Sommige kunnen er luchtbellen aanwezig zijn die te elimineren tijdens het uithardingsproces te zijn. Plaats de petrischaal deksel aan en laat de elastomer om te genezen. De elastomeer kan worden uitgehard bij kamertemperatuur gedurende 24 uur, of bij hogere temperaturen (bijvoorbeeld 37 ° C) voor een snellere uitharding. Zodra de vloeibare componenten stollen, de dissectie schotel is klaar voor gebruik. De schotel kan herhaaldelijk worden gebruikt voor meerdere experimenten, mits goed schoongemaakt na de procedure.
- Bereiding van de micro-capillaire pipet (naald). Micro-capillaire pipetten worden bereid door het toepassen van warmte en trek met behulp van een Narishige PC-10 verticale micropipet trekker met de volgende instellingen: Een stap pull; Heater # 2 bij 58; 100 g pull gewicht. De fijne punt van de micropipet wordt zorgvuldig knapte uit met fijne # 55 tang. De resulterende gemiddelde binnendiameter van de naald is 85 um.
- Bereid de aspirator assemblage voor CSF aspiratie. Steek micro-plunjer voorzien van micro-capillaire pipetten in de capillaire naald. Alternatief hechten plastic wegwerp filter aan het einde van de aspirator-samenstel dat is verbonden to de micro-capillaire pipet. Steek de naald door de pakking in positie aan het andere einde van het samenstel aspirator.
- Overdracht geïsoleerd embryo uit het nest van een micro-dissectie gerecht bereid met Sylgard.
- Verwijder de extra-embryonale membranen en weefsels zodat de embryo duidelijk blootgesteld. Elke weefsellaag-first de baarmoederwand en vervolgens de decidua-kan worden ontleed met behulp van fijne iridectomie schaar (dwz Fine Science Tools # 15000-02). Op elke implantatie eerst de baarmoederwand, dan decidua kunnen parallel worden ingesneden om de lange as van de baarmoeder en de incisie kan dan verder worden geopend met fijne pincet. De decidua kan worden verwijderd na een gelijkaardige incisie, waardoor de vliezen. Voorzichtigheid is geboden, zodat de vliezen niet zijn ingesneden of beschadigd is.
- Wassen met steriele Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en overtollig vocht uit de omringende embryo met een pipet en een filter of Kimwipepapier gesneden in driehoeken.
2. Ventriculaire CSF Collection
- Visualiseer embryo onder de dissectie microscoop: voor muis, het embryo moet worden tot op zijn kant, zodat men een sagittale uitzicht op de zich ontwikkelende embryo heeft. Met rat E16 embryo of ouder, plaats de embryo op de dorsale wervelkolom, langs de langste vlakke dimensie van een craniaal caudaal, alsof het embryo op zijn rug. Op deze wijze CSF kan worden vanuit de rechter en linker laterale ventrikel.
- Gestaag plaats de micro-capillaire pipet in het laterale ventrikel, mesencefale ventrikel of cisterna magna, proberen niet de neuro cellen contact nadat de pipet is geplaatst. Voor muis embryo E14.5 of ouder kan de CSF worden afgezogen van de rechterkamer en de naald verwijderd en ingebracht in de linker ventrikel. Door het vrijhouden van de ventrikels en de neurale buis in embryo jonger dan E14.5, dehele CSF volume kunnen vaak worden opgezogen uit de laterale ventrikels met een enkele naald inbrengen. Dit is echter niet altijd het geval ontwikkeling tijden en patency van de verbindende ventrikels kunnen enigszins variëren en derhalve de micro-capillaire pipet kan ook worden ingevoegd in de cisterna magna de maximale CSF volume verzamelen.
- Nadat de micro-capillaire pipet wordt in de laterale ventrikel, mesencefale ventrikel of cisterna magna, zorgvuldig en langzaam beginnen afzuigen van het CSF in de pipet, met behulp van de micro-zuiger onderdruk creëren en het CB zuigen of door een lichte onderdruk die door de mond zodat CSF begint te stromen voorzichtig in de micro-capillaire pipet in een langzame en gecontroleerde wijze. Wij bevelen aan dat de kijker wordt verbinding gemaakt met hun eigen lokale functionarissen met betrekking tot de institutionele beleid op deze benaderingen.
- Blijf negatieve druk uit te oefenen en de CSF verzamelen in de micro-capillaire pipet.In zowel muis als rat embryo's van E16.5/E17 of jonger, is het mogelijk om het ventrikel ineenstorting licht waarnemen door het verschijnen van een graszode die aan de zijkant van het hoofd dat de micro-capillaire pipet inch In oudere embryo door de grotere omvang van de hersenen, kan het niet mogelijk is de kop instorten.
- Stop uitoefenen van druk en voorzichtig de micro-capillaire pipet uit het laterale ventrikel.
- Voorzichtig te verdrijven van de CSF monster in een Eppendorf buis die is gekoeld op ijs.
- Gaan met het verzamelen van de CSF van een hele nest van dieren en bundelen de monsters in dezelfde buis.
- Centrifugeer bij 10.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 min om eventuele contaminerende cellen te verwijderen.
- Analyseer de monsters op tekenen van besmetting van neuroepitheliale cellen of rode bloedcellen. Tekenen van verontreiniging worden meestal aangeduid met de vloeistof verschijnen troebel of rood / roze, of de aanwezigheid van een pellet met een zich bloed vlek. Na centrifugeren werd de CSF kan microscopisch worden onderzocht op tekenen van cellen of celresten. Als er tekenen van verontreiniging van de vloeistof moet worden weggegooid. Als bijkomende kan de pellet gehalte eveneens worden gekleurd voor cellen. Een schone CSF monster kan worden gebruikt voor celkweek, corticale cultuur spectrometrie, western blot, ELISA en andere assays. De heldere CSF worden overgebracht naar een nieuwe steriele Eppendorf buis. Het monster kan nu gebruikt worden voor analyse, samengevoegd met andere monsters of snap bevroren met vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C. Het invriezen en ontdooien van kleine monsters van fluïdum kan leiden tot een klein volume en veranderingen afname in eiwitconcentratie. Dit kan vermeden worden door vriesdrogen monsters.
3. Corticale Explantatie Dissection
- Breng de E14.5 embryo geïsoleerd van het nest op een micro-dissectie gerecht bereid met Sylgard.
- Verwijderen van embryo extra-embryonale membranen en weefsels zoals beschreven in stap 1.5.
- Wassen met steriele Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en verwijder overtollig vocht uit de omringende embryo met behulp van een pipet.
- Prepareer door het cervicale gebied scheidt de kop van de rest van de embryo (figuur 1A).
- Met behulp van een fijne scalpel (oogheelkundige mes), het kappen van de middellijn van de hoofdhuid. Pak beide zijden van deze incisie met fijne tang en verwijder de huid. Vervolgens gebruikt iridectomy schaar om een incisie dat de lengte van de middellijn van ontwikkeling cranium loopt maken. Vervolgens nog eens twee insnijdingen, ongeveer 1/3 van de afstand van het voorste en achterste uiteinden van de ontwikkeling schedel. Gebruik fijne tang om de "flappen" van cranium vatten die voortvloeien uit dit deel van de dissectie en de ontwikkeling schedel weefsel verwijdert blootstellen van de cortex (Figuur 1B).
- Met de scalpel bisect de hersenen langs de middellijn in de mid-sagittale vlak, het scheiden van de rechter en linker hemisferen corticale (figuren1B, C). De pia en arachnoidea worden overgelaten aan de cortex, en de dura wordt verwijderd samen met de ontwikkeling van schedel.
- Afzonderlijk Bereid elke corticale halfrond. Plaats de hemisfeer mediale kant naar boven zodat u de zenuwcentra verhevenheid en de ontwikkelingslanden cortex (figuur 1C, D) te zien.
- Met behulp van de scalpel, maak een coronale incisie door de corticale neuroepitheel caudaal van de zich ontwikkelende bulbus olfactorius. Deze incisie moet beginnen op de voorste rand van de laterale en mediale ganglion grootheden, en zich uitstrekken door de voorste cingulate gebied van de ontwikkeling van corticale rudiment (figuur 1E).
- Maak nog een coronale incisie net caudaal van de achterste begrenzing van de laterale ganglion eminence (Figuur 1F). Deze incisie ook uitstrekken vanaf de laterale begrenzing van de ganglionische eminence de mediale wand van de ontwikkeling corticale rudiment.
- Trek de corticale "flap" created de twee incisies in stappen 3.7 en 3.8, met een scalpel of zachte druk van een stroom van HBSS geleverd met een pipet om 200 ul mechanische beschadiging van de cortex voorkomen. Maak dan een dwarse incisie langs de grens tussen de laterale ganglionische eminence uit de ontwikkelingslanden cortex (Figuren 1G, H). Vervolgens ontleden weg ontwikkelingslanden hippocampus en corticale zoom van de mediale telencephalon, aan de top van de neocortex waar de laterale corticale oppervlak aan de wand interhemisferische.
- Een dwarse incisie langs de grens tussen de laterale ganglionische eminence de ontwikkeling cortex (figuur 1H).
- Verwijder extra ontleed weefsel dat de plaat uit de Sylgard ontleed corticale explantaat. Men kan gebruik maken van zachte pipetteren met verse HBSS buffer om pipetteer weg extra ontleed weefsel. De ontleed cortex is nu met meningeale zijde naar beneden (Figuur 1I).
4. De overdracht van Corticale Explantatie
- Bereid een platina draad lus verbonden met een glazen pipet. Verhit de glazen pipet met een gevouwen platinadraad ingebracht in het uiteinde van de glazen pipet. Door het draaien aan het einde van de loop platinadraad, kan de grootte van de lus worden verhoogd of verlaagd, en de lus kan worden afgestemd op de grootte van de gewenste explantaat passen. (Dit kan vooraf bereid worden en hergebruikt.)
- Verhit het einde van de platinadraad de loop steriliseren.
- Isoleer de ontleed corticale explantatie en verwijder de extra HBSS media door zachte pipetteren, waardoor een kleine hoeveelheid te gebruiken met de draad lus.
- Plaats een 1 cm polycarbonaatmembraan in een 4 cm diameter imaging schotel.
- Met behulp van de kant van de platina draadlus voorzichtig draait u de cortex, zodat de meningeale zijde naar boven wijst.
- Neem de corticale explantaat uit de dissectie schotel, door het plaatsen van het explantaat in het midden van de lus en het gebruik van de intrinsieke hydrostatische krachtenTil de explantatie op een plat vlak.
- Plaats voorzichtig de explant het polycarbonaatmembraan en til de platinadraad lus zodanig dat het explantaat blijft op het membraan op een plat vlak met de ventriculaire oppervlak contact maakt met membraan.
- Til het membraan en pipetteer 50 ul van KVP of andere media onder het membraan.
- Bedek de imaging schotel, plaats het in een bevochtigde secundaire container, en incuberen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 24 uur om verdere celproliferatie en explant groei. Figuur 2 toont een schema van de uiteindelijke corticale explant schotel voorbereiding.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De CSF collectie moet opleveren een heldere, transparante vloeistof. Er geen bewijs van besmetting van bloed, zoals blijkt uit een rood of geel getinte vloeistof in de aspiratie en de Eppendorf buis. Er moet ook geen bewijs van weefsel in de aspiratie en Eppendorf buis. Wanneer het CSF gecentrifugeerd, kan men ook microscopisch beoordelen CSF te waarborgen dat er geen vervuiling. In aanwezigheid van verontreiniging, dient het CB worden weggegooid. Van de ene E14.5 muis nest, kan men anticiperen op het verzamelen 10 tot ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De beschreven werkwijze voor ventriculaire CSF collectie leverde relatief zuivere monsters van embryonale CSF met stabiele en consistente eiwitsamenstelling activiteit in een aantal cellulaire assays 9. Met een goede techniek voor het verzamelen en worpgrootte van tien E14.5 muizen, kan men verwachten tot 10-15 ul CSF te verzamelen en uit een nest van E16 ratten, kan men verwachten te verzamelen ca 50-90 ul van CSF. Deze collectie techniek minimaliseert vervuiling door bloed en weefsel, door zorgvuldige obser...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
We zijn dankbaar voor de steun van het NIH (Award nummers R00 NS072192 aan MKL, HD029178 om AS.L., en 2 RO1 NS032457 naar CAW). MKL is de ontvanger van de Children's Hospital Boston Career Development Fellowship / Harvard Medical School Shore Fellowship en een Fellow van de Alfred P. Sloan Foundation. CAW is een onderzoeker van de Howard Hughes Medical Institute.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van de Reagens / Materiaal | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| Wiretrop II capillaire naalden | Drummond Scientific | # 5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Lijmen | # 184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator binnenband | Sigma | # A5177-5EA | |
| Wegwerpfilter | Venturi of lokale apotheek | niet beschikbaar | Standaard sigaret filter |
| Roundstock oftalmische mes (15 graden stab mes) | Wereld Precision Instruments, Inc | # 500250 | |
| 35mm glazen bodem cultuur schotel | MatTek Corp | # P35G-1.5-14-C | |
| Platina-iridium draad | TriTech Onderzoek | # PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membraan | Whatman papier | # 09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | # SH30031.FS | |
| Iridectomie Schaar | Fine Science Tools | # 15.000-02 |
Referenties
- Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).
- Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).
- Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).
- Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid. Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).
- Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).
- Desmond, M. E., Jacobson, A. G. Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure. Developmental Biology. 57 (1), 188-198 (1977).
- Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).
- Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).
- Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).
- Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).
- Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Trefwoorden
Isolatie van cerebrospinale vloeistofCollectie van embryonale liquorCorticale explantaatkweekVentriculaire liquoraspiratiePolycarbonaatmembraankweekControle op liquorcontaminatieVoorbereiding van micropipettenEmbryonale dissectietechniekCentrifugatieprotocol voor liquorScheiding van corticale hemisferen
