Een eenvoudige en betrouwbare techniek voor het visualiseren en kwantificeren luchtwegen trilharen beweeglijkheid en trilharen gegenereerde stroom met behulp van de muis luchtpijp wordt beschreven. Deze techniek kan worden aangepast om te bepalen hoe een groot aantal factoren beïnvloeden cilia motiliteit, zoals farmacologische agentia, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals slijm belasting.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ex vivo methode voor High Resolution Imaging van Cilia Motility in Knaagdieren luchtwegepithelen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een ex vivo techniek voor beeldvorming muis luchtwegepitheel voor de kwantitatieve analyse van beweeglijke cilia functie belangrijk inzicht in mucociliaire klaring functie werd vastgesteld. Vers geoogste muis luchtpijp wordt overlangs doorgesneden de trachealis spieren en gemonteerd in een ondiepe ommuurde kamer op een glazen bodem schotel. De trachea monster geplaatst langs zijn lengteas te profiteren van de trachealis spier langsrichting krullen. Dit maakt beeldvorming van ciliaire beweging in het profiel te bekijken langs de gehele tracheale lengte. Video met 200 frames / sec worden verkregen met behulp van differentieel interferentie contrast microscopie en een hoge-snelheid digitale camera aan de kwantitatieve analyse van cilia slagfrequentie en ciliaire golfvorm laten. Met de toevoeging van fluorescerende kralen tijdens beeldvorming, cilia gegenereerd fluïdumstroming ook kan worden bepaald. Het protocol tijd omspant ongeveer 30 minuten, met 5 min voor Kamer voorbereiding, 5-10 minuten voor het monstermontage en 10-15 min bij videomicroscopie.
Inleiding
Analyse van beweeglijke cilia functie in het luchtwegepitheel is experimenteel belangrijk voor het ophelderen van de genetische en omgevingsfactoren die mucociliaire klaring en pulmonaire gezondheid 1 beïnvloeden. De eenvoudig protocol ontwikkeld voor de beeldvorming van de muis luchtwegepithelen biedt een efficiënte methode om de luchtwegen trilharen beweeglijkheid ondervragen in mutant en knockout muismodellen en vereisen alleen basisvaardigheden in muis tracheaweefsel dissectie en ex vivo beeldvorming van de luchtwegen trilharen beweeglijkheid met een hoge resolutie videomicroscopie. Dit protocol werd opgesteld en verfijnd tijdens een grootschalige muis mutagenese screen om een snelle evaluatie van de beweeglijke trilharen functie (cilia slagfrequentie, cilia verslaan vorm, cilia gegenereerde stroom) toelaten in mutanten met een aangeboren hartaandoening in verband met heterotaxy 2-5.
Voor deze technieken om luchtwegen cilia beweeglijkheid studie kunnen worden gegroepeerd in hetzij de acute ex vivo aard of longer term in vitro experimentele benaderingen. Acute experimenten zijn ex vivo visualisatie van de menselijke neus / luchtwegen borstel biopten 6,7 en analyse van eenvoudige dwarse luchtwegen secties 8. De in vitro benaderingen gebruiken diverse celkweek technieken om vellen van gedifferentieerde trilharen epitheel, zoals in de lucht-water grensvlak culturen of luchtwegen suspensiekweken 9-11 genereren. Echter, deze luchtwegepitheel reciliation technieken vereisen zeer aanzienlijke investering in tijd en training voordat bruikbare gecilieerde epitheliale cellen worden geproduceerd in experimenten (4-6 weken 9,10). Terwijl acute ex vivo analyse van luchtwegepitheel borstel biopsies worden gewoonlijk gebruikt voor menselijke klinische studies, is deze methode niet bruikbaar muisstudies verergerd door mechanische weefselschade 12.
De techniek die in dit protocol voor de analyse van mouse tracheale luchtwegepitheel is niet alleen eenvoudig te voeren, maar vereist geen speciale vaardigheden of dissectie gespecialiseerde inrichtingen naast die standaard beeldvormend videomicroscopie. Er zijn veel voordelen aan deze eenvoudig protocol. Ten eerste, omdat de muis trachea weefsel oogsten is snel en eenvoudig uit te voeren, is het mogelijk een snelle vaststelling van de luchtwegen cilia functie in een groot aantal muizen. Dit zijn acute analyse van de korte termijn effecten van verschillende in vitro behandelingen. Ten tweede wordt een ex vivo techniek de trilharen luchtwegepitheel bevestigd blijft aan het onderliggende steunweefsel en daarmee geassocieerde signaaltransductie wegen behouden. Daarom in vergelijking met in vitro reciliated luchtwegepitheel, dit preparaat is een betere weergave van de natuurlijke in vivo weefselmilieu. Ten derde, dit protocol kan de verwerving van een aantal verschillende kwantitatieve parameters die de objectieve beoordeling van beweeglijke cilia f kan biedenzalving. Tenslotte, in tegenstelling tot andere methoden voor de luchtwegen trilharen visualisatie Dit protocol maakt visualisatie van de cilia loodrecht op de trilharen ritme richting, waardoor profiel te bekijken van de cilia die optimaal is voor een hoge resolutie afbeelding van cilia beat en metachronalgolven golfopwekking .
Dit protocol kan worden gemodificeerd op een aantal manieren om een groot aantal experimentele behoeften zoals de rol van farmacologische middelen, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals mucus belast luchtwegen trilharen functie en productie / onderhoud pakken luchtwegen trilharen beat en metachronalgolven golfvoortplanting.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Reagentia Setup
1.1 Dissection en Imaging Medium
Leibovitz L-15 medium (L15) aangevuld met FBS (10%) en penicilline-streptomycine (100 eenheden / ml penicilline G natrium en 100 ug / ml streptomycine sulfaat) wordt gebruikt zowel bij oogst en beeldvorming van trachea monsters.
2. Ondiepe Walled Cultuur Kamer Vergadering
De kamer gebruikt trachea weefsel wordt getoond in figuur 1. De vloer van de kamer is de glazen bodem 35 mm cultuur schotel. De boven-en zijkant van de kamer wordt gegenereerd door het plaatsen van een klein stukje van 0,3 mm dik siliconen lakens over de glazen schaal. De rand van het vel wordt gesneden om de ronde bodem gerecht past en het centrum is verder getrimd tot een ondiepe centrale kamer te vormen (zie stappen 2.1-2.3). Bovenop dit samenstel, wordt een 18 mm rond dekglaasje geplaatst op een kast voor beeldvorming genereren.
- Volledig bedekken van een 18 mm ronde glazen deksel slip met een vierkant van 0,3 mm dik siliconen lakens.
- Met standaard scherpe dissectie schaar knipt u de overtollige silicone beplating van rond de rand van het dekglas (resulterend in een cirkelvormige laag siliconen platen).
- Met een scherp scalpel uitgesneden en verwijderen van een centraal plein van siliconen platen (ongeveer 10 vierkante mm) uit het midden van de overdekte dekglas (en vormt aldus de bovenkant en zijkanten van de beeldvorming kamer).
3. Luchtpijp Oogst en bereiding
- Euthanaseren muizen in overeenstemming met de lokale institutionele verzorging van dieren en gebruik commissie en / of de overheid richtlijnen en verwijder luchtpijp in een standaard plastic 35 mm cultuur schotel met voldoende L15 media te dompelen weefsel (auteurs hebben muizen gebruikt net vóór de geboorte bij een zwangerschapsduur van 16.5 dag, tot pasgeboren, neonatale en volwassen dieren 2).
- Verwijder niet-trachea weefselschade te aan de buitenkant vande luchtpijp met stompe dissectie.
- Verwijder het strottenhoofd met een dwarse snede net onder de cricoid kraakbeen met behulp van micro-dissectie schaar (Figuur 2A, lijn 1).
- Verwijder de linker en rechter primaire bronchiale takken met een dwarse snede boven de carina met microdissectie schaar (Figuur 2A, lijn 2).
- Houd het luchtpijp met fijn pincet en spoel het lumen 2-3 keer met ~ 1 ml van het zwemwater L15 medium met een P1000 Pipetman en P1000 tip om alle slijm en bloed te wissen.
- Knip een 3-4 ringsegment van luchtpijp via een dwarse snede met micro dissectie schaar (Figuur 2B, lijn 1).
- Snijd lengterichting door het midden van de trachealis spier van deze korte luchtpijp segment met behulp van micro dissectie schaar (Figuur 2B, lijn 2).
- Snijd lengterichting door het midden van de tracheale kraakbeen ringen met behulp van micro-dissectie schaar (figuur 2C , lijn), waardoor twee secties van trachea weefsel geschikt voor imaging (enkele sectie weergegeven in figuur 2D).
4. Cilia Imaging
- Transfer luchtpijp weefselsegmenten, lumen kant naar beneden, naar het midden van een 35 mm glazen bodem cultuur schotel met 100-200 ul van L-15 medium.
- Kwantificeren cilia gegenereerde stroom een kleine hoeveelheid van fluorescente 0.20 urn microsferen de L-15 medium zwemmen de trachea weefselmonster (~ 1 x 10 11 deeltjes / ml of 20 ul / ml van het Fluoresbrite 2,5% waterige suspensie van microsferen).
- Plaats de beeldvorming kamer voorheen opgesteld (zie Procedure 1-3 hierboven) op de bovenkant van de luchtpijp monster siliconen vel naar beneden, met de luchtpijp monster gelegen in het midden van de ondiepe ommuurde kamer gevormd door het raam gesneden in de siliconen platen (Figuur 1 ).
- Druk voorzichtig op de dekglaasje aan vast te zetten en eventuele overmaat L-15 media te verwijderen uit de randen usinga P1000 tip en P1000 Pipetman.
- Monteer de 35 mm glazen bodem cultuur schotel en luchtpijp monster op een omgekeerde microscoop met 100X objectieve en DIC optiek.
- Met behulp van een high-speed camera en film acquisitie software verzamelt films van cilia beweeglijkheid bij 200 + frames per seconde langs de trilharen tracheale epitheel van de opgerold rand van de trachealis spier (vak E Figuur 2D geschetst: bijvoorbeeld stilstaand beeld uit opgenomen film) (Aanvullende Movie 1).
- Met behulp van FITC epifluorescerende beeldvorming en een weinig licht CCD-camera (zie apparatuur lijst hierboven), het verzamelen van films van fluorescerende microbolletjes beweging over het oppervlak van de trilharen tracheale epitheel om later kwantificering van cilia opgewekte stroom (Aanvullend Movie 2) toestaan.
5. Kwantificering van Cilia Motiliteit
- Laad DIC belichte films in de ImageJ softwarepakket en volgens de procedure beschreven door I-techniekain Drummond 13 gebruiken de lijn tool om een raster lijn oversteken van het kloppend trilharen trekken. Een "reslice" van deze lijn genereert een kymograaf type afbeelding waar cilia beweging over de lijn genereert een golfpatroon. Het aantal pixels tussen elke golf piek is ze gemeten (een pixel = een filmbeeld) waaruit het aantal beats per minuut (dwz Hz) dan kan worden berekend.
- Om cilia gegenereerde stroom belasting fluorescerende kraal films te meten in de ImageJ software pakket, en gebruik de MTrackJ plugin 14 om handmatig fluorescerende kralen bijhouden over het oppervlak van de luchtpijp epitheel en laat de software genereren kraal snelheid en richting voor elke kraal bijgehouden.
Zorg moeten worden genomen bij het gebruik van fluorescerende kralen te stromen kwantificeren als de afstand van het kloppend trilharen kunnen sterk beïnvloeden gemeten stroom magnitude. De kraal beweging in Aanvullende Movie 2 is een goed voorbeeld van. In dit voorbeeld beadbeweging is snel aan het oppervlak van het verslaan van cilia en beduidend daalt af voor kralen verder weg in de baden media. Om controle hiervoor bead traceringen alleen worden op een vaste afstand boven de trilharen epitheel in alle monsters om correcte vergelijkingen worden gemaakt. Tenslotte, om representatieve gegevens over fluïdumstroming verkrijgen kralen worden bijgehouden voor zo lang mogelijk, we liever bead tracks die 10 + haarcellen bestemmen voor het berekenen van fluïdumstroming.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Controle luchtwegen trilharen moet duidelijk zichtbaar zijn en gezien te verslaan in een gecoördineerde wijze (Aanvullende Film 1; filmweergave wordt vertraagd tot 15% real-time), met merkbare stroming in de richting van cilia beat (aanvullende Movie 2; filmweergave is 100% real time). Kwantificering van cilia films moeten de resultaten vergelijkbaar met dat in figuur 3 opleveren. Collectie van high-speed DIC films maakt de kwantificering van cilia slagfrequentie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Meting van cilia slagfrequentie (CBF) is relatief eenvoudig met behulp van hoge microscoop doelstellingen vermogen en snelle image acquisitie hardware 13,15, en legt uit waarom CBF metingen vormen de basis van de meeste onderzoeken naar mucociliaire klaring tijdens gezondheid en ziekte. Hoewel CBF ook essentieel voor het begrijpen van mucociliaire klaring, meting van CBF alleen voorbij de onderliggende belang van beide ciliaire gegenereerde stroom en cilia slaan golfvorm, die beide zijn moeilijker te meten, w...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het project werd ondersteund door NIH-subsidie U01HL098180 van de National Heart, Lung, and Blood Institute. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Heart, Lung, and Blood Institute of de National Institutes of Health
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | Geen fenolrode kleurstof |
| Fetal bovien serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicilline-Streptomycine | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fijne pincetten | Roboz | RS-4976 | |
| Dissectie schaar | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissectie schaar | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm ronde glazen deksels | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastiek 35 mm kweekschalen | Corning | 430588 | |
| Glazen bodem 35 mm kweekschalen | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Siliconen plaat 0,012" (0,3 mm) dik | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0,20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microsferen | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverteer microscoop, met 100x olie objectief en DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Merk is niet kritiek. |
| 100-watt kwiklamp, epifluorescente FITC excitatie/emissie filters | Lecia | Merk is niet kritiek. | |
| Microscoop standaard Incubator | Lecia | 11521749 | Niet vereist als er cilia bij kamertemperatuur worden afgebeeld |
| Hoge snelheid camera helder veld | Vision Research | Phantom v4.2 | Merk is niet kritiek. Moet sneller zijn dan 125 fps |
| Hoge snelheid fluorescentie camera | Hamamatsu | C9100-12 | Merk is niet kritiek. Moet sneller zijn dan 10 fps |
| Filmanalyse software | National Institutes of Health | ImageJ met MtrackJ plugin |
Referenties
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
