Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

PRP als een nieuwe aanpak om infectie te voorkomen: Voorbereiding en

21.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50351

⸱

9 april 2013

 , 
1Department of Orthopaedics, School of Medicine, West Virginia University , 2Department of Orthopaedics, Stem Cell Research Center, University of Pittsburgh, 3WVNano Initiative, 4Mary Babb Randolph Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

Implantaat-geassocieerde infectie is een significante klinische complicatie. Deze studie beschrijft een aanpak met bloedplaatjes-rijk plasma (PRP) van het implantaat-geassocieerde infecties, presenteert het protocol voor het bereiden PRP met constante concentratie van bloedplaatjes en rapporteert de nieuw geïdentificeerde antimicrobiële eigenschappen van PRP en bijbehorende protocollen voor de behandeling van dergelijke antimicrobiële eigenschappen In vitro.

Samenvatting

Implantaat-geassocieerde infectie wordt steeds meer en meer uitdagend om de gezondheidszorg over de hele wereld als gevolg van toenemende resistentie tegen antibiotica, de overdracht van antibiotica resistente bacteriën tussen dieren en mensen, en de hoge kosten van de behandeling van infecties.

In deze studie beschrijven we een nieuwe strategie die effectief in het voorkomen implantaat geassocieerde infectie gebaseerd op de potentiële antimicrobiële eigenschappen van bloedplaatjesrijk plasma (PRP). Door zijn goed bestudeerde eigenschappen voor het bevorderen genezing heeft PRP (een biologisch product) steeds meer gebruikt voor klinische toepassingen zoals orthopedische operaties, periodontale en orale chirurgie, maxillofaciale chirurgie, plastische chirurgie, sportgeneeskunde, etc.

PRP kan een geavanceerd alternatief voor conventionele antibiotica voorkomen implantaat-geassocieerde infecties. Het gebruik van PRP voordelig kunnen zijn in vergelijking met conventionele antibiotica siNCE PRP is minder kans op resistentie tegen antibiotica te induceren en PRP's antimicrobiële en helende eigenschappen te kunnen een synergetisch effect op infectiepreventie hebben. Het is bekend dat ziekteverwekkers en menselijke cellen race voor implantaatoppervlakken en PRP eigenschappen bevorderen genezing kunnen menselijke celhechting verbeteren waardoor de kans op infectie. Daarnaast PRP is inherent biocompatibel, en veilig en vrij van het risico van overdraagbare ziekten.

Voor ons onderzoek hebben we gekozen een aantal klinische bacteriestammen die gewoonlijk worden aangetroffen in orthopedische infecties en onderzocht of PRP heeft in vitro antimicrobiële eigenschappen tegen deze bacteriën. Wij hebben PRP met tweemaal centrifugeren benadering waarmee dezelfde bloedplaatjesconcentratie worden verkregen voor alle monsters. We hebben bereikt consistente antimicrobiële bevindingen en vond dat PRP sterk is in vitro antimicrobiële eigenschappen tegen bacteriën, zoals methicillin-gevoelige en methicilline-resistente Staphylococcus aureus, groep A Streptococcus en Neisseria gonorrhoeae. Daarom kan het gebruik van PRP hebben het potentieel om infectie te voorkomen en de dure postoperatieve behandeling van implantaten geassocieerde infecties te verminderen.

Inleiding

Implantaat-geassocieerde infectie is een belangrijk klinisch complicatie. Staphylococcus aureus (S. aureus) is een van de meest voorkomende micro-organismen geïsoleerd uit implantaten infecties. Het is in staat een biofilm de oppervlakken van implantaten omvat en kan leiden tot antibiotica-resistente infecties 1,2. Behandeling van implantaat-geassocieerde infectie vereist vaak langdurig verblijf in ziekenhuizen voor herhaalde debridements en langdurige parenterale antibiotische therapie. In antibiotica resistente gevallen kan verwijdering van het implantaat noodzakelijk. De stijgende resistentie van bacteriën tegen antibiotica is ook genoemd door de Centers for Disease Control en Prevention (CDC) als "een van de meest urgente in de wereld gezondheidsproblemen." In tijd, zonder de ontwikkeling van nieuwe en effectieve antimicrobiële behandelingen, is het mogelijk dat multiresistente pathogenen zullen onbehandelbaar met conventionele antibiotica. Preventie van implantaat-geassocieerdeinfectie is daarom belangrijk en nieuwe profylactische middelen of benaderingen nodig om een ​​dergelijke infecties.

Bloedplaatjesrijk plasma (PRP) is een concentratie van autoloog bloed dat meer dan 30 groeifactoren die kunnen helpen met beenderen en graft healing 3-5 bevat. De toepassing van PRP om botregeneratie en zacht weefsel rijping bevorderen wordt steeds meer gerapporteerd in klinieken vanwege de hoge concentratie van verschillende groeifactoren vrijgegeven door bloedplaatjes.

Verscheidene kenmerken van PRP aan dat PRP ook kunnen antimicrobiële eigenschappen 6-9. PRP bevat een groot aantal bloedplaatjes, een hoge concentratie leukocyten (die host-defensieve acties tegen bacteriën en schimmels bezitten) en meerdere antimicrobiële peptiden 7,8,10. In een recente studie van een groot cohort van cardiale chirurgische patiënten, werd onthuld dat het gebruik van intraoperatieve PRP-gel gedurende wondsluiting signiicantly daling van de incidentie van oppervlakkige en diepe borstbeen infectie 11. Om deze redenen en observaties, veronderstelden we dat PRP, naast de goed bestudeerde genezing bevorderende eigenschappen, antimicrobiële eigenschappen heeft. De potentiële voordelen van PRP om besmetting te voorkomen zijn: (i) PRP minder snel resistentie induceren in vergelijking met conventionele antibiotica. (Ii) PRP heeft ook eigenschappen die genezing die een synergistisch effect Infectiepreventie kunnen bevorderen; PRP genezende eigenschappen ervan zou een afdichting om bacteriële aanhechting te voorkomen waardoor de kansen voor infectie pathogenen en menselijke cellen zijn race voor implantaat oppervlakken 12 , 13. (Iii) PRP is inherent biocompatibel, en veilig en vrij van het risico van overdraagbare ziekten.

Onze lange-termijn doel is om PRP gebruiken als een nieuwe benadering van de implantaat-geassocieerde infecti voorkomenons. Het doel van deze studie was PRP bereiden met een tweemaal centrifugeren aanpak, PRP te onderzoeken in vitro antimicrobiële eigenschappen en de protocollen voor de beoordeling van dergelijke antimicrobiële eigenschappen te beschrijven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding en activering van PRP

1,1 bloed te trekken

  1. Verdoven konijn door inhalatie van isofluraan (2% in O 2 voor inductie en 1% voor onderhoud).
  2. Trek 2 ml 0,129 M trinatriumcitraat (een anticoagulent oplossing) in een 20 ml spuit. De trinatriumcitraat oplossing bereid door 1,897 g trinatriumcitraat in 50 ml gedestilleerd H 2 O en filteren met een 0,22 urn steriel filter.
  3. Steriliseer de konijnenoor met 70% ethanol.
  4. Bloeden (bijv. 5 ml) van het konijn oorader via een vlindernaald (25 G) op de injectiespuit.
  5. Meng het bloed met het trinatriumcitraat oplossing door voorzichtig schudden. De volumeverhouding van bloed en trinatriumcitraat oplossing 9:1.

1,2 PRP preparaat (figuur 1)

  1. Breng de anticoagulanteerd bloed in een 50 ml plastic centrifugebuis. Neem een ​​hoeveelheid van 10 plbloed naar het trombocytenaantal bij aanvang met hemocytometry te bepalen.
  2. Centrifugeer het bloed bij 300 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) in een centrifuge met een swing-out rotor. Stel de versnelling en rem snelheid te laag (figuur 1).
  3. Na centrifugatie wordt het bloed gescheiden in drie lagen. De onderste laag is vooral rode bloedcellen, is de middelste laag (gewoonlijk aangeduid als de "buffy coat") bestaat uit geconcentreerde bloedplaatjes en leukocyten, en de toplaag hoofdzakelijk plasma, de vloeibare component van bloed en bloedplaatjes ( figuur 1). Moet vervoeren de centrifugebuis om een ​​celcultuur kap, niet storen de lagen. Overdracht van al het plasma, buffy coat, en 2-3 mm dikke laag rode bloedcellen in een 15 ml plastic buis met een 1 ml plastic pipet.
  4. Centrifugeer het monster overgebracht nogmaals op 3000 xg gedurende 15 min bij RT. De toplaag (supernatant) wordt beschouwd bloedplaatjes arm plasma (PPP) eend overgebracht naar een nieuwe buis.
  5. PRP verkrijgen door aanpassing van de concentratie van bloedplaatjes in het resterende bloedmonster met PPP tot 2,0 x 10 6 bloedplaatjes / ul (bepaald door hemocytometry) te verkrijgen.

1,3 PRP activering

  1. Bereid PRP activatoroplossing door oplossen 5.000 IE rundertrombine met 5 ml 10% calcium chloride aan de werkconcentratie van 1.000 IE / ml.
  2. Voeg de activering oplossing voor PRP en PPP, en meng de oplossing door herhaaldelijk pipetteren om PRP-en PPP-gels te vormen. De volumeverhouding van de activering oplossing PRP of PPP is 1:4.

2. In vitro antimicrobiële Test van PRP gebruik van Kill Curve Assay (figuur 2)

  1. Met behulp van een steriele entnaald, voeg enkele kolonies van S. aureus uit haar 's nachts plaat cultuur in 5 ml Mueller Hinton bouillon (MHB) in een plastic buis. Vortex kort en incubeer het monster gedurende 2 uur bij 37 ° C. VolgendeDe optische dichtheid van de bacteriële media werd bepaald met een spectrofotometer en ingesteld op een optische dichtheid gelijk aan ~ 1 x 10 8 CFU / ml gebaseerd op de vooraf bepaalde standaard curve.
  2. Een 100x verdunning met PBS tot 1 x 10 6 CFU / ml en inoculums op ijs.
  3. Opgezet en label steriele, wegwerpbare 5 ml rondbodem polystyreenbuizen en bereidt de volgende monstergroepen zoals aangegeven in tabel 1 voor een eindvolume van 2 ml per buis.
  4. Voeg PRP, PPP of PBS eerst de polystyreenbuizen, gevolgd door de trombine-oplossing voor activering (gelvorming). Voeg vervolgens MHB en dan de S. aureus inoculums (1 x 10 6 CFU / ml) om de uiteindelijke concentratie van 1 x 10 5 CFU / ml.
  5. Incubeer de buizen bij 37 ° C met orbitaal schudden bij 150 rpm.
  6. Op vooraf bepaalde tijdstippen (bv. 0, 1 en 2 uur) Meng de oplossingen in elke buis via herhaling pipetteren (ditstap is belangrijk omdat bacteriën kan worden gevangen in de PRP gel). Neem 10 pl monster, verdunnen standaard met steriele 0,9% zoutoplossing, en Pipetteer 100 ul aliquot van elke verdunning op een Tryptic Soy Agar (TSA, met 5% schapenbloed) plaat voor CFU tellen.
  7. Cultuur de agarplaten gedurende de nacht bij 37 ° C, te tellen en noteer de plaat kolonies. Plotgegevens op logarithimic schaal (uur) op de x-as en CFU / ml op de y-as.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

PRP is reproduceerbaar bereid met een tweemaal centrifugeren benadering (figuur 1). PRP blijkt op overtuigende (tot 100-voudige afname in CFU) in vitro antimicrobiële eigenschappen tegen methicilline resistente S. aureus (MRSA) (figuur 3), die meestal wordt gevonden in ziekenhuizen wereldwijd 14. Ook PRP heeft sterke antimicrobiële eigenschappen tegen methicilline gevoelige S. aureus (MSSA), Groep A Streptococcus en Neisseria gonorrhoea...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Bloedplaatjesrijk plasma wordt steeds meer gebruikt voor klinische toepassingen vanwege de genezing bevorderende 15-17. In de huidige studie werd PRP gepresenteerd als een nieuwe aanpak voor infectiepreventie. PRP bleek sterke antimicrobiële eigenschappen tegen MRSA, MSSA, Groep A Streptococcus en Neisseria gonorrhoeae zijn. De belangrijkste voordelen van PRP, in vergelijking met conventionele behandelingen met antibiotica, voor infectiepreventie zijn onder andere: (1) Huidige antibiotica te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs danken Therwa Hamza, John E. Tidwell, Nina Clovis, en Suzanne Smith voor experimentele bijstand en Suzanne Smith voor het proeflezen. De auteurs danken ook John Thomas, PhD voor het verstrekken van de bacteriële klinische isolaten en John B. Barnett, PhD voor zijn steun en het gebruik van de biologische veiligheid lab bij de afdeling Microbiologie, Immunologie en Celbiologie aan Universiteit van West Virginia. De auteurs erkennen financiële steun van de osteosynthese en Trauma Care Foundation en de National Science Foundation (# 1003907). Microscoop experimenten en beeldanalyse werden ook uitgevoerd in de Universiteit van West Virginia Imaging Facility, die gedeeltelijk ondersteund door de Mary Babb Randolph Cancer Center en NIH subsidie ​​P20 RR016440.

Het gebruik van dieren voor bloed trekt werden goedgekeurd door de Universiteit van West Virginia Institutionele Animal Care en gebruik Comite. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante guidelines, regelgeving en regelgevende agentschappen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bovine thrombinKing Pharmaceuticals, Inc60793-215-05Thrombine (van runder afkomst)
Calcium chlorideKing Pharmaceuticals, Inc60793-215-0510% calciumchloride
EthanolSigma-AldrichE7023
IsofluraneBaxter1001936060
Mueller Hinton bouillonBecton, Dickinson and Company275710
Fosfaat-gebufferde zoutoplossingSigma-AldrichD8662
Tri-natriumcitraatSigma-AldrichW302600
Tryptische soja-agarFisher ScientificR01202
CentrifugeKendro Laboratory Products750043077
SpuitfilterMilliporeSLGP033RS

Referenties

  1. Gristina, A. G. Biomaterial-centered infection: microbial adhesion versus tissue integration. Science. 237, 1588-1595 (1987).
  2. Gristina, A. G., Costerton, J. W. Bacterial adherence to biomaterials and tissue. The significance of its role in clinical sepsis. J. Bone Joint Surg. Am. 67, 264-273 (1985).
  3. Everts, P. A., et al. Reviewing the structural features of autologous platelet-leukocyte gel and suggestions for use in surgery. Eur. Surg. Res. 39, 199-207 (2007).
  4. Marx, R. E. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP. Implant. Dent. 10, 225-228 (2001).
  5. Toscano, N., Holtzclaw, D. Surgical considerations in the use of platelet-rich plasma. Compend. Contin. Educ. Dent. 29, 182-185 (2008).
  6. Cieslik-Bielecka, A., Gazdzik, T. S., Bielecki, T. M., Cieslik, T. Why the platelet-rich gel has antimicrobial activity? Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 103, 303-306 (2007).
  7. Yeaman, M. R. The role of platelets in antimicrobial host defense. Clin. Infect. Dis. 25, 951-970 (1997).
  8. Tang, Y. Q., Yeaman, M. R., Selsted, M. E. Antimicrobial peptides from human platelets. Infect Immun. 70, 6524-6533 (2002).
  9. El-Sharkawy, H., et al. Platelet-rich plasma: growth factors and pro- and anti-inflammatory properties. J. Periodontol. 78, 661-669 (2007).
  10. Krijgsveld, J., et al. Thrombocidins, microbicidal proteins from human blood platelets, are C-terminal deletion products of CXC chemokines. J. Biol. Chem. 275, 20374-20381 (2000).
  11. Trowbridge, C. C., et al. Use of platelet gel and its effects on infection in cardiac surgery. J. Extra Corpor. Technol. 37, 381-386 (2005).
  12. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface. Med. Prog. Technol. 14, 205-224 (1988).
  13. Subbiahdoss, G., Kuijer, R., Grijpma, D. W., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Microbial biofilm growth vs. tissue integration: "the race for the surface" experimentally studied. Acta Biomater. 5, 1399-1404 (2009).
  14. Klevens, R. M., et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA. 298, 1763-1771 (2007).
  15. Foster, T. E., Puskas, B. L., Mandelbaum, B. R., Gerhardt, M. B., Rodeo, S. A. Platelet-rich plasma: from basic science to clinical applications. Am. J. Sports Med. 37, 2259-2272 (2009).
  16. Carlson, N. E., Roach, R. B. Platelet-rich plasma: clinical applications in dentistry. J. Am. Dent. Assoc. 133, 1383-1386 (2002).
  17. Man, D., Plosker, H., Winland-Brown, J. E. The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. Plast. Reconstr. Surg. 107, 229-237 (2001).
  18. Fridkin, S. K., et al. Epidemiological and microbiological characterization of infections caused by Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin, United States, 1997-2001. Clin. Infect. Dis. 36, 429-439 (1997).
  19. Jackson, C. R., Fedorka-Cray, P. J., Davis, J. A., Barrett, J. B., Frye, J. G. Prevalence, species distribution and antimicrobial resistance of enterococci isolated from dogs and cats in the United States. J. Appl. Microbiol. 107, 1269-1278 (2009).
  20. Murray, C. K., et al. Recovery of multidrug-resistant bacteria from combat personnel evacuated from Iraq and Afghanistan at a single military treatment facility. Mil. Med. 174, 598-604 (2009).
  21. Durr, M., Peschel, A. Chemokines meet defensins: the merging concepts of chemoattractants and antimicrobial peptides in host defense. Infect Immun. 70, 6515-6517 (2002).
  22. Hancock, R. E. Peptide antibiotics. Lancet. 349, 418-422 (1997).
  23. Dohan Ehrenfest, D. M., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27, 158-167 (2009).
  24. Kalen, A., Wahlstrom, O., Linder, C. H., Magnusson, P. The content of bone morphogenetic proteins in platelets varies greatly between different platelet donors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375, 261-264 (2008).
  25. Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J. Craniomaxillofac. Surg. 30, 97-102 (2002).
  26. Mazzucco, L., Balbo, V., Cattana, E., Guaschino, R., Borzini, P. Not every PRP-gel is born equal. Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations: Fibrinet, RegenPRP-Kit, Plateltex and one manual procedure. Vox Sang. 97, 110-118 (2009).
  27. Lei, H., Gui, L., Xiao, R. The effect of anticoagulants on the quality and biological efficacy of platelet-rich plasma. Clin. Biochem. 42, 1452-1460 (2009).
  28. Redler, L. H., Thompson, S. A., Hsu, S. H., Ahmad, C. S., Levine, W. N. Platelet-rich plasma therapy: a systematic literature review and evidence for clinical use. Phys. Sportsmed. 39, 42-51 (2011).
  29. Whitman, D. H., Berry, R. L., Green, D. M. Platelet gel: an autologous alternative to fibrin glue with applications in oral and maxillofacial surgery. J. Oral Maxillofac. Surg. 55, 1294-1299 (1997).
  30. Anitua, E. Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants. Int. J. Oral Maxillofac. Implants. 14, 529-535 (1999).
  31. Whitman, D. H., Berry, R. L. A technique for improving the handling of particulate cancellous bone and marrow grafts using platelet gel. J. Oral. Maxillofac. Surg. 56, 1217-1218 (1998).
  32. Currie, L. J., Sharpe, J. R., Martin, R. The use of fibrin glue in skin grafts and tissue-engineered skin replacements: a review. Plast. Reconstr. Surg. 108, 1713-1726 (2001).
  33. Nikulin, A. A. Effect of calcium, thrombin and nucleotides (ADP, cAMP, cGMP) on blood platelet glycolysis and energy metabolism. Farmakol. Toksikol. 43, 585-590 (1980).
  34. Hantgan, R. R., Taylor, R. G., Lewis, J. C. Platelets interact with fibrin only after activation. Blood. 65, 1299-1311 (1985).
  35. Hantgan, R., Fowler, W., Erickson, H., Hermans, J. Fibrin assembly: a comparison of electron microscopic and light scattering results. Thromb. Haemost. 44, 119-124 (1980).
  36. Li, B., Jiang, B., Boyce, B. M., Lindsey, B. A. Multilayer polypeptide nanoscale coatings incorporating IL-12 for the prevention of biomedical device-associated infections. Biomaterials. 30, 2552-2558 (2009).
  37. Li, B., Jiang, B., Dietz, M. J., Smith, E. S., Clovis, N. B., Rao, K. M. K. Evaluation of local MCP-1 and IL-12 nanocoatings for infection prevention in open fractures. J. Orthop. Res. 28, 48-54 (2010).
  38. Boyce, B. M., Lindsey, B. A., Clovis, N. B., Smith, E. S., Hobbs, G. R., Hubbard, D. F., Emery, S. E., Barnett, J. B., Li, B. Additive effects of exogenous IL-12 supplementation and antibiotic treatment in infection prophylaxis. J. Orthop. Res. 30 (2), 196-202 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Bloedplaatjesrijk plasmaPRP-bereidingbacterieel inoculumtrombine-activatiekolonievormende eenhedenCFU-reductiedubbele centrifugatiemethicilline-resistente Staphylococcus aureuswondgenezende eigenschappen
PRP als een nieuwe aanpak om infectie te voorkomen: Voorbereiding en
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.