Peptide-gebaseerde identificatie van functionele Motieven en hun bindingspartners

Samenvatting

Technieken om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de afscheiding van HIV-1 Nef in exosomes ontleden worden beschreven. Specifieke korte peptiden afgeleid van Nef en eiwit transfectie werden uitgebuit om de structuur, functie, en bindende partners van Nef's Secretion Wijziging Region bepalen. Deze procedures hebben algemene belang in veel mechanistische studies.

Samenvatting

Specifieke korte peptiden afgeleid van motieven in full-length eiwitten, in dit geval HIV-1 Nef, niet alleen hun biologische functie behouden, maar ook concurrerend de functie van het eiwit van volledige lengte remmen. Een set van 20 Nef scanning peptides, 20 aminozuren lang met elkaar overlappende 10 aminozuren van zijn buur, werden gebruikt om motieven in Nef verantwoordelijk voor de inductie van apoptose te identificeren. Peptiden die deze apoptotische motieven apoptose vergelijkbaar niveau van volledige lengte Nef proteïne. Een tweede peptide, afgeleid van de Afscheiding Modification Gewest (SMR) van Nef, behield de mogelijkheid tot interactie met cellulaire eiwitten die betrokken zijn bij Nef's secretie in exosomes (exNef). Deze SMRwt peptide werd gebruikt als "lokaas" eiwit in co-immunoprecipitatie experimenten cellulaire eiwitten die specifiek binden aan de Nef SMR motief isoleren. Eiwit en antilichaam transfectie remming gebruikt wordt om de interactie verstoren inzetween Nef en mortalin, een van de geïsoleerde SMR-bindende proteïnen, en het effect werd gemeten met een fluorescentie-gebaseerde exNef secretie assay. Het vermogen van de SMRwt peptide om full-length Nef outcompete voor cellulaire eiwitten die de SMR motief binden, maken het de eerste remmer van exNef secretie. Aldus door het gebruik van hier beschreven technieken, die de unieke eigenschappen van specifieke korte peptiden afgeleid van motieven in full-length eiwitten gebruiken, kan men de identificatie van functionele motieven in eiwitten en de ontwikkeling van peptide-gebaseerde remmers van pathogene functies versnellen.

Inleiding

Met de komst van de anti-retrovirale therapie, is de aids-epidemie in de westerse wereld is vertraagd, maar niet beperkt, en de verspreiding van HIV blijft een belangrijk gezondheidsprobleem last over de hele wereld. Met uitzondering van de weinig effectieve RV144 Thai onderzoek kregen HIV vaccins tot dusver geen bescherming tegen infectie. Zo is het onderzoek naar aanvullende, potentiële therapeutische doelen nog steeds gerechtvaardigd.

Naast CD4 T-cel depletie, persistente gegeneraliseerde immune activering is een kenmerk van HIV-infectie. Dit Chronische Immune Activering (CIA) leidt tot een verhoogde celvernieuwing, geactiveerd en gedifferentieerd lymfatische subpopulaties, cellulaire uitputting en veroudering, en het doden van T-cellen en B-cellen via Activering-geïnduceerde celdood (AICD) ^1,2,3, en het is goed gevestigd als een van de sterkste voorspellers van progressie van de ziekte ^{4,5,6,7,8,9,10,11,12.} Echter, de onderliggende mechanismen CIA en CD4T-celdepletie in HIV-infecties niet volledig opgehelderd.

Bewijs uit ons lab en anderen leidde ons naar een model voor de progressie van de ziekte (figuur 1) waarin de HIV-eiwit Nef (Negative Regulatory Factor) induceert de afscheiding in exosomes van HIV-1 geïnfecteerde cellen ^13,14. Deze Nef-bevattende exosomes (exNef) induceren apoptose in een aantal cellijnen waaronder geïnfecteerde CD4 T-cellen ^15,16. Als alternatief, in monocyten / macrofagen exNef verandert genexpressie patronen, bijv. cytokine-expressie, en lijkt een toestand van ongepland activering van het immuunsysteem veroorzaken. Deze hoeveelheid bewijs suggereert een belangrijke rol voor exNef in CIA en CD4 T-cel depletie.

Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan het vermogen van Nef's te manipuleren de exosomaal mensenhandel route zal nuttig zijn in engineering nieuwe remmers van exNef secretie. Remming van exNef secretie de CD4 T-cel depletie verminderenen de CIA dat station HIV / AIDS pathogenese.

Om het bewijs dat leidde tot ons model voor HIV / AIDS progressie van de ziekte en de daaropvolgende data die bouwde op dit model te verzamelen, hebben we een aantal nieuwe reagentia en methoden die liet ons toe om de genetica van exNef secretie analyseren ontwikkeld, en beginnen aan het bepalen cellulaire proteïnen betrokken. In het eerste werk, we vonden dat Nef proteïne induceert apoptose in cellen omstanders en extracellulair vrij van Nef-getransfecteerde en HIV-geïnfecteerde cellen ^15. Peptiden afgeleid van SDF-1α (stromale cel afgeleide factor-1, met alternatieve splicing alpha) was eerder aangetoond dat veel van de binding en signalerende activiteit van het volledige-lengte molecule ¹⁷ behouden. We speculeerden dat peptiden Nef enkele van de apoptotische activiteit van het volledige eiwit en dat deze peptiden zouden nood Nef apoptotische domein (en) bevatten kunnen behouden. Om deze peptiden te identificeren en dus de Nefapoptotische domein (en), verkregen we een set van 20 HIV-1 Nef scannen peptiden van de NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Deze 20-aa peptiden, elk overlappend 10 aminozuren van zijn buur, worden genoemd door het aantal van hun laatste aminozuur, dwz N20 overspanningen Nef aminozuren 1-20, N30 overspanningen Nef aminozuren 11-30, etc ^16. We vonden dat het blootstellen van T-cellen extracellulair specifieke peptiden overlappen twee afzonderlijke 10-aa domeinen in de full-length Nef proteïne geïnduceerde apoptose in deze cellen. Daaropvolgende analyse van deze Nef-apoptotische afgeleide peptiden bleek hun vermogen om fysiek interactie met de chemokine receptor CXCR4 op het oppervlak van T-cellen, met bindingskinetiek die mogen deze peptiden om competitief binding te remmen tussen CXCR4 en natuurlijke ligand SDF-1α. Tenslotte, de Nef-afgeleide apoptotische peptiden interactie CXCR4 bleek een stressrespons in deze T-cellen leidt tot apoptose. Dit bewijsmateriaal liet ons toe om quicfunctionele domeinen kly kaart Nef's, een proces dat veel langer zou hebben genomen met behulp van standaard DNA-mutagene technieken zoals alaninescanningsmutagenese. Het toonde ook aan dat deze korte Nef-peptiden behouden de biologische functie van de apoptotische domeinen in het eiwit van volledige lengte.

Na een rol voor extracellulair Nef geïdentificeerd, dwz apoptose van T-cellen, zochten we een beter begrip van hoe Nef werd afgescheiden uit cellen. Met een reeks gemuteerde Nef constructen toonden we zeer geconserveerde motieven Nef eiwit in de N-terminale gebieden van zowel HIV Nef en de Rhesus macaque equivalente _mac SIV (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, die essentieel zijn voor exNef afscheiding ^13. Een van deze motieven, de Afscheiding Modification Gewest (SMR; 66VGFPV70), was bijzonder kritisch, zoals alanine vervanging van een van haar vijf aminozuren ofwel sterk verminderd of afgeschaft exNef secretie. Bij aflevering aan cellen via Active Motif's CHariot Protein Delivery Reagent, een peptide dat de SMR aan een FLAG-peptide sequentie (SMRwt) bleek exNef secretie remmen van zowel Nef-getransfecteerde en HIV-geïnfecteerde cellen ^18. Op basis van onze eerdere ervaringen met peptiden, hebben we besloten om dit peptide te gebruiken om de moleculen en mechanismen die ten grondslag liggen aan de rol van de Nef SMR's in exNef secretie verhelderen.

Met behulp van de SMRwt peptide als onze "lokaas eiwit", we co-immunogeprecipiteerd cellulaire binding partners van de SMR uit niet-geïnfecteerde T-cellysaten ^18. De FLAG-peptide sequentie voorzien van een handig handvat voor het vastleggen van de SMRwt peptide met behulp van anti-FLAG affiniteitshars. Onze eerdere bevinding dat een enkele valine naar alanine mutatie in het SMRwt peptide was voldoende voor de afschaffing van de remming van exNef secretie identificeerde een handige, zeer specifieke controle peptide (SMRmut) die we gebruikten om uit te sluiten co-geïmmunoprecipiteerde eiwitten niet specifiek voor de SMR. Gebruik van een peptide met de specifiek domein plaats dan de full-length eiwit konden we de screening van tientallen cellulaire factoren die binden aan andere domeinen Nef ¹⁹ omzeilen.

Eens we de SMR-bindende partners, een logische stap was aan te tonen dat de geïdentificeerde cellulaire bindende partners zijn belangrijk voor de biologische functie ^18. De standaardprocedure om dit te bereiken is het knockdown eiwitniveaus met doeleiwit-specifieke miRNA en siRNA en vervolgens assay het effect op de biologische functie. We voerden miRNA knockdown, die translatie van het doelwit-mRNA remt waardoor productie van dit doel, in dit geval een SMR-bindend eiwit. Deze vermindering van het doeleiwit is een indirect effect, en heeft eventueel een vertraagd effect op de biologische functie het doelgericht eiwit speelt een rol in Daarom hebben we ook de minder voorkomende antilichaam remming techniek gebruikt om te bepalen of direct verstoren van de activiteit vanhet doeleiwit beperkte of geen biologische functie. In deze werkwijze worden antilichamen opgewekt tegen het doelwit eiwit getransfecteerd in de cel met behulp Chariot Reagent en rechtstreeks met het doeleiwit of afzonderen uit de plaats van de functie, of de relevante bindende domein blokkeren. Remming van het doelwit eiwit via deze procedure rechtstreeks verstoort zijn functie, en kan RNA knockdown procedures aan te vullen met verdere bevestiging van het belang van het doelwit eiwit naar de biologische functie.

Terwijl Chariot Reagens effectief in het leveren van peptiden en eiwitten in cellen, een proces is tijdrovend en beperkt de aard van de dierproeven, bijvoorbeeld langdurige of herhaalde blootstelling en in vivo dierstudies die kunnen worden uitgevoerd. Daarom hebben we een cel-penetrerende peptide (CPP) die toegevoegd is aan de SMRwt peptide (SMRwt-CPP) ¹⁸ een peptide die kunnen worden overgenomen door cellen passief producerenuit het kweekmedium. Deze versie was even werkzaam als de eerste bij het remmen exNef secretie.

Het bewijs uit de gepubliceerde experimenten toont het vermogen van kleine peptiden die specifieke functionele motieven voor de functie van het eiwit van volledige lengte antagoniseren door competitieve remming, en de eiwitten die deze motieven binden te isoleren. Men zou verwachten dat deze technieken moet nuttig in vele experimentele protocollen. Zij moeten ook effectief in engineering nieuwe peptide remmers van vele cellulaire processen, een functie die kan verder worden verbeterd door binding aan CPP sequenties.

Protocol

I. Het gebruik van korte peptiden in Biological Analysis

I.1. Mapping Biologisch Functionele Motieven gebruiken Peptiden

1. Behandelen cellen met Nef scanning peptiden
   1. Schaffen een set van peptiden scannen het gebied van belang. Voor onze experimenten 20-meer peptiden met 10 aminozuren overlappen, die de gehele HIV-1 Nef-eiwit (205 aa), werden verkregen van de AIDS Reagent Program. De peptiden zijn afzonderlijk als volgt bepaald:
   2. Voeg 10 ng / ml peptide aan het celkweekmedium.
   3. Voeg 10 ml kweekmedium per plaat op celculturen Jurkat.
   4. Incubeer kweken gedurende 24 uur bij 37 ° C.
2. Terminale deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde dUTP biotine Nick End Labeling (TUNEL) assay van apoptose
   1. Was de cellen met 1X PBS en vast gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 4% paraformaldehyde in 1X PBS, pH 7,4.
   2. Was met 1X PBS, en doorlaatbaar met 0,1% Triton X-100 gedurende 10min bij kamertemperatuur.
   3. Spoel de cellen tweemaal met 1X PBS.
   4. Telling gekleurde cellen door epifluorescentie op een computergestuurde microscopiesysteem.

I.2. Concurrerende remming Analysis middels Peptides

1. Co-transfectie van peptiden met behulp van de Chariot Protein Delivery Reagent Kit
   1. Per transfectie reactiemengsel verdund 1 ug wtNef GFP-plasmide-DNA en 100 ng van ofwel wildtype peptiden afgeleid van het SMR domein of peptiden met alanine-vervanging van afzonderlijke aminozuren in de SMR motief, tot een eindvolume van 100 pl met 1X PBS.
   2. Verdun 6 pi van een 1/10 verdunning van Chariot reagens tot een uiteindelijk volume van 100 pi met steriel water en combineren met de verdunde DNA-peptide mix.
   3. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om de vorming van de Chariot / DNA-peptide complex toestaan.
   4. Pellet 3 x 10 ⁵ Jurkat cellen door centrifugatie bij 600 xg gedurende 5 minuten.
   5. Twee keer wassen cellen met 1X PBS, en opnieuw in suspensie in de Chariot / DNA-peptide complex.
   6. Voeg 400 ul serumvrij RPMI 1640 medium om de suspensie en incubeer de cellen in kweekplaten bij 37 ° C gedurende 2 uur.
   7. Voeg 1 ml vers RPMI 1640 medium dat 10% FBS aan elke plaat en incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C.
   8. Oogst cellen en bepaal transfectie-efficiëntie door fluorescentie microscopie.
2. Nef-GFP secretie fluorescerende plaat lezer assay van peptide remming
   1. Verzamel de cel-vrije media uit de geoogste cellen geconditioneerde, en breng 100 ul aan de individuele putjes van een 96-well zwarte microtiterplaat.
   2. Maatregel GFP-fluorescentie in de media op een Tecan GENEios fluorimeter met excitatie golflengte 485 nm en emissie golflengte van 515 nm in relatieve fluorescentie-eenheden.
   3. Het niveau van GFP-fluorescentie in de controlegroep (media uit cellen gecotransfecteerd met Nef-GFP en een gecodeerd peptide) En 100%.
   4. Vergelijken met het niveau van GFP-fluorescentie in de media van cellen die gecotransfecteerd met verschillende SMR peptiden veranderingen in Nef-GFP secretie bepalen.

I.3. Isoleren Motif Binding Partners behulp Peptiden als Bait

1. Co-immunoprecipitatie met SMR peptiden
   1. Jurkat cellen groeien in RPMI 1640 medium dat 10% FBS bij 37 ° C in een T-75 weefselkweekkolf en pellet cellen door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Bepaal de transfectie-efficiëntie, door het plaatsen van de plaat onder een fluorescentiemicroscoop, foto's maken, en vervolgens de telling van de totale en de gelabelde cellen en bepaal het percentage gelabelde cellen.
   2. Resuspendeer de cel pellet in 1 ml 1X PBS, en overbrengen naar een 1,5 ml Eppendorf buis. Microcentrifuge bij 1000 xg gedurende 1 minuut. Resuspendeer de pellet in 1 ml α-FLAG Lysisbuffer door zachte pipetteren. Lysis buffer: Mix 50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM natrium-chloride [NaCl], 1 mM EDTA en 1% Triton X-100, met 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride [PMSF], en 10 ul / ml Protease Inhibitor Cocktail voor gebruik met zoogdiercellen en weefselextracten [PIC, Sigma]. Voeg onmiddellijk voor gebruik.
   3. Differentiële microcentrifuge de suspensies op 2000 g gedurende 5 minuten en bij 13.000 xg gedurende 10 min om pellet celafval en DNA, respectievelijk. Verzamel de bovenstaande vloeistof (hierna de "lysaat").
   4. Voeg 1 mg lysaat eiwit en 1 ug van hetzij de SMRwt of SMRmut peptide 20 pl anti-FLAG M2 affiniteit gel (hierna "hars", Sigma). Merk op dat zowel SMRwt en SMRmut hier gebruikt hebben een FLAG tagsequentie ingebed in de peptiden. Breng het mengsel aan een eindvolume van 1 ml in Co-IP-buffer (α-FLAG Lysisbuffer minus PMSF en PIC). Incubeer het mengsel bij 4 ° C gedurende de nacht met end-over-end rotatie. Als negatieve controle, incubeer het lysaat met de hars in de afwezigheid van hetzij peptide.
   5. Pellet de hars door microcentrifugatie bij 5000 - 8000 g gedurende 30 sec. Laat hars te regelen voor 2 minuten voordat het monster en vervolgens het supernatans aspireren. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een smal-end pipet tip of een Hamilton injectiespuit, zorg dat er geen hars dragen. Narrow-end pipet tips kunnen worden gemaakt met behulp van een tang om de opening van een plastic pipet tip knijpen totdat het gedeeltelijk gesloten is. Was de hars vier maal met 500 ui wasbuffer (50 mM Tris • HCl pH 7,4, en 150 mM NaCl). Elueer de gebonden cellulaire eiwitten met 15 ug van 3X FLAG peptide (Sigma) in 50 ui wasbuffer en geïncubeerd op rocker / schudder gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Concentreer de eluaten met aceton precipitatie, gevolgd door koken in Laemmli monsterbuffer (Bio-Rad). Scheid de eiwitten door SDS-PAGE op een 4-20% Tris-HCl Criterion prefab gel (Bio-Rad). Vlekken op de gel met Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Opmerking: voor massaspectrometrie identificatie experimenten ( Figuur 4A), elke voorwaarde (Co-IP met SMRwt, SMRmut of geen peptide) werd in viervoud uitgevoerd en de eluaten van alle vier replicaten werden vóór acetonprecipitatie samengevoegd voor een totaal van 4 mg totaal eiwit input / conditie).
2. Co-immunoprecipitatie met Nef-GFP-eiwit
   1. Meng 50 pl Proteïne G Dynabeads magnetische beads (Invitrogen) met 2 ug monoklonaal anti-GFP in 1 ml 1X PBS met 0,02% Tween 20 (PBS-T). Incubeer het mengsel end-over-end rotatie in een 1,5 ml Eppendorf buis gedurende 1 uur bij 4 ° C.
   2. Scheid de parels van de buffer door het plaatsen van de buis op een 1,5-ml MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (Promega Corp, Madison, WI) waardoor magnetische pulldown gevolgd door verwijdering van het supernatant. Was de anti-GFP beklede korrels met 1 ml PBS-T vervolgens voorzichtig pipetteren.
   3. Lyse Nef-GFP getransfecteerde Jurkatcellen met 1 ml 1X RIPA + buffer door zachte pipetteren en incubatie gedurende 15 min op ijs. RIPA buffer +: 10X RIPA Lysis Buffer, pH 7,4 [Millipore, Bedford, MA] 1:10 verdund in steriel water, 0,02% natriumazide [Sigma], en 0,1% natriumdodecylsulfaat [SDS], met 1 mM PMSF en 10 gl / ml PIC toegevoegd onmiddellijk vóór gebruik.
   4. Pellet de celresten door microcentrifugatie bij 2000 xg gedurende 10 minuten. Verzamel de bovenstaande vloeistof (hierna de "lysaat").
   5. Voeg 1 mg lysaat eiwit aan het anti-GFP beklede parels Breng het uiteindelijke volume met 1 x RIPA-buffer + 1 ml, en incuberen van het mengsel met end-over-end rotatie gedurende 1 uur bij 4 ° C. Opmerking: Voor peptide competitie studies, 1 mg lysaat eiwit worden vooraf geïncubeerd met 2 ug SMRwt of SMRmut peptide in 1 ml RIPA + 1X buffer, alvorens te worden toegevoegd aan de anti-GFP beklede parels.
   6. Was de korrels door resuspensie in 1 ml wasbuffer (50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM NaCl en 0,1% Tween 20). Incubeer met end-over-end rotatie gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Scheid de kralen from het wassen met behulp van de magnetische scheiding Stand. Was de kralen een tweede en derde keer met wassen buffers die 250 mM en 300 mM NaCl, respectievelijk.
   7. Resuspendeer de kralen in 200 ul PBS, breng het mengsel op een schone buis en scheid de parels van de was op de magnetische standaard. Kook de beads in 50 pl Laemmli monsterbuffer 5 min bij 95 ° C, laat het mengsel afkoelen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en plaats het mengsel op de magnetische standaard voor de scheiding en verzamel de bovenstaande vloeistoffen ("eluaten") .
   8. Scheid de eiwitten van het eluaat door SDS-PAGE op een 8-16% Tris-HCl Criterion prefab gel.
3. Massaspectrometrie
   1. Accijnzen de eiwitbanden belangstelling van Coomassie-gekleurde gels.
   2. Verminder de monsters in 10 mM 1,4-dithiothreitol (DTT) gedurende 45 min bij 37 ° C.
   3. Alkyleren de monsters in 55 mM joodacetamide gedurende 45 minuten bij 25 ° C.
   4. Verteren de monsters overnacht met sequencing leerjaar trypsin (Promega) bij 37 ° C.
   5. Ontzouten het monster peptiden met C-18 ZipTip (Millipore). Meng het monster peptiden met alfa-CHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), en spotten ze op een MTP doelframe III (Bruker Daltonics Inc, Billerica, MA).
   6. Voer tandem matrix-assisted laser desorptie / ionisatie tijd van de vlucht (MALDI-TOF/TOF) massaspectrometrie-analyse met een Bruker Daltonics ultraflex III TOF / TOF.
   7. Vergelijk de MS / MS-gegevens aan de NCBI niet-redundante en Swiss-Prot databases met behulp van de Mascot algoritme ( www.matrixscience.com ).
4. Immunoblot analyse
   1. Scheid de eiwitmonsters door SDS-PAGE op 4-20% of 8-16% Tris-HCl Criterion voorgegoten gels (Bio-Rad). Breng de banden elektroforetisch naar een nitrocellulose membraan.
   2. Was het membraan in Tris gebufferde zoutoplossing (TBS, Bio-Rad) gedurende 5 minuten. Blok met 5% magere melk in TTBS (TBS met 0,1% Tween 20) gedurende 1 uur door schudden bij kamertemperatuur.
   3. Verwerk de membraan immunoblotting met een specifiek primair antilichaam in 5% magere melk met schudden bij 4 ° C overnacht. Wassen in TTBS gedurende 20 min gevolgd door een secundair HRP geconjugeerd IgG (H + L) antilichaam in 5% magere melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was in TTBS voor 30-60 minuten.
   4. Detecteren de eiwitbanden door Western blotting luminol reagens (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA). Expose de filter aan fotografische film. Opmerking: In sommige experimenten werd een stripping reagens gebruikt voor het membraan (Pierce, Rockford, IL) gevolgd door hybridisatie met een verschillende primaire en secundaire antilichaam te strippen.
   5. Scan de X-ray films in Adobe Photoshop 5.0.2. Voer densitometrie analyse met behulp van ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

II. Gebruik van antilichaam Remming in Functional Analysis

II.1. Co-transfectie van Antibodies met de Chariot Protein Delivery Reagent Kit

1. Per transfectie reactiemengsel verdund 1 ug wtNef GFP-plasmide-DNA en 1 pg van hetzij anti-mortalin antilichaam of anti-α-tubuline antilichaam, tot een eindvolume van 100 pl met 1X PBS. Opmerking: Er is eerder gevonden dat co-transfectie van het anti-α-tubuline antilichaam geen detecteerbaar effect op exNef secretie, en dus dient als een effectieve negatieve controle in deze experimenten.
2. Verdunnen 6 gl onverdund Chariot reagens tot een uiteindelijk volume van 100 pi met steriel water en combineren met de verdunde DNA-antilichaam mix.
3. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om de vorming van de Chariot / DNA-antilichaam complex toestaan.
4. Pellet 3 x 10 ⁵ Jurkat cellen door centrifugatie bij 600 xg gedurende 5 minuten.
5. Twee keer wassen cellen met 1X PBS, en opnieuw in suspensie in de Chariot / DNA-antilichaam-complex.
6. Voeg 400 ul serumvrij RPMI 1640 medium om de suspensie en incubeer de cellen in kweekplaten bij 37 ° C gedurende 2 uur.
7. Voeg 1 ml vers RPMI 1640 medium dat 10% FBS aan elke plaat en incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C.

II.2. Nef-GFP Afscheiding Fluorescent Plate Reader Assay van Antibody Remming

1. Verzamel de cel-vrije media uit de geoogste cellen geconditioneerde, en breng 100 ul aan de individuele putjes van een 96-well zwarte microtiterplaat.
2. Maatregel GFP-fluorescentie in de media op een Tecan GENEios fluorimeter met excitatie golflengte 485 nm en emissie golflengte van 515 nm in relatieve fluorescentie-eenheden.
3. Het niveau van GFP-fluorescentie in de controlegroep (media uit cellen gecotransfecteerd met Nef-GFP en anti-α-tubuline antilichaam) en 100%.
4. Vergelijken met het niveau van GFP-fluorescentie in de media van cellen die gecotransfecteerd met anti-mortalin antilichaam aan veranderingen in Nef-GFP secretie bepalen.

Resultaten

Mapping Biologisch Functionele Motieven behulp Peptiden. Twee regio's werden geïdentificeerd op Nef eiwitten die apoptose te induceren. Peptide-driven apoptose werd waargenomen (Figuur 2) begin met peptide N50 (aa30-50), met een piek op N60 (AA40-60) en de N70 (aa50-70), en afnemende tot achtergrondniveau op peptide N100 (aa80-100). De belangrijkste Motief 1 (M1) piek gecentreerd op aa50-60 induceert> 80% van de apoptotische niveaus van de volledige lengte Nef proteïne. Een tweed...

Discussie

Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan het vermogen van Nef's te manipuleren de exosomaal mensenhandel route zal nuttig zijn in engineering nieuwe remmers van exNef secretie. Remming van exNef secretie moet de CD4 T-cel depletie en CIA die rijden HIV / AIDS pathogenese afnemen. Naar dit doel, hebben we een aantal nieuwe reagentia en methoden die liet ons toe om de genetica van exNef secretie te analyseren, en beginnen om de cellulaire eiwitten die betrokken bepalen ontwikkeld. Deze benadering heeft o...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
20mer peptide set met 10 aminozuur overlap	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	4641
TUNEL Assay	Roche	11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent	Active Motif	30100
Tecan GENEios fluorimeter	(Tecan Group, Zwitserland)
96-well zwarte microtiterplaat	Corning	3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Dynabeads Protein G magnetische kralen	Invitrogen	100.03D
MagnaSphere Technology Magnetische Separatiestandaard (twee posities)	Promega Corp., Madison, WI	Z5332
C-18 ZipTip	Millipore	ZTC18S096	C18 Resin (0,6 μl of 0,2 μl bed volumes). Oligonucleotiden of kleine (<50 kDa) eiwitten/peptiden in waterige oplossing
MALDI TOF/TOF	Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF