Coculture Analyse van extracellulaire eiwit interacties met invloed op de insulinesecretie door bètacellen in de pancreas

Samenvatting

Transcellulaire eiwit interacties zijn belangrijke determinanten van beta-cel functie. Hier beschreven is een methode-aangepast van een co-cultuur model van synaptogenesis-voor het onderzoeken hoe specifieke transmembraaneiwitten beïnvloeden insuline secretie. Getransfecteerde HEK293 cellen brengen eiwitten van belang; beta-cellen hoeven niet te worden getransfecteerd of anderszins direct verstoord.

Samenvatting

Interacties tussen cel-oppervlakte-eiwitten helpen bij het coördineren van de functie van naburige cellen. Bètacellen in de pancreas worden geclusterd binnen pancreaseilandjes en handelen op een gecoördineerde wijze aan glucose-homeostase te behouden. Het wordt steeds duidelijker dat interacties tussen transmembraan eiwitten op het oppervlak van de aangrenzende bètacellen zijn belangrijke determinanten van bèta-celfunctie.

Opheldering van de rol van specifieke transcellulaire interacties door knockdown, knockout of overexpressie studies in gekweekte beta-cellen of in vivo noodzakelijk directe verstoring van mRNA en eiwit expressie, met mogelijke gevolgen voor beta-cel gezondheid en / of functie op een manier die analyses van de effecten zou kunnen verwarren specifieke interacties. Deze benaderingen verandert ook het niveau van de intracellulaire domeinen van de beoogde eiwitten en kunnen effecten als gevolg van interacties tussen eiwitten voorkomen binnen dezelfde celmembraan te distinguished tegen de gevolgen van transcellulaire interacties.

Hier een werkwijze voor het bepalen van het effect van specifieke transcellulaire interacties op het insuline-capaciteit en responsiviteit van bètacellen gepresenteerd. Deze methode is toepasbaar voor beta-cellijnen, zoals INS-1-cellen, en gedissocieerde primaire bètacellen. Het is gebaseerd op co-cultuur modellen ontwikkeld door neurobiologists die dat blootstelling van gekweekte neuronen specifieke neuronale eiwitten die op HEK293 (of COS) cellagen geïdentificeerde eiwitten belangrijk voor een synapsvorming gevonden. Gezien de parallellen tussen de secretie machinerie van neuronale synapsen en van beta-cellen, redeneerden we dat beta-cel functionele rijping zou kunnen worden gedragen door soortgelijke transcellulaire interacties. We hebben een systeem ontwikkeld waarbij beta-cellen worden gekweekt op een laag van HEK293 cellen die een eiwit van interesse. In dit model wordt de beta-cel cytoplasma onaangeroerd terwijl extracellulair eiwit-eiwit Interactiens worden gemanipuleerd. Hoewel wij hierbij voornamelijk richten op studies van glucose-gestimuleerde insuline secretie, kunnen andere processen worden geanalyseerd, bijvoorbeeld veranderingen in genexpressie bepaald door immunoblotting of qPCR.

Inleiding

We beschrijven hier een methode om onderzoeken hoe de extracellulaire domeinen van transmembraan proteïnen specifieke invloed insulinesecretie vergemakkelijken. De werkwijze probes de effecten van interacties van het eiwit van belang met eiwitten (of mogelijk andere moleculen) op de beta-cel oppervlak. De werkwijze maakt onderzoeken hoe celoppervlak eiwitten door beta-cellen of andere naburige cellen (bijv. endotheelcellen, neuronen, pancreas alfa-cellen) tot expressie beïnvloeden beta-celfunctie door transcellulaire interacties (dat wil zeggen door interactie met interactiepartners op het oppervlak van aangrenzende beta-cellen).

De cellulaire plasmamembraan bevat een complexe reeks van structurele en functionele eiwitten dienen als brug de extracellulaire omgeving. Door de vorming van transcellulaire aansluitingen of door initiatie van plastic signalering evenementen, kunnen interacties tussen cel-oppervlakte-eiwitten helpen bij het coördineren van defunctie van naburige cellen. Bètacellen in de pancreas worden geclusterd binnen de alvleesklier eilandjes en op een gecoördineerde wijze als glucose homeostase ¹ te behouden. Zoals geopenbaard, bijvoorbeeld door het belang van extracellulaire EphA-ephrinA en neuroligin 2-interacties in de regulatie van glucose-gestimuleerde insuline secretie, wordt steeds duidelijker dat betere kennis van de extracellulaire interactie optreedt tussen eiwitten op de oppervlakken van aangrenzende bètacellen zal van groot belang zijn voor het verkrijgen van een volledig begrip van de insuline secretie, beta-cel functionele rijping en het onderhoud van de glucose homeostase ^1-3. Het doel van de hier beschreven methode voor onderzoek naar de effecten mogelijk over beta-celfunctie van transcellulaire interacties van specifieke of anderszins transmembraan-celoppervlak-geassocieerde eiwitten. Door co-kweken van beta-cellen met HEK293 cellen getransfecteerd met verschillende expressie constructen, de effecten op de beta celfunctie verschillende celoppervlak eiwitten of gemuteerde varianten daarvan kan efficiënt worden onderzocht. Dit wordt bereikt zonder dat de bètacellen zelf transfecteren.

Opheldering van de rol van specifieke transcellulaire interacties door knockdown, knockout of overexpressie studies in gekweekte beta-cellen of in vivo noodzakelijk directe verstoring van beta-cel mRNA en eiwit expressie, met mogelijke gevolgen voor beta cel gezondheid en / of functie op een manier die analyses van zou kunnen verwarren de effecten van specifieke extracellulaire interacties. Deze zal ook veranderen niveaus van de intracellulaire domeinen van de beoogde eiwitten en verder geen effecten door interacties tussen eiwitten in of in dezelfde cel worden onderscheiden van de effecten van transcellulaire interacties mogelijk. Hier wordt een werkwijze voor het bepalen van het effect van specifieke transcellulaire interacties op het insuline-capaciteit en responsiviteit van bètacellen described. Deze methode is toepasbaar voor insuline-afscheidende bèta-cellijnen, zoals INS-1 cellen ^4, en gedissocieerde primaire knaagdieren of humane B-cellen. Het is gebaseerd op co-cultuur modellen ontwikkeld door neurobiologists die dat blootstelling van gekweekte neuronen specifieke neuronale eiwitten die op HEK293 (of COS) cellagen gevonden kunnen eiwitten die drive synapsvorming ^5,6 identificeren. Gezien de parallellen tussen de secretie machinerie van neuronale synapsen en van beta-cellen, redeneerden we dat bèta-celfunctie en functionele rijping zou kunnen worden gedragen door soortgelijke transcellulaire interacties ^7-9. Om deze interacties probe, we de hierin beschreven waarin betacellen tezamen gekweekt op een laag van HEK293 cellen die een eiwit van interesse ¹⁰ ontwikkeld. Dit systeem maakt het beta-cel cytoplasma onaangetast blijven terwijl extracellulair eiwit-eiwit interacties worden gemanipuleerd.

Protocol

1. Transfectie van HEK293 Layer

1. Bereid HEK293 celmedium door aan 500 ml flessen DMEM (met 4,5 g / ml glucose en fenolrood en zonder glutamine): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicilline / streptomycine-oplossing, 5 ml 100x L-glutamine-oplossing en 500 pi amfotericine B.
2. Plaat uit HEK293 cellen in een 24-wells plaat met 0,5 ml HEK293 media per putje. Zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig worden verdeeld over de bodem van de plaat.
3. Wanneer HEK293 cellen 100% samenvloeiing bereiken, transfecteren met 0,8 ug van plasmide codeert het eiwit van belang (ingevoegd in een zoogdierlijke expressievector) en 2 pl Lipofectamine 2000 volgens het lipofectamine protocol. We hebben ervoor gekozen om de pcDNA 3.3 ruggengraat ontworpen voor expressie in zoogdiercellen te gebruiken.
4. Eventueel, na 6 uur incubatie, wisselen de transfectie media beschreven in de Lipofectamine protocol met normale HEK293 media.
5. Om expressie van het getransfecteerde prote evaluerenin, kan een subset van de getransfecteerde weefselkweekputjes worden gebruikt voor immunofluorescentie detectie van het tot expressie gebrachte eiwit of Western blot analyse van eiwitexpressie met behulp van standaardtechnieken.

2. Optioneel Fixatie van HEK293 cellen die Getransfecteerde Protein

Getransfecteerde HEK293 cellen voorzichtig om gemengde cultuurmedium in media die schadelijk levende HEK293 cellen (bijv. stap 3.9 hieronder) of de efficiënte bereiding van tevoren platen meerdere experimenten in een keer mogelijk maakt (zie discussie) zou kunnen worden vergemakkelijkt worden vastgesteld.

1. Voeren modelstudies het tijdsverloop van de expressie van het eiwit in de HEK293 cellen te bepalen.
2. Na transfectie van de HEK293 cellaag, zuig het medium van de cellen bij de post-transfectie tijdstip in verband met het hoogste niveau van expressie. Indien dit gebeurt binnen de eerste 24 uur, niet aspireer pas 24 uur na transfectie.
3. Wassen HEK293 cellen voorzichtig met D-PBS voeg 500 ul 4% paraformaldehyde (PFA) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. (Tot 4% PFA-oplossing te maken, te beginnen met 16% oplossing in 1X PBS en verdunnen 1:04 met 1X PBS.)
4. Met steriele PBS voorzichtig was de cellen 3 keer in PBS en incubeer O / N bij 4 ° C.
5. Was de cellen 3 maal met steriel PBS, dan PBS toe en laat bij 4 ° C totdat het nodig is (maximale bewaartijd is afhankelijk van eiwitten tot expressie. We slaan HEK293-cellen die aan neuroligin isovormen uitspreken voor maximaal 2 weken zonder significante veranderingen in de waargenomen effecten op de insuline secretie).

3. Co-kweken van INS-1 Beta Cellen met HEK293 Cells

1. Bereid INS-1 media door aan 500 ml RPMI 1640 (met glucose en fenolrood en zonder glutamine): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicilline / streptomycine, 5 ml 100x L-glutamine-oplossing, 5 ml natrium pyruvaat, 500 gl amfotericine B, 500 ui beta-mercaptoethanol (dit is bijna identiek aan de medium typisch gebruikt voor de primaire kweek eilandje behalve de toevoeging van beta-mercaptoethanol).
2. Met behulp van Cell-stripper (of een ander niet-enzymatische cel remover), oogst INS-1 cellen bij ongeveer 70-80% confluentie door de bodem van een T75 kolf. Elke fles zal ongeveer voldoende cellen voor 48 putjes.
3. Na stoppen met draaien cellen in de centrifuge gedurende 3 minuten bij 1200 rpm, resuspendeer in een 50/50 mengsel van INS-1 en HEK media. Voor een 70-80% samenvloeiing kolf van INS-1-cellen, opnieuw in suspensie in circa 25 ml van mixed media.
4. Bij gebruik van HEK293 cellen die in paraformaldehyde vastgesteld in plaats van levende HEK293 cellen, resuspendeer de INS-1 cellen in 100% INS-1 media in plaats van mixed media.
5. Pipetteer 10 ml, los van de cellen van de pellet tot een homogene celsuspensie te maken.
6. Aspireren om de media op de HEK293 cellen te verwijderen.
7. Met behulp van een P1000 pipet voorzichtig 500 ul van INS-1 celsuspensie op de HEK cellaag langs de zijkanten of het goed. Na elke 6 putten, gebruik dan een pipet 10 ml van de INS-1-cellen weer opnieuw in suspensie om een ​​homogene celsuspensie te garanderen. De opzet van de co-cultuur opstelling is weergegeven in figuur 1.
8. Incubeer de cellen gedurende 24-48 uur, afhankelijk van het experimentele protocol.
9. Als er meer dan 48 uur coculture periode is vereist, gebruik optionele stappen in paragraaf 2 hierboven om de HEK293 cellen te repareren.
10. Bij gebruik van primaire los knaagdier of menselijke eilandjes [zie bijv. voorafgaande protocollen in JoVE ^11-15], ervoor zorgen dat een geschikte media zoals RPMI met 5 ml pen / strep, 5 wordt ml L-Glut, 0,5 ml amfotericine-B gebruikt in plaats van INS-1 media. Hoewel men kan gebruiken los eilandje cellen in een 24 wells plaat, in de praktijk vanwege het grote aantal eilandjes potentieel nodig is, is het aanbevolen dat de aandacht naar beneden worden gegeven aan schaalvergroting een 48 well plaat (noodzakelijk minder eilandje cellen per well). Op een 48 well plaat, voeg ongeveer 100 eilandjes ter waarde van dissociatieted cellen per plaat te beginnen. Afhankelijk van de werkzaamheid van dissociatie en de methode kan minder eilandjes nodig.

4. Glucose gestimuleerde insuline secretie

1. Preincubate cellen in 250 pi 2,5 mM glucose in KRB (Krebs-Ringer bicarbonaat buffer) gedurende ten minste 1 uur. Om preincubate, verwijdert coculture middelgrote en direct te vervangen door KRB. Deze uitwisseling dient te gebeuren een putje in een tijd om blootstelling van INS-1 cellen om milieu zuurstof te minimaliseren. Aspireren met een hand terwijl pipetteren de lage (2,5 mM) glucose KRB met de andere.
2. Exchange voorincubatie KRB 250 ui of 2,5 mM of 20 mM glucose in KRB buffer een putje per keer.
3. Indien nodig voor de specifieke experiment kunnen aanvullende afscheiding zoals 100 uM IBMX worden toegevoegd aan een robuustere gestimuleerde insuline secretie respons teweeg. Gedissocieerde primaire eilandje beta-cellen in het bijzonder zijn slecht reageren op verhoogde glucoseconcentraties alone, dus even bijzonder toevoeging van IBMX of andere afscheiding worden overwogen ^16,17.
4. Na 1 uur incubatie, overdracht media microfuge buizen en spin 1500 xg gedurende 5 minuten.
5. Verwijder de 200 pi van het supernatant en gebruik deze voor analyse door insuline RIA of ELISA.
6. Om cellysaat bereiden, voeg 100 ul RIPA cell lysis buffer (150 mM NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 en Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) met proteaseremmers de plaat onmiddellijk na het verwijderen van media en incuberen bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
7. Gedeactiveerd lysaat gedurende 15 minuten bij 10.000 xg en verwijder 50 pl supernatant voor analyse door insuline RIA of ELISA.

Resultaten

Als hier beschreven, hebben we het effect van verschillende varianten van de proteïne neuroligin op insulinesecretie getest. Dit vult onze gepubliceerde werk wordt de invloed van neuroligin 2-on beta-celfunctie ^10. Figuur 2, bijvoorbeeld, toont resultaten van coculturing INS-1 beta-cellen HEK293 cellen getransfecteerd met een expressie neuroligin isovorm hier aangeduid als NL- X. Dit experiment werd ontworpen om de hypothese dat NL-X transcellulaire bezighoudt met interacties verhogen insulin...

Discussie

De co-cultuur hier beschreven methode een effectieve manier om de fysiologische betekenis van specifieke beta-celoppervlak transmembraan eiwitten bepalen en specifiek hun extracellulaire domeinen. Door kweken beta cellen of insulinoma cellen (zoals de INS-1 cellen zijn hier toegepast) in contact met HEK293 cellen die een eiwit van belang op het celoppervlak, kan experimenten om de effecten van extracellulair eiwit-eiwit interacties bepalen zonder direct verstoren het intracellulaire milieu van de cellen. Omdat de eiwitt...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
pcDNA 3.3 vector/backbone	Invitrogen	K830001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	18324012
DMEM	Mediatech	45001-312
Pen/strep oplossing	Mediatech	45001-652-1
Amphotericin B	Mediatech	45001-808-1/30
RPMI-1640	Mediatech	45001-404
D-PBS	Mediatech	45001-434
Sodium Pyruvaat	Mediatech	45001-710-1
2-Mercapt–thanol	Invitrogen	21985023
Cell stripper	Mediatech	45000-668
T75 Flask	BD	1368065
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50980487
10x PBS	Mediatech	45001-130
Foetaal bovien serum	Mediatech	MT35010CV
IBMX	Sigma	I5879-100MG
RIPA lysis buffer	Sigma	R0278