Wij rapporteren een efficiënte en eenvoudige methode om embryo's te isoleren in een vroeg stadium van de ontwikkeling van Arabidopsis thaliana Zaden. Tot 40 embryo's kunnen worden afgezonderd 1 uur tot 4 uur, afhankelijk van de stroomafwaartse toepassing. De procedure is geschikt voor transcriptome, DNA-methylatie, reporter genexpressie, immunostaining en fluorescentie In situ Hybridisatie analyses.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo's van
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In bloeiende planten, het embryo zich ontwikkelt binnen een voedende weefsel - het endosperm - omringd door de moederlijke zaad integumenten (of zaadhuid). Als gevolg daarvan, is de isolatie van de plant embryo's in een vroeg stadium (1 cel tot bolvormige stadium) technisch uitdagende vanwege hun relatieve ontoegankelijkheid. Efficiënte handmatige dissectie in de aanloopfase wordt sterk belemmerd door de kleine omvang van jonge Arabidopsis zaden en de kleverigheid van het embryo aan het omringende weefsel. Hier beschrijven we een werkwijze die de efficiënte isolatie van jonge Arabidopsis embryo maakt, bevatten tot 40 embryo's in 1 uur tot 4 uur, afhankelijk van de stroomafwaartse toepassing. Embryo's worden uitgebracht in een isolement buffer met iets breken 250-750 zaden met een plastic stamper in een Eppendorf buis. Een glazen microcapillaire bevestigd aan ofwel een standaard laboratorium pipet (via een rubberen buis) of een hydraulisch gestuurde microinjector wordt gebruikt om embryo's te verzamelen van druppeltjes plaatsd op een multi-well slide op een omgekeerde lichtmicroscoop. De technische vaardigheden die nodig zijn eenvoudig en gemakkelijk overdraagbaar, en de basis-setup is dure apparatuur nodig. Verzamelde embryo's zijn geschikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals RT-PCR, RNA sequentie, DNA methylatie analyse, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), immunokleuring en reporter assays.
Inleiding
De embryo van bloeiende planten wordt omgeven door het endosperm, een voedingsweefsel afgeleid van een tweede fertilisatiegebeurtenis. Zowel embryo en endosperm zijn omgeven door verschillende cellagen van de zaadhuid. Gezamenlijk vormen deze weefsels een zaad dat in de vrucht te ontwikkelen. Zo zijn weefsel-en cel-specifieke analyses van Arabidopsis embryo's sterk aangetast vanwege hun ontoegankelijkheid. Toch embryo's in de late-bolvormige of latere stadia zijn relatief goed vatbaar voor handmatige dissectie met behulp van fijne wolfraam naalden onder de stereomicroscoop, of door lichte druk op het zaad met behulp van een tang om ze te halen. Dergelijke technieken zijn met succes toegepast transcriptoom of epigenoom profilering analyses zoals microarray hybridisatie bisulfietsequencing of RNA sequentie (bijvoorbeeld 1-3). In tegenstelling, studies van embryo's in de zygote tot begin bolvormige stadium blijven technisch uitdagend. Tot op heden slechts een paar studies hebben reported transcriptoomanalyses op jonge embryo's met behulp van laser-capture microdissectie (LCM) van embryonale weefsels van vaste zaad hoofdstukken 4 of manuele extractie van individuele embryo vanuit zaden met behulp van fijne instrumenten 5. Echter, LCM apparatuur niet algemeen beschikbaar en handmatige extractie embryo in een vroeg stadium is tijdrovend en vereist uitstekende dissectie vaardigheden die niet makkelijk overdraagbaar. Naast genoom-brede analyses, in situ genexpressie analyses zijn ook moeilijk te voeren op jonge hele-mount embryo van Arabidopsis. Tot op zekere hoogte kunnen jonge embryo op objectglaasjes worden vrijgegeven door lichte druk op de zaden en gebruikt voor reporter assays of proteindetectie door immunokleuring (zie bijvoorbeeld 6,7). Deze techniek is echter niet mogelijk high-throughput embryo isolatie, waardoor kwantitatieve analyse belemmeren.
Daarom is een efficiënt en snel ontwikkeld protocolvoor vroege embryo isolatie van Arabidopsis zaden die is eenvoudig op te zetten, gemakkelijk overdraagbaar, en geschikt voor een verscheidenheid van downstream toepassingen. Het basisprincipe is om voorzichtig te verpletteren zaden - ontleed van jonge siliques in een Eppendorf buisje met een plastic stamper in een geschikte isolatie buffer. Het extract wordt in druppels op een multi-well glijbaan en gescreend op de aanwezigheid van vrijgekomen embryo's in de gewenste fase met behulp van een omgekeerde microscoop. Embryo's worden verzameld met behulp van een glazen microcapillaire bevestigd aan een microinjector of een standaard laboratorium pipet. Voor moleculaire toepassingen, worden embryo's tweemaal gewassen door herhaalde introductie in druppels van nieuwe isolatie buffer voor het overzetten naar de bestemming buffer in een minimaal volume. Voor cytologische toepassingen (reporter assays, immunokleuring, FISH), kunnen wasstappen worden weggelaten.
De methode biedt verschillende voordelen: (i) het levert 25-40 embryo ~ 45 min voor cytologische appcaties of 3-4 uur gedurende moleculaire toepassingen (waaronder de wasstappen), (ii) het mogelijk isoleren van specifieke embryonale stadia, (iii) het kan gemakkelijk worden overgedragen aan andere personen laboratoria vanwege de eenvoudige installatie, (iv) vereist betaalbaar Voorzieningen voor basale configuratie die vatbaar is voor upgrades, en (v) werd met succes gebruikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals RNA sequencing 8, genspecifieke DNA-methylatie analyse 9 reporter assays (10 en Raissig et al.., in prep.) en VIS (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux ongepubliceerde, zie figuur 5).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De procedure wordt samengevat in het in figuur 1 getoonde stroomdiagram. De microcapillairen en instrumentele instellingen worden getoond in Figuur 2 en Figuur 3, en typische stappen embryo isolement getoond in figuur 4.
1. Materiaal en Buffer Voorbereiding
1.1 Silicon coating van glas microcapillairen
- Plaats de microcapillairen in een 15 ml Falcon buis met ~ 5 ml Sigmacote (Sigma) en zwenken meerdere malen.
- Verwijder de oplossing, plaats de Falcon buis met de capillairen in een aluminiumfolie en bak ze gedurende 3 uur bij 60 ° C. Bewaar bij kamertemperatuur.
1.2 Verkrijgen ~ 50-100 micrometer diameter microcapillaire tips
- Pull 1 mm diameter glazen capillairen handmatig over een bunsenbrander of met behulp van een commerciële trekker (verticale filament puller of micropipet trekker).
- Gebruik een diamant-tip pen of mes aan de punt van de getrokken capillaire gesneden om de gewenste opening te creëren. Selecteer de beste-vormige capillairen onder een stereomicroscoop. De opening moet 50-100 urn (figuur 2).
1.3 Slide voorbereiding
- Siliconize schoon dia's door die alle de putten met Sigmacote (~ 1 ml / glijbaan) gedurende 5 minuten, te verwijderen. Bak 3 uur in aluminiumfolie. Bewaar bij kamertemperatuur.
- Was de multi-well glazen microscoopglaasjes gedurende 10 min in 10% SDS, 2 x 2 min in nuclease-vrij water (geautoclaveerd DEPC-DDH 2 O), 2 min in 70% ethanol, 2 minuten in 100% ethanol, lucht- drogen. Alle stappen worden gedaan in geautoclaveerde Coplin potten. Slides kunnen worden hergebruikt meerdere keren verschaffen grondige reiniging tussen elk gebruik.
- Vlak voor embryo isolatie verspreid ~ 0,5 ui 10 mg / ml runderserumalbumine (BSA) met een pipet over het gehele oppervlak van elk putje en drogen.
1.4 Microscoop en capillaire setup
- Gebruik een omgekeerde microscoop met 10x en 20x objectief. Optimaliseer het licht contrast (embryo's zijn heel transparant).
- Plaats een micromanipulator om de glazen capillair naast de microscoop te houden. Het glazen capillair is verbonden met een microinjector (figuur 3A) of een normale P-200 pipet via een rubberen slang (figuur 3B, zie Discussion voor een gedetailleerde beschrijving van deze opstelling).
- Plaats de capillaire boven objectglaasje met een hoek ~ 70 ° (fig. 3) en stel de positie van de opening in het gezichtsveld hebben.
- Vlak voor embryo isolatie nemen en los ~ 5-10 gl BSA (1 mg / ml) het bekleden van de capillair.
1.5 Buffers
Tabel 1 geeft de isolatie en de bestemming buffers afhankelijk van de downstream-toepassingen.
- Bereid ~ 1 ml isolatie buffer per monster vers vóór gebruik en bewaar deze op ijs.
- Bereid de bestemming buffer in een 0,5 ml Eppendorf buis met lage bindingsaffiniteit op ijs (moleculaire toepassingen) of op een objectglaasje (cytologische toepassingen) in een vochtige kamer.
2. Zaad Dissection en Embryo Extraction
2.1 Synchronisatie van Seed Development
- Ontmannen bloemen en houd ze 2 dagen in de groei kamer terwijl het vermijden van contact van de blootgestelde stampers met andere bloemen, dan bestuiven ze (bijv. 11).
- Test de fase van ontwikkeling onder je groeiomstandigheden door microscopisch onderzoek van gewist zaden. Met onze groei-omstandigheden (16 uur licht bij 21 ° C, 8 uur donker bij 18 ° C en 70% luchtvochtigheid) zaden verzameld 2,5 dagen na bestuiving (DAP) leverde voornamelijk 2-4 cel embryo's en zaden verzameld 3,5-4 DAP leverde bolvormige embryo.
2.2 Seed Dissection en Rupture
- Verwijder de sBehoeften 10-15 siliques (~ 2.5 DAP) onder een stereomicroscoop met een pincet en insuline naalden.
- Dompel de zaden in 20 gl isolatiebuffer in een 2 ml rondbodem Eppendorf buisje geplaatst op ijs.
- Voorzichtig verpletteren de zaden met een plastic stamper (vooraf gereinigd met 10% SDS, gespoeld met DEPC-DDH 2 O en gewassen met 70% ethanol) aan de embryo los wanneer het extract troebel. De kracht van toepassing is moet worden vastgesteld door elke gebruiker op proef.
- Spoel de stamper met 300 ul van isolatie buffer om de stamper te wassen en verdun het monster.
- Spin-down het extract bij 5000 xg gedurende 5 sec. Voorzichtig resuspendeer de pellet extract door pipetteren up-en-down 2-3 keer.
- Filtreer het extract met een 30 um nylon (gemonteerd op buis adapters, bv van PartecCelltricks). Spoel het gaas met een extra 200 ul isolatie buffer.
3. Embryo Isolatie
3.1 Slide voorbereiding
- Plaats een schone, BSA-gecoate en gesiliconiseerde multi-well glijbaan op het podium van de omgekeerde microscoop, resuspendeer het gefilterde extract van de zaden door pipetteren zachtjes op en neer en pipet 2 druppels van 40-50 ul extract van de zaden in 1 of 2 waterputten . Screening slechts 1 of 2 druppels per keer voorkomt verdamping van het monster.
- Breng 50 pl vers isolatiebuffer (1 st wash druppel) in een putje van een andere dia bereid zoals voorheen. Bewaar deze dia in een overdekte, vochtige kamer om verdamping te voorkomen.
3.2 Scherm, schoon, verzamelen
- Screenen de druppeltjes extract van embryo's in het gewenste stadium met de 10x vergroting doelstelling. Indien nodig, bevestig het podium met de 20x vergroting. De embryo meestal naar de bodem van de schuif.
- Handmatig verwijderen van rommel rond het embryo met een wolfraam naald, een insuline naald of soortgelijke apparatuur.
- Verplaats de glazen capillaire nabij het embryo met behulp van de micromanipulator, take het embryo met zo weinig mogelijke oplossing.
- Verzamel een aantal embryo's (bv. al een druppel) en laat ze in de 1 e wassen druppel (moleculaire toepassing) of in de bestemming buffer (cytologische toepassingen). Elke verzameling ronde moet binnen 5-10 minuten en embryo's worden bewaard in een minimaal volume (het totale volume van alle verzamelen ronden moet <5 ul be) worden verzameld.
- Herhaal de screening en ophalen tot de gewenste hoeveelheid embryo wordt verzameld in de 1e wash druppel (centrale, indien mogelijk, herinnering vergemakkelijken).
- Herinneren alle embryo's in een keer uit het wassen druppel (als puin worden overgedragen, verwijder ze dan met een naald vóór herinnering).
- Laat de embryo's in een 2 e wassen daling van 50 pl. Herhalen 3.2.6.
- Laat de embryo's in de bestemming buffer. De overdracht mag slechts betrekking hebben op een contact, en niet onderdompeling, van de capillaire tip.
- Vervang de microcapilLary voor het volgende monster.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Onze embryo isolatieprocedure (figuur 1) maakt isolatie van maximaal 40 embryo's in 4 uur als wassingen worden uitgevoerd, bijvoorbeeld voor moleculaire toepassingen, of in minder dan een uur als wast zijn weggelaten, bijvoorbeeld voor cytologische toepassingen. Figuur 2 toont hoge en lage kwaliteit microcapillaire tips en Figuur 3 de inrichting van de embryo isolatie machine. Figuur 4 toont het proces van embryo isolatie op het om...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We ontwikkelden een embryo isolatieprotocol dat snel doeltreffende en kan gemakkelijk worden overgedragen naar andere laboratoria.
De hier beschreven apparatuur bestaat uit een omgekeerde microscoop, een micromanipulator, glas microcapillairen, een verticale gloeidraad trekker en een microinjector (figuur 3A). De opstelling is vergelijkbaar met die beschreven voor de enkele dierlijke cel isolement transcriptomics analyses 17. We hebben ook met succes gewerkt met e...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij willen graag Tal Nawy en Martin Bayer bedanken voor hun advies over embryo isolement. MTR, VG, UG en CB bedacht het embryo isolatie materiaal. MTR, VG en CB ontwikkelde het embryo isolatie protocol. MTR, VG en CB gevestigde het protocol, die de embryo's, en de gegenereerde embryo cDNA, VG deed de PCR, MTR de GUS kleuring, JJ de FISH experimenten. MTR, VG, CG en UG schreef het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de Universiteit van Zürich, een Fellowship van de Roche Research Foundation (MTR), en subsidies van de Zwitserse Nationale Stichting (tot UG en CB).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies |
Referenties
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327(2011).
- SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634(2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
