Isolatie van de Native Soil Micro-organismen met Potentieel voor Breaking Down Biologisch afbreekbaar plastic mulch films gebruikt in de landbouw

Samenvatting

Plastic folies label "biologisch afbreekbaar" zijn commercieel beschikbaar voor gebruik in de landbouw als mulch. Grondbewerking vertegenwoordigt een aantrekkelijke verwijdering methode, maar degradatie onder veldomstandigheden wordt slecht begrepen. Het doel van deze studie was werkwijzen voor het isoleren van natieve bodemschimmels en bacteriën die plastic mulch films koloniseren na grafveld ontwikkelen.

Samenvatting

Schimmels afkomstig uit agrarische gronden die in de handel verkrijgbaar biologisch afbreekbare mulch (BDM) films gekoloniseerd werden geïsoleerd en onderzocht op mogelijkheden om kunststoffen degraderen. Typisch, wanneer preparaten van kunststof zijn bekend en een bron van het uitgangsmateriaal is, poeder plastic kan worden gesuspendeerd in agar gebaseerde media en degradatie bepaald door visualisatie van clearing zones. Echter, deze benadering slecht bootst in situ afbraak van BDM. Eerst worden BDM niet gedispergeerd als kleine deeltjes door bodem matrix. Ten tweede zijn BDM niet commercieel verkocht als zuivere polymeren, maar als films met additieven (bijvoorbeeld vulstoffen, weekmakers en kleurstoffen) die microbiële groei kunnen beïnvloeden. De hierin beschreven procedures werden gebruikt voor isolaten verkregen van bodem-begraven mulch films. Schimmelisolaten verworven van opgegraven BDM's werden individueel getest op groei op stukjes nieuwe, gelegd bovenop gedefinieerd medium dat geen koolstofbron e disinfested BDMXCEPT agar. Isolaten die groeiden op BDM's werden verder getest in vloeibaar medium waar BDM's waren de enige toegevoegde koolstofbron. Na ongeveer tien weken werden schimmelkolonisatie en BDM degradatie bepaald door scanning elektronenmicroscopie. Isolaten werden geïdentificeerd via analyse van ribosomaal RNA gen sequenties. Dit rapport beschrijft methoden voor schimmel-isolatie, maar ook bacteriën werden geïsoleerd met behulp van deze methoden te vervangen door media die geschikt is voor bacteriën. Onze methodologie moet blijken nuttig voor onderzoeken naar afbraak van intacte kunststoffolies of producten waarvoor plastic grondstoffen onbekend zijn of niet beschikbaar. Maar onze aanpak voorziet niet in een kwantitatieve methode voor het vergelijken van de tarieven van de BDM degradatie.

Inleiding

Degradatie is van oudsher beschouwd als een ongewenste eigenschap van kunststof polymeren, omdat afbraak verkort de levensduur van het product en duurzaamheid. Onlangs heeft het bewustzijn van de milieuproblematiek door plastic afval in de natuurlijke omgeving ^1,2,3 biologisch afbreekbare plastics gemaakt een aantrekkelijk alternatief voor conventionele kunststoffen. Afbraak (gedefinieerd als structurele veranderingen, fragmentatie en vermindering molecuulgewicht, integriteit en sterkte ^4,5) resulteert uit een reeks gebeurtenissen, zowel abiotische processen (thermische stress, foto-oxidatie, hydrolyse, erosie en mechanische stress), en biologische afbraak ^6. Terwijl abiotische processen de fragment grootte en eigenschappen van kunststof te veranderen, zijn micro-organismen die voor hun uiteindelijke mineralisatie water en kooldioxide (in aërobe omstandigheden) en / of methaan (onder anaërobe omstandigheden).

Een aanzienlijke niche voorbiologisch afbreekbare kunststoffen bestaat in de landbouw, waar de plastic mulch worden gebruikt om onkruidgroei te voorkomen, de bodem vocht vast te houden en om de bodem temperaturen stijgen ^7,8. Honderdduizenden hectaren in de Verenigde Staten alleen al zijn bedekt met plastic mulch ^9, met inbegrip mulch samengesteld uit biologisch afbreekbaar plastic. Na een gewas groeiseizoen, de mogelijkheden voor het storten van biologisch afbreekbare mulch (BDM) zijn ter beschikking op een stortplaats, verbranding voor energie terugwinning ^10, degradatie via compostering of afbraak in de bodem na grondbewerking ^11. Hiervan is de minst arbeidsintensieve lot ploegen BDM's in de bodem, maar zonder efficiënte afbraak en mineralisatie tijdens niet-crop maanden (meestal in de winter), kan plastic fragmenten in het voorjaar grondbewerking en het planten blijven en interfereren met landbouwwerktuigen, en volharden in de omgeving waar ze van grote invloed fauna, flora en microbiota ^1,2,3,10.

Hoewel veel plastic producten, waaronder landbouw mulch films, voorzien van het label "biologisch afbreekbaar" of "composteerbaar" in de praktijk kan afbraak en mineralisatie te inefficiënt en / of onvolledig te zijn in-bodem ontleding een levensvatbaar alternatief voor de verwijdering van deze producten. Bijvoorbeeld, oxo-afbreekbare polyethylenen verwezenlijkt 12,4% mineralisatie na een jaar verwering en drie opeenvolgende maanden in een 58 ° C compost, en minder dan de helft hoeveelheid mineralisatie gebeurde toen de compost temperatuur was 25 ° C ^12. In de winter, zou bodemtemperatuur op de meeste locaties lager dan een van deze temperaturen zijn, vermoedelijk resulteert in nog lagere microbiële activiteit en bijgevolg minder mineralisatie. Naast het vertragen afbraaksnelheden, is misbruik van de term "biologisch afbreekbaar" heeft geleid tot wantrouwen van deze producten door de consument ^13,14, waaronder die in de agrarische sector. Biologische afbraak is de conversievan polymeren van kooldioxide (en / of methaan) en water ¹⁴ door natuurlijk voorkomende micro-organismen ^4. Daarom moet biologische afbraak chemisch worden gewaardeerd; de fysieke vereniging van micro-organismen met een substraat maakt microbiële afbraak van dat materiaal niet impliceren.

Als deel van een inspanning om duurzaam gebruik van BDM's in de landbouw te onderzoeken, dit onderzoek gericht op het ontdekken micro-organismen afkomstig uit landbouwbodems dat koloniseren en degraderen de handel verkrijgbare BDM. Standaard testmethoden zijn gepubliceerd voor chemisch meten van de afbraak van biologisch afbreekbare kunststoffen door abiotische en biologische middelen ^15,16,17. Echter, deze methoden geen afbraak van kunststof pakken door individuele microbiële soort of de methoden aangegeven voor de isolatie. De methodiek die hierin meer lijkt op standaard methoden ontwikkeld om kunststoffen voor resistentie tegen microbiële afbraak te evalueren na het enten exemplaren met schimmelsporen18,19.

Bij formuleringen van kunststof zijn bekend en een bron van de voeding is, kan plastic poeder worden gesuspendeerd in agar gebaseerde media en degradatie bepaald door visualisatie van clearing zones ^13. Deze werkwijze is eerder gebruikt om micro-organismen die polymeren zoals polyurethaan ²⁰ afbreken, poly-(butyleen succinaat-co-adipaat) ^21, en ​​poly (melkzuur) ²² identificeren. Een soortgelijke methode houdt schorsing zuivere poeder plastic in vloeibaar medium, waar het plastic is de enige koolstofbron ^20,23. Hoewel deze werkwijzen hebben het voordeel van een bepaald systeem, maar slecht nabootsen in situ afbraak van BDM. Eerst wordt het oppervlak anders verdeeld omdat BDM niet gedispergeerd in kleine deeltjes door bodem matrix, maar, verkocht en gebruikt als films. Ten tweede, de chemische samenstelling van BDM is dan puur polymeren. BDM algemeen bevatten additieven zoalsvulmiddelen, weekmakers en kleurstoffen, en deze additieven kunnen beïnvloeden microbiële groei en daarmee de snelheid van mineralisering. Daarom, en omdat de samenstelling van bepaalde commerciële films in deze studie waren merkgebonden, plastic film binnen haar ready vorm werd gebruikt om schimmels en bacteriën te isoleren. Voor de eenvoud worden de volgende methoden alleen beschreven voor paddestoelen, met modificaties opgemerkt eventueel voor bacteriële isolaties.

In een recente studie ^24, werden drie commercieel verkrijgbare BDM en een experimentele film gebruikt op agrarische locaties in drie verschillende regio's van de Verenigde Staten voor een groeiseizoen, en vervolgens in mesh (250 micron) zakken geplaatst en begraven voor een winter in de bodem op dezelfde plaatsen. De 250 micron gaas openingen maken schimmeldraden door te dringen, terwijl exclusief wortels en de meeste bodemfauna, en het minimaliseren van de bodem aantasting ^25,26. Nylon materialen te voorkomen bag afbraak in de bodem. Na opgraving, fungal isolaten werden uit BDM stukken en beoordeeld op groei op minimaal medium zonder koolstofbron behalve de agar en 5 cm x 5 cm oppervlak disinfested kwadraat van nieuwe, ongebruikte BDM film die pre-disinfested. De meeste kunststoffen zoals folies niet autoclaveerbaar zonder verlies van integriteit was zo UV licht gebruikt om microbiële cellen die op het kunststof doden. ISO 846 ¹⁹ recommends oppervlak insectenverdelging in 70% ethanol en vervolgens worden gedroogd, maar als deze methode moet men zorgen dat er geen component of additief van de film nadelig wordt beïnvloed door de ethanol. Aangezien BDM vermoedelijk worden vervaardigd zonlicht weerstaan, werd UV gekozen als decontaminatiemethode.

Isolaten groeiden BDM stukken beter dan op minimaal medium alleen werden geselecteerd voor verdere studie. Agar, een polysaccharide door zeealgen, wordt gebruikt om microbiële media stollen omdat het meestal niet metabolisch gebruikt door landbouwkundig en medisch nietkunnen micro-organismen, maar agar-hydrolyserende enzymen zijn geïsoleerd uit mariene bacteriën ²⁷ en agar-hydrolyserende bacteriën zijn ook geïsoleerd uit de bodem ^28. BDM polymeren en agar zijn beide naar verwachting zeldzame substraten voor enzymen uitgescheiden door bodemschimmels, die niet hebben gewerkt in omgevingen die deze polymeren als potentiële bronnen van voedingsstoffen bevatten, maar beide substraten aanwezig zijn in de plaat bioassay hierin beschreven (stap 7) zijn. Schimmels die BDM maar niet agar als koolstofbron kan worden van schimmels die alleen agar gebruiken, door de groei vergeleken op agar gestold medium dat i) geen toegevoegde koolstofbron behalve agar (negatieve controle), ii) BDM films (experimenteel) en iii) glucose (positieve controle). Groei van alle isolaten wordt verwacht op minimaal medium plus glucose, schimmels niet voortvloeit uit glucose-bevattende platen niet in staat zijn de groei van de bepaalde minimale medium in het experiment. Potentiometeral BDM afbrekers moet groeien op agar-gestolde minimaal medium + BDM film beter dan ze groeien op agar-gestolde minimaal medium alleen. Schimmels groeien op minimaal medium agar platen-afbrekers of oligotrofen en ook naar verwachting groeien op agar verbonden BDM films in bioassay platen, maar niet op de films zelf (tenzij ze serendipitously eveneens nadelig BDM polymeren).

Om de kans op het zien van de microbiële groei te wijten aan het gebruik van agar en niet die van BDM's te elimineren, volgden we onze eerste test voor BDM kolonisatie op agar platen met een bioassay in gedefinieerde bouillon medium (Stap 9). BDM stukken vertegenwoordigen de enige bekende koolstofbron in de bioassay buizen.

Na de eerste screening, en op de heropleving van glycerol voorraden van de isolaten, sommige gevormd karige maar zichtbaar mycelium in vloeibaar gedefinieerd medium dat geen bekende koolstofbron. Deze resultaten suggereren dat een aantal van de verkregen isolaten oligotrophs - organismen die groeien wegvangen zeer kleine hoeveelheden koolstof, stikstof en andere voedingsstoffen opgelost hetzij in de waterige omgeving of situaties zoals vluchtige stoffen in de lucht ^29,30,31. Identificatie van soorten via 18S ribosomaal DNA-analyse ondersteunde dit standpunt, zoals veel van de isolaten geëvenaard schimmelgenera eerder gemeld om oligotrofie ³² vertonen. Oligotrofen, die algemeen saprofyten vereisen een breed scala van mogelijkheden voor metabolische substraatgebruik in diverse omgevingen ^30. Zo is het niet verwonderlijk dat dezelfde schimmels we geïsoleerd van BDM (vermoedelijk die ongewone enzymatische mogelijkheden) aangetoond voedselarme capaciteiten, en waren in staat om te groeien op sporen van verontreinigingen zoals huidvetten tegen vingerafdrukken, stof, of sporen vluchtige stoffen in de lucht. Door de isolatie van oligotrofen concludeerden we dat groei op een oppervlak BDM alleen niet kan worden gebruikt om BDM afbraak afleiden. De hierin beschreven werkwijzen weerspiegelen onze inspanningen om screen inheemse BDM kolonisatoren uit agrarische bodems voor bonafide afbraak BDM.

Protocol

Deze procedure vereist ten minste verscheidene maanden incubatie van BDM films in de bodem, en nog meer maanden sequentiële bioassays zowel op agarplaten en agar-free, chemisch gedefinieerde bouillon kolonisatie en degradatie beoordelen. Elke methode worden weergegeven in de volgorde waarin ze worden uitgevoerd.

1. Incubatie van BDM Films in de bodem

Nemen BDM films in de grond onder omstandigheden nabootsen die waaronder zij wordt verwacht te degraderen. Acquire 400 g (droog gewicht) van ingezeten bodem en sandwich een 10 cm x 10 cm BDM met de grond in een 13 x 13 cm nylon (250 micron) zak. Sluit met nylon draad. Incubatie tijden zijn naar keuze van de experimentator. Monitor en / of wijzigen parameters microbiële activiteit (bijv. bodemtemperatuur, voedingsstoffen en water) op regelmatige tijdstippen gedurende de incubatieperiode eventueel relevant.

2. Voorbereiding van de Mediaen reagentia

Om te voorkomen dat er bronnen van voedingsstoffen per ongeluk in media en cultuur buizen, te gebruiken reagentia pa, nieuw gekochte kweekbuizen, Type I ultrapuur (bv. nanozuiver) water, en stringent gewassen glaswerk voor het mengen van media. Voorkom kruisbesmetting van reagentia - is het het beste om een ​​speciale set van reagentia te gebruiken en glaswerk voor dit doel. Merk op dat het mogelijk is dat schimmels worden geïsoleerd waarvan de groei wordt geremd door een ingrediënt in onderstaande reagentia. Als dit gebeurt, kunnen sommige optimalisering vereist.

1. Voorafgaand aan het maken van media, wast alle nodige glaswerk met een laboratorium detergent en vervolgens acid-wash (bijvoorbeeld 's nachts laten weken in 10% HCl). Een minimum van twaalf keer in gedestilleerd water te spoelen en twee keer in ultrapuur water. Dek alle glaswerk met schoon aluminiumfolie om stof uit te sluiten. Draag handschoenen en raak de binnenkant en de randen van schepen voor de huid oliën uit te sluiten van vingerafdrukken. Om te voorkomen dat eventuele zeep resicontributie en krassen in glas waarin kolonisatie, cultuur schimmels in nieuw-gekochte (ongebruikt), gespoeld en geautoclaveerd glascultuur buizen en doppen vergemakkelijken.
2. Aardappel dextrose agar (PDA) wordt gebruikt voor de initiële isolatie van schimmels uit de bodem, en vaststelling van enkele geïsoleerde kolonies en genereren van inoculum voor langdurige opslag. Bereid de media volgens de instructies van de fabrikant en na het autoclaveren (na afkoeling tot 50 ° C), voeg chlooramfenicol (van een 10 mg / ml voorraad oplossing in EtOH) tot een uiteindelijke concentratie van 30 ug / ml, bacteriën sluiten. Dit medium wordt nu aangeduid als PDA chl ^30.
3. Fungal minimaal medium (FMM) wordt gebruikt als een solide basis voor BDM geïnoculeerd met potentiële schimmel plastic afbrekers. Naast de agar (wanneer gebruikt om het medium vast) is koolstofvrije. Tot ongeveer 800 ml gedeïoniseerd _H2O, voeg 6,0 g NaNO _3, 0,52 g KCl, 0,52 g _MgSO4 · 7H2 O, 1,52 g KH _{2PO 4,} en 1 ml Hutner van sporenelementen voorraadoplossing (2,2 g ZnSO ₄ · 7H ₂ O, 1,1 g H ₃ BO _3, 0.5 g _MnCl2 · 4H ₂ O, 0,5 g FeSO ₄ · 7H ₂ O, 0,16 g _CoCl2 · 5H ₂ O, 0,16 g _CUSO4 · 5H ₂ O, 0,11 g _(NH4) 6Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O en 5,0 g Na ₄ EDTA in 100 ml gedestilleerd _H2 O ^{33 , 34.} Breng de pH op 6,5 met NaOH, en breng het volume tot 1 L. Voor de vloeibare bioassay, filter-steriliseren FMM om neerslaan van zouten te voorkomen. Als vast medium wordt gewenst, voeg 16 g agar en autoclaaf. Bij semi-vaste agar is vereist verminderen agar 8 g / L. Na afkoeling tot 50 ° C, voeg chlooramfenicol tot een uiteindelijke concentratie van 30 ug / ml. Dit medium wordt nu aangeduid als FMM chl ^30. Als controle zodat schimmelisolaten groeien dit medium, moet FMM worden made als hierboven, maar met 10 gram glucose per liter. Dit is de zogenaamde glucose minimaal medium ³⁵ (GMM).
4. Fosfaat-gebufferde zoutoplossing ³⁶ (PBS) wordt gebruikt om de bodemdeeltjes en microbiële cellen te schorten in de eerste seriële verdunning van de bodem-blootgestelde BDM. Om PBS, voeg 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na ₂ HPO _4, en 0,24 g KH ₂ PO _4-800 ml gedestilleerd water. Los zouten en pH op 7,4 met HCl. Breng totale volume op 1 L met ultrapuur water. Vul schone cultuur buizen met 9,5 ml en 4,5 ml PBS per tube. Autoclaaf.
5. 30% (v / v) glycerol wordt gebruikt gecryopreserveerd bacteriële en gistcellen, sporen en mycelium te schorten tijdens opslag bij -80 ° C. Maak deze oplossing in ultrapuur water. Autoclaaf.
6. 0,01% (v / v) Triton X-100 wordt gebruikt om schimmelsporen te schorten; het detergens als een niet-toxisch bevochtigingsmiddel hydrofobe sporen. Los 100 pl Triton X-100 In 1 L van ultrapuur water. Autoclaaf.
7. 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,2) wordt gebruikt als oplosmiddel voor glutaaraldehyde fixatie tijdens SEM. Meng 68,4 ml van 1 M Na ₂ HPO ₄ en 31,6 ml van 1 M NaH ₂ PO ₄ en breng totale volume op 1 L met ultrapuur water ^36.

3. Voorbereiding van Bioassay Materials: Oppervlakte Ontsmetten van BDM Films

1. Omdat restanten van verontreinigingen zoals papier en tape op scherpe gebruiksvoorwerpen zijn potentiële koolstof bronnen, gebruikt nieuw-gekochte schaar of verse scheermesjes, en een anorganische ondergrond voor het snijden. Draag handschoenen om besmetting van BDM films met de huid oliën te vermijden. Snijd BDM films in kleine vierkantjes (4.25 x 4.25 cm). Deze omvang plein past in een standaard 100 x 15 mm Petri plaat.
2. Gebruik een kiemdodende UV-lamp (emissie golflengte = 253.7 nm) tot BDM films ontsmetten. Een dergelijke lamp is vaak te vinden in een standaard bioveiligheid kast. Ervoor te zorgen dat wanneerhet UV-licht werkt, is er geen doorstroming van externe lucht in de bioveiligheid kast die kunnen besmetten de BDM films.
3. Natte oppervlakken in de kap met 70% EtOH en laat blower run voor 15 minuten aan de lucht spoelen. Vervolgens sluit de sjerp en ontsmetten van de kap oppervlak met UV gedurende 2 uur.
4. Plaats de BDM films in de gedecontamineerd kap, in rijen. Laat het UV-licht te schijnen op films voor 2 uur.
5. Gebruik een schone, gesteriliseerde tang om de BDM films spiegelen. Begin bij de eerste rij en werk naar de achterste rij naar de tijd dat de handen en armen zijn direct boven de nieuw-gedecontamineerd BDM oppervlakken te minimaliseren. Wanneer flipping BDM, plaatst de nieuw-disinfested kant naar beneden op een schone ruimte worden blootgesteld aan UV-licht, maar niet eerder in contact met de niet-disinfested zijde van de film.
6. Na 2 uur van UV-behandeling aan elke kant, verwijder de BDM films uit de bioveiligheid kast met een steriel pincet, weer aan het werk van voor naar achter om te voorkomen dat het plaatsen van handen en armen over al-decontaminatieneerde films. Plaats de BDM films in steriele, droge, overdekte containers zoals folie bedekte bekers. Bewaar bij kamertemperatuur in het donker.

4. Plaat Bioassay Setup

Voer alle stappen in een steriele overdracht kap met behulp van aseptische techniek.

1. Leg de UV-disinfested BDM stukken op het oppervlak van de agar platen. Stel langs een eerste hoek, en voorzichtig laat de rest van het vierkant rol in contact met de agar. Voorkomen rimpels. Sommige films rimpels tijdens opslag te vormen, dit onvermijdelijk. Bijzonder dunne films kan het gebruik van twee tangen om het stuk te plat vereisen.
2. Plaats kralen van halfvaste FMM chl ³⁰ agar boven op de plastic folie om een water-en voedingsbron voor de eerste kolonisatie van hydrofobe kunststoffen bieden. Beads zijn niet noodzakelijk voor waterdoorlatende films. Opnieuw smelten van de agar in de magnetron, en gebruik een micropipettor tot vier 10 pl druppels gesmolten agar overzetten naar de mulch (een in elke corner). Raak het uiteinde van de pipet direct op de mulch ook zij punctie niet aanraken. Neem niet meer dan 10 ul per druppel, omdat overgewicht op de mulch kan trekken plastic uit de agar oppervlak wanneer platen worden omgekeerd.
3. Laat de platen zitten op de kop met de deksels op 's nachts volledig stollen, en vervolgens op te slaan verzegelde mouwen agar-kant naar boven op 4 C in het donker °. Als u klaar bent om de bioassay (Stap 7) uit te voeren, te gebruiken i) een plaat van FMM chl ³⁰ (negatieve controle), ii) een bioassay plaat met vier 10 pl druppels halfvaste FMM chl ³⁰ op plastic folie, en iii) een plaat van GMM (positieve controle). Zo vier replicaten van elke isolaat per plaat drager worden getest.

5. Vloeibare Bioassay Setup

1. Volg de instructies voor BDM snijden in stap 3.1. Voorafgaand aan het snijden van kunststof folies voor de vloeibare bioassay, kies een formaat dat past in de cultuur buis.Het gebied moet een uniforme massa te bereiken tussen verschillende kunststofsoorten is afhankelijk van de laagdikte. We vonden dat de stukken gelijk aan 0,0175 g goed passen in 15 x 150 mm kweekbuizen.
2. Oppervlakte-ontsmetten films met UV-licht, zoals beschreven in stap 3 hierboven.
3. Voor elk exemplaar van een microbiële isoleren, bereiden drie buizen voor inenting: i) 5 ml FMM met een BDM fragment van de vooraf bepaalde grootte (experimenteel), ii), 5 ml FMM zonder koolstofbron (negatieve controle), en iii) 5 ml GMM (positieve controle). Daarnaast bereiden repliceren buizen FMM die elk te testen BDM, maar ze niet inoculeren. Deze controlebuizen zal geen microbiële groei als gevolg van vervuiling te onthullen.

6. Isolatie van Schimmels

Volgende bodem incubatie en sample verwijderen, zijn schimmels geïsoleerd uit de grond die zich aan de BDM films. Indien gewenst, kunnen bacteriën simultaneously worden geïsoleerd met behulp van dezelfde methode media geschikt voor isolatie van bodembacteriën, zoals 1/10x verdund tryptische soja-gist-agar aangevuld met 50 ug / ml cycloheximide schimmelgroei afschrikken ^37. Wanneer gedefinieerde medium is vereist voor bacteriële isolaties in de stappen 5 en 7, M9 ³⁸ (plus cycloheximide) is een goede keuze.

1. Voorafgaand aan monster verwerking, bereiden PBS en PDA chl ^30. Toestaan ​​PDA chl ³⁰ platen te drogen (unbagged) bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 24 uur om condensatie elimineren de deksels en het agar oppervlak. Pre-label PDA chl ³⁰ platen.
2. Uitgraven mesh zakken met BDM stukken van begraafplaatsen gekozen in stap 1. Schip en bewaar bij 4 ° C niet langer dan 48 uur na het extraheren uit de bodem.
3. Met steriele spatel en tang, bodem verwijdert zachtjes tot kunststof wordt blootgesteld, maar niet borstel uit de bodem, dat is vasthouden aan BDM folieoppervlak. Snijd BDM film in 1 cm2 stuks tot 0,5 g materiaal wordt teruggewonnen voor elk van de vier totaal herhalingen. Overdragen 0,5 g BDM film en bijgevoegde bodem tot 25 ml cultuur buisjes met 9,5 ml PBS. Als de mulch is volledig afgebroken of een bodem-enige controle wordt verwerkt, voeg 0,5 g van de bodem om de PBS, indien mogelijk, te kiezen stukken die nog steeds verkleurd uit de resterende mulch.
4. Vortex de kweek buizen met 9,5 ml PBS en 0,5 g mulch gedurende 30 seconden bij hoge snelheid ultrasone trillingen in een sonificatie waterbad gedurende 10 min en opnieuw vortex gedurende 30 seconden. De agitatie is bedoeld om uiteen te vallen biofilms, cellen ingebed in of het naleven van mulch stukken fysiek te verwijderen, en maak een homogene suspensie.
5. Bereid om serieel de PBS / bodemoplossing verdunnen tot individuele kolonievormende eenheden ontvangen door platings. Voor elk monster, plaats in een laminaire stroming kap ene cultuur buis gevuld met 4,5 ml steriele PBS. Voor elk monster, vul drie putjes van een deep-well plaat met 96 putjes gevuld met 450 ul PBS.
6. De originele plastic / bodem suspensie (0,5 g mulch plus 9,5 ml PBS oplossing) vertegenwoordigt een 5,0 x 10 ^-2 verdunning van microbieel materiaal vast te houden aan het plastic. Voeg 0,5 ml suspensie van deze originele tube naar 4,5 ml steriele PBS in een cultuur buis naar een 5,0 x 10 ^-3 verdunning te verkrijgen. Vortex gedurende 30 seconden op hoge snelheid. Voeg 50 ul tot 450 ul PBS in de 96-well plaat. Herhaal dit voor alle monsters / repliceert. Gebruik een multichannel pipet om monsters massaal verdunnen. Meng elke nieuwe verdunning door en neer te pipetteren tien keer. Wijzig tips tussen verdunningen. Maak verdunningen tot 5,0 x 10 ^-6.
7. (Optioneel) Bacteriële isolaten waren overvloediger dan schimmelisolaten in monsters die hierin beschreven; dus als er gelijktijdig isoleren van bacteriën, dan voeren seriële verdunningen tot 5 x 10 ^-8 in stap 6.6 hierboven.
8. Verdeel 100 pi van elk van de 5,0 x 10 ^-3 via 5,0 x 10 ^-6verdunningen over het agar oppervlak van PDA chl ³⁰ platen met vlam-gesteriliseerde gebogen glazen staven. Store borden rechtop gedurende 30 minuten te laten vloeistof inwerken, daarna verzegelen platen met Parafilm om het ontsnappen van sporen te voorkomen van niet-geïdentificeerde isolaten. Incubeer omgekeerde platen bij 20 C in het donker ° gedurende 5 dagen om zowel snel en langzaam groeiende schimmels kolonies te vormen.

7. Initiële Selectie van Kunststof-afbrekende Schimmels

Belangrijk: Alle kweken vanaf dit moment mag alleen in een bioveiligheid kast (niet een laminaire stroming kap) om verontreiniging van het milieu met sporen van onbekende identiteit voorkomen worden geopend. Sommige bodemschimmels en bacteriën zijn potentiële humane pathogenen.

1. Onderzoeken verdunning platen met goed geïsoleerde kolonies. Selecteer een kolonie die geen andere kolonie is ontroerend.
2. Met behulp van een enkele steriele tandenstoker, zachtjes aanraken van een kolonie en raak vervolgens de agar van FMM (gemaakt in stap 2.3 ), FMM + plastic (gemaakt in stap 4), en GMM (gemaakt in stap 2.3) platen, in die volgorde. Om agar kralen inoculeren boven kunststoffolies, wrijf de tandenstoker voorzichtig op het oppervlak van de agar stip en veeg over de plastic folie. Herhaal de inoculatie van dezelfde bron kolonie tot er vier herhaalde strepen op elke plaat.
3. Herhaal stap 7.1 tot 7.2 tot meerdere herhalingen van elke visueel unieke kolonie type worden geselecteerd uit alle BDM monster.
4. Seal-platen met Parafilm, omkeren, en incubeer bij 20 ° C in het donker gedurende 5 dagen.
5. Identificeer isolaten die groeien op BDM beter dan ze groeien op FMM. Als de groei is niet duidelijk, bekijk het monster onder een dissectie microscoop om kolonisatie of het ontbreken daarvan (figuur 1) controleren. Houd het deksel op, als het deksel heeft condensatie, vervangen door een nieuwe deksel maar doen dat in de bioveiligheid kast.
6. Zodra potentiële BDM afbrekers worden geselecteerd, te gebruiken alsterile tandenstoker om inoculum schrapen uit de schimmel kolonisatie van de kunststof zelf, en de strook voor isolatie van enkele kolonie-vormende-eenheden op PDA chl ³⁰ platen.
7. Seal-platen met Parafilm en incubeer PDA CHL ³⁰ platen geënt met kunststof-degraderende isolaten bij 20 ° C gedurende 5 dagen in het donker.
8. Nu enkele geïsoleerde kolonies worden gezuiverd, zodat zij echt kunnen de kunststoffilms getest koloniseren. Verzamel inoculum (sporen, gistcellen of hyfen) uit een kolonie-vormende eenheid met een steriele tandenstoker. Herhaal stap 7.2 tot 7.5. Na 5 dagen incubatie bij 20 ° C, onderzoekt de bioassay platen voor schimmelgroei. Als het isoleren groeit op een BDM film beter dan groeit op FMM zowel de eerste (7.5) en tweede (7.8) studies sla vervolgens het isoleren zoals beschreven in stap 8.

8. Langdurige opslag van Plastic afbrekers

Algemeen zal plastic-afbrekende isolaten getest in de plaat bioassay (7.5), opnieuw gezuiverd tot enkele geïsoleerde kolonie-vormende eenheden (7,6), die in de plaat weer bioassay (7.8), en tenslotte getest in de vloeibare bioassay ( 9,1-9,5). Bij het onderzoek moeten isolaten elke maand overgebracht naar vers medium en werkvoorraad platen bewaard bij 4 ° C zodra voldoende groei zichtbaar. Isolaten moet worden opgeslagen als glycerol voorraad bij -80 ° C, en / of als gedroogde spore steriele filter disks bij 4 ° C. Beide opslagmethoden worden hieronder beschreven.

1. Voor isoleren ieder die groeide op een BDM film beter dan het groeide op FMM in zowel de eerste (7.5) en tweede (7.8) plaat bioassays, bereiden twee PDA chl ³⁰ platen met twee of drie gesteriliseerd filterpapier schijven, ongeveer 1 cm in diameter op het oppervlak. Inoculeren deze twee platen uitdezelfde kolonie gekozen in stap 7.8 hierboven. Maak een gazon door het verspreiden van entstof gelijkmatig over de agar om de groei te maximaliseren. Seal platen met Parafilm en incubeer bij 20 ° C gedurende 5 dagen. Deze stap kan gelijktijdig worden gestart met stap 7.8 voor efficiëntie.
2. Het filter schijf op het agar oppervlak moet worden bedekt met mycelium / sporen. Verwijder het filter schijven uit de agar oppervlak met gesteriliseerde pincet, en plaats in een steriele Eppendorf buis. Lucht drogen van het filter schijven nachts binnen in de Eppendorf buizen (met de dop) in een bioveiligheid kast of een andere droge, steriele omgeving met minimale luchtbeweging om kruisbesmetting te voorkomen. Verzegel met Parafilm en bewaar bij 4 ° C.
3. Gebruik een steriel wattenstaafje of een tandenstoker te sporen en mycelia oogsten van het gazon platen. Suspendeer sporen en hyfen in 30% glycerol in cryovials, flash-bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.

9. Strenge Confirmation van Plastic Benutting via Liquid Bioassay

1. Genereer verse sporen en / of cellen waarmee vloeibare kweken enten: inoculatie PDA chl ³⁰ platen met sporen van potentiële plastic afbrekende isolaten. Sluit de platen met Parafilm en incubeer bij 20 ° C totdat schimmelsporen zichtbaar.
2. In een bio kast oogst sporen door wassen van de plaat met 0,01% Triton X-100 (5 ml per 15 x 100 mm Petri plaat werkt goed) en schrobben van de sporen (of gistcellen) vanaf het oppervlak met een steriele gebogen glasstaaf . Aspireren spore (of cel) schorsing en brengen in een steriele container.
3. Telling sporen of cellen met een hemacytometer en de passende volume toe te voegen aan 5 ml FMM bouillon gedurende een totaal van 1 x 10 ⁶ sporen / leiding. Het volume moet kleiner zijn dan 10 pl zijn. Verdunning van geconcentreerd sporensuspensies in 0,01% Triton X-100 nodig zijn.
4. In een steriele overdracht kap, enten kweekbuizen opgesteld in Stap 5 met 1 x 10 ⁶ sporen (of gistcellen). Sluit de doppen met Parafilm om eventuele ontsnapping van sporen te voorkomen, met name voor niet-geïdentificeerde isolaten. Incubeer in het donker bij 20 ° C en in acht monsters wekelijks voor groei.
5. Mycelium schimmelgroei op kunststof films kunnen zijn binnen de eerste week na inoculatie, met name bij de randen van de kunststof films. Voor planktonische gist (zoals blijkt uit bewolkt media), kan de groei worden gecontroleerd door optische dichtheid bij 600 nm. Omdat schimmels rechtstreeks kunnen hechten aan de kunststof, kan de groei worden beoordeeld door oog en kan worden bevestigd door lichtmicroscopie en / of scanning elektronenmicroscopie (SEM).
6. In FMM-alleen controles, op zoek naar minuscule witte vlekken die te klein zijn om een ​​verandering in optische dichtheid met behulp van spectrofotometrische methoden registreren. Deze vlekken kunnen worden opgezogen met een Pasteur pipet en geobserveerd met behulp van differentiële interferentie (DIC) microscopie. Vlekken zijn vaak niet identificeerbaar precisiepitate, maar in sommige gevallen kunnen zij klonten van de oorspronkelijke entstof die waren ontkiemd maar niet aanzienlijk toegenomen.
7. Gebruik visuele en microscopische waarnemingen te vergelijken kolonisatie van experimentele monsters en controles, en wijs ratings om de groei op elk monster van BDM film. Omdat veel BDM's zijn donker van kleur en toestaan ​​minimale observatie via microscopie behalve aan de randen, en de laagdikte verbiedt observatie onder een olie-immersie lens, SEM is het nuttig om i te schatten) de aanwezigheid van microbiële groei, bv via het rating systeem in beschreven Tabel 1, en ​​ii) de mate van afbraak BDM.

10. SEM Monstervoorbereiding

1. Gebruik schone, steriele schaar in kleine stukjes van BDM gesneden uit identieke monsters. Fix BDM door onderdompeling in 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,2) gedurende 24-48 uur.
2. Terwijl de fixatie plaatsvindt, dehydrateren pure 100% ethanol door toevoeging van 5-10% volume 3 A moleculaire zeef (geactiveerd in een oven op 175-260 ° C en afgekoeld in een exsiccator), en laat op kamertemperatuur overnacht aan totale dehydratie waarborgen.
3. BDM dompelen in 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,2) gedurende vier wasbeurten van 15 minuten elk.
4. Dompel BDM in ultrapuur water voor drie wasbeurten van elk 5 minuten.
5. Dehydrateer BDM monsters in een ethanol serie wordt ondergedompeld gedurende 20 minuten bij elke concentratie: 50%, 70%, 80%, 90%, 95% en 100%. Spoel BDM tweemaal in 100% ethanol gedurende 20 minuten per spoeling.
6. Onder voorbehoud monsters te kritisch punt drogen en sputter coating.

Resultaten

In een recente studie ^24, vier herhalingen elk van de drie in de handel verkrijgbare BDM label "biologisch afbreekbaar", plus een experimentele film en een conventionele plastic controle werden op de bodem geplaatst als mulch voor de productie van tomaten in het voorjaar van 2010 in Mount Vernon, WA, Knoxville, en Lubbock, TX. In het najaar van 2010 werden BDM film vierkantjes gesneden uit elke verweerde mulch in vier repliceren percelen, en van rechtstreeks werd geboortegrond verwijderd onder het g...

Discussie

De werkwijze hierin beschreven is het een eerste methode voor het isoleren potentiële BDM afbrekers van grond en werd succesvol gebruikt voor het isoleren van schimmels BDM begraven in grond voor zeven maanden. Fungi groeide als reinoculated op verse BDM materiaal van dezelfde aard, wat aangeeft dat de geïsoleerde schimmels colonizers inderdaad, en dat de films niet remmend schimmelgroei. Isolatie van kunststof-afbrekende schimmels en bacteriën kan leiden tot het gebruik ervan, afzonderlijk of in combinatie, voor de wij...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramfenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16216-10	Toxisch
Molecuulzeef	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Minerale zouten voor buffers en media	Fisher	Verschillende	Verschillende leveranciers verkopen deze reagentia