Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

65.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50374

⸱

25 juni 2014

 ,  ,  , 
1Department of Nutrional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes, and Metabolism, University of Wisconsin-Madison, 3School of Pharmacy, University of Waterloo

In dit artikel

Samenvatting

Het testen in vitro β-celfunctie met geïsoleerde eilandjes van Langerhans muis is een belangrijke component in de studie van diabetes pathofysiologie en therapie. Terwijl veel downstream applicaties beschikbaar zijn, dit protocol beschrijft specifiek de meting van intracellulaire cyclische adenosine monofosfaat (cAMP) als een essentiële parameter bepalen van β-cel functie.

Samenvatting

Ongecontroleerde glycemie is een kenmerk van diabetes mellitus en bevordert morbiditeiten zoals neuropathie, nefropathie en retinopathie. Met de toenemende prevalentie van diabetes, zowel immuun-gemedieerde type 1 en obesitas verbonden type 2, studies gericht op het afbakenen van diabetes pathofysiologie en therapeutische mechanismen van essentieel belang zijn. De β-cellen van de pancreatische eilandjes van Langerhans zijn verantwoordelijk voor passende afscheiden insuline in reactie op verhoogde bloedglucoseconcentraties. Naast glucose en andere voedingsstoffen, worden de β-cellen gestimuleerd door specifieke hormonen, genaamd incretines, die worden uitgescheiden uit de darm in reactie op een maaltijd en werken op β-cel receptoren die de productie van intracellulair cyclisch adenosine monofosfaat verhogen ( cAMP). Verminderde β-celfunctie, massa en incretine responsiviteit zijn goed zou bijdragen aan de pathofysiologie van type 2 diabetes, en worden ook steeds gekoppeld with type 1 diabetes. De huidige muis eilandje isolatie en cAMP vastberadenheid protocol kan een hulpmiddel om af te bakenen mechanismen ter bevordering van progressie van de ziekte en therapeutische interventies, met name degenen die worden gemedieerd door de incretin receptoren of verwante receptoren die werken door middel van modulatie van intracellulaire cAMP productie. Terwijl slechts cAMP metingen worden beschreven, beschreven eilandje isolatieprotocol creëert een schone preparaat die ook zorgt voor veel andere stroomafwaartse toepassingen, waaronder glucose gestimuleerde insuline secretie, [3H]-thymidine, eiwitgehalte en mRNA expressie.

Inleiding

De strikte handhaving van euglycemia is noodzakelijk om morbiditeiten zoals neuropathie, nefropathie en retinopathie, die alle kenmerken van de pathologie van ongecontroleerde type 1 en 2 diabetes 1 worden voorkomen. Verminderde β-celfunctie en massa zowel type 1 en 2 diabetes verstoren bloedglucoseconcentraties 2. Dat immuun-gemedieerde type 1 diabetes resultaten van een verwoestende verlies van insulineproducerende β-cellen, verminderde β-cel insulinesecretie en perifere insuline signalering van Type 2 diabetes samen bevorderen hyperglycemie, dyslipidemie en verhoogde hepatische glucoseproductie, wat uiteindelijk resulteert in zowel verlies van β-celmassa en insuline secretoire capaciteit van individuele β-cellen 3. Inzicht in de onderliggende β-cel mechanismen in de progressie van type 1 en 2 diabetes hopelijk leiden tot nieuwe therapieën ter voorkoming en behandeling van deze ziekten.

In vitro tissue cultuur modellen, zoals de INS-1 en MIN6 β-geïmmortaliseerde cellijnen, kunnen nuttige hulpmiddelen voor het begrijpen van specifieke β-celfuncties. De wisselwerking tussen de verschillende celtypes in de eilandjes kunnen zelf regelen β-celfunctie. Bijvoorbeeld, de paracriene invloed van glucagon (vrijgemaakt uit α-cellen) en somatostatine (vrijgemaakt uit δ-cellen) in stijgende en dalende insuline secretie, respectievelijk, toont het belang van cel-cel in de nabijheid endocriene respons 4. Bovendien gap junctions tussen β-cellen versterken de afgifte van insuline 5. En hoewel vooruitgang geboekt bij het ​​genereren insulinoma lijnen die beter gerepliceerd de fysiologische respons van geïsoleerde eilandjes tot glucose (bijvoorbeeld de INS-1-afgeleide 832/13 en 832/3 cellijnen), de glucose response verschilt nog van normale rat eilandjes 6,7. Bovendien is de respons van deze klonale cellijnen insulinomaglucagon-achtige peptide-1 (GLP-1) agonisten drastisch verschillen van elkaar, en van normale eilandjes 6. Daarom kan geïmmortaliseerde cellijnen vertegenwoordigen de beste model voor het testen van middelen die invloed op cAMP-productie.

In tegenstelling tot de-insulinoom afgeleide cellijnen, het bestuderen van β-cel functie uitsluitend in gehele dierlijke modellen heeft zijn eigen set van complicaties. Een van de grootste uitdagingen bij het werken met endocriene weefsel meet de precieze concentratie hormoon vrijgegeven. Specifiek, de lever speelt een belangrijke rol metaboliseren insuline en de alvleesklier bloedstroom gaat rechtstreeks naar de lever. Zo kan een plasma insuline meting niet nauwkeurig beeld van de hoeveelheden insuline wordt uitgescheiden door de alvleesklier zelf of de impact van verschillende behandelingen op de snelheid van de insuline secretie 8. Bovendien kan niermetabolisme van glucagon de betrouwbaarheid van glucagon productie beperken van eilandje α-cellen 9. Daarom is het isoleren van primaire muis eilandjes voor in vitro experimenten geeft een duidelijker inzicht in hoe het eilandje reageert op specifieke stimuli om metingen in vivo te vullen.

Het huidige protocol voor de isolatie van de muis eilandjes is een gevestigde protocol dat wordt gebruikt door een aantal groepen (met lichte wijzigingen die kunnen helpen om succes te vergroten) 10,11. Bovendien is de bepaling van cAMP-productie maakt een directe aflezing van de incretine responsiviteit van de β-cellen. Samen met cAMP meet, eiwitgehalte en insuline secretie kan worden gekwantificeerd uit hetzelfde cAMP monstervoorbereiding, om te bepalen of een defect in β-celfunctie ligt proximaal of distaal van cAMP 10. Het uiteindelijke cAMP gehalte en insuline secretie toepassing in dit protocol kan een zeer krachtig instrument voor het begrijpen van de invloed van de farmaceutische en voedingsbestanddelen, onder andere zijns op cAMP en insuline secretie. Naast het stimuleren van glucose alleen, kunnen andere verbindingen worden gebruikt om veranderingen in cAMP en insuline secretie 10,11 meten.

Tot slot, hoewel insuline is de primaire hormoon we assay van geïsoleerde eilandjes, andere hormonen, zoals glucagon en somatostatine, maar ook cytokinen, eicosanoïden, en cyclisch adenosine monofosfaat, kan ook worden gemeten, hetzij door een tijdelijke stimulatie test of kwantificatie van hun niveau in kweekmedium 12. Tot slot, hoewel buiten de reikwijdte van dit manuscript, eilandje isolatie met de beschreven collagenase isolatiemethode maakt eilandje conservering zodat vele verdere toepassingen kan worden uitgeoefend, zoals eilandjeoverplanting, RNA isolatie kwantitatieve real time PCR en microarray analyses, eiwit isolatie voor Western blotting, eilandje inbedding en immunofluorescentie imaging en [3H]-thymidine opname als een maat eilandje cellen replikation, waarvan sommige zijn beschreven in eerdere artikelen Jupiter 13-16. Over het algemeen, als gevolg van de in het protocol beschreven eilandje isolatie procedure kan een onderzoeker met belangrijke en nuttige informatie voor het ontwikkelen van therapieën en bevorderen van drug discovery gericht op verbetering van β-cel functie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende instanties. Het protocol gedemonstreerd werd uitgevoerd onder leiding en goedkeuring van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Wisconsin-Madison.

1. Voorbereiding van Solutions

  1. De methode van euthanasie in dit protocol is verbloeding onder Avertin verdoving (voor een overzicht van alternatieven, zie Discussie). Om Avertin, voeg 0,625 g (1.25% of 44,2 mmol) 2-2-2 tribroomethanol 1,25 ml 2-methyl-2-butanol in een 15 ml conische buis en warmte bij 37 ° C gedurende 20-30 minuten. Vortex de oplossing op hoog voor 10-15 seconden in een tijd om volledig te ontbinden de 2-2-2 tribroomethanol. Eenmaal volledig is opgelost, voeg de oplossing 48,75 ml dubbel gedestilleerd H 2 O, filteren door een 0,45 urn filter in een nieuwe 50 ml conische buis, wikkel de 50 ml conischeal buis in aluminiumfolie en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal een maand. Breng de buis RT vóór het injecteren van muizen.
  2. Om Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) maken, make-up 1 L 1x HBSS uit een 10x voorraad (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) met tweemaal gedestilleerd H 2 O, voeg 0,35 g (4,2 mm) Nacho 3, en op te slaan bij 4 ° C gedurende 1 maand. Voor elke muis wordt 105 ml van deze oplossing (5-10 ml plus extra voor pipetteerfout) vereist voor eilandje isolatie.
  3. Eilandjes zijn zeer gevoelig voor hypoxische schade; daarom wordt HBSS geborreld 95% O 2/5% CO 2 om de concentraties van O2 nabootsen in het bloed. Speciale gasmengsels kunnen worden gekocht en een bruisende station opgezet met een Pasteur pipet gehecht aan flexibele slang. Na borrelen de vereiste hoeveelheid HBSS met 95% O 2/5% CO2 gedurende 15 minuten, voeg 0,02% RIA-graad BSA (runderserumalbumine) volume en houdt op ijs de remainder van het eilandje isolatie.
  4. Voor de Ficoll voorbereiding, Weeg 32,5 g Ficoll in een bekerglas van 400 ml, voeg 80 ml HBSS, en roer bij 500-700 rpm gedurende 30 minuten. Eenmaal opgelost, giet de Ficoll oplossing in een 250 ml maatcilinder en voeg HBSS het merk 130 ml op de maatcilinder tot een 25% Ficoll oplossing. Bedek de bovenkant van de maatcilinder met twee porties van Parafilm ® M (Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago, IL) en schud krachtig meerdere malen.
  5. Voor een 23%, 20,5% en 11% Ficoll-oplossing, voeg 27,6, 24,6, en 13,2 ml 25% Ficoll, respectievelijk 50 ml conische buizen. Vervolgens breng elke oplossing tot een totaal van 30 ml met HBSS en goed schudden om te mengen. Alle vier Ficoll oplossingen moeten worden bewaard bij 4 ° C en goed tot 2 weken.
  6. Collagenase oplossing die geschikt is voor het isoleren van actieve eilandjes bereid uit collagenase geïsoleerd uit Clostridium histolyticum (Materialen tabel). Elke partij dient te worden getest enzymefficiëntie. Typisch wordt collagenase gebruikt 0,3-0,5 mg per ml HBSS. Gebruik makend enzym concentraties in dat bereik (meestal 3 verschillende concentraties), bepalen de kwaliteit en kwantiteit van geïsoleerde eilandjes van vergelijkbare leeftijd muizen of nestgenoten om de werking enzymconcentratie stellen.
  7. Zodra de juiste concentratie wordt bepaald, elke muis vereist 35 ml collagenase in HBSS voor het gehele isolatieprotocol. Schud de collagenase in HBSS te ontbinden. Onmiddellijk voorafgaand aan de operatie, pre-laad een spuit 5 ml met collagenase oplossing, plaats de canule op en verwijder luchtbellen, en laat op ijs totdat het nodig is.
  8. Het eilandje voedingsbodems voor O / N incubatie is een aangevuld RPMI 1640 media. Voor de voorraadoplossing ontbinden een RPMI 1640 pakket (Gibco, New York) in 1 liter tweemaal gedestilleerd H2O en voeg 1,19 g HEPES (5 mM) en 2 g nacho 3 (24 mM). Breng de pH op 7,4,filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C in het donker.
  9. Voor aangevuld medium, voeg 10% FBS en 100 IE/100 ug / ml penicilline / streptomycine, respectievelijk de voorraad RPMI 1640 media. Als een ander glucoseconcentratie gewenst, kan glucose vrij RPMI 1640 medium worden gebruikt en een specifiek glucoseconcentratie worden toegevoegd.
  10. Voor een voorraad Krebs Ringer bicarbonaatbuffer (Krebs), voeg de volgende ingrediënten om gedestilleerd water bij de volgende concentraties verdubbelen: NaCl (118,41 mM), KCl (4.69 mM), MgSO4 (1,18 mM), KH 2 PO 4 (1,18 mM ), nacho 3 (25 mM), HEPES (5 mM) en CaCl2 (2,52 mM) bij pH 7,4. CaCl2 wordt als laatste toegevoegd en deze oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.
  11. Een werkvoorraad van Krebs, eerste gas met 95% O 2/182 5% CO2 gedurende 10-15 minuten met een Pasteur pipet bij 37 ° C gevolgd door de toevoeging van 0,5% BSA RIA klasse makendoor volume. Vervolgens wordt glucose toegevoegd om de gewenste concentratie van de in vitro test.

2. Voorbereiding van gereedschap

  1. Iets stomp de uiteinden van 30 - en 27-G naalden met behulp van een slijpsteen de scherpe punt af te ronden. Zet een 45 graden bocht in de naald ongeveer een kwart van een centimeter van de punt met behulp van een tang. Wees voorzichtig niet te hard knijpen, die zal afsluiten van de inwendige diameter van de naald.
  2. Snijd de 3/0 zijden hechtdraad in ongeveer 4 inch lengte, een voor elke muis.
  3. Bedek de dissectiemicroscoop basis met plasticfolie en band naar beneden.
  4. Knip verschillende stukken van absorberend papier bank, ongeveer 3 x 5 inch groot, tenminste 2 per muis.

3. Voorbereiden van de muis

  1. Vul een 1 ml spuit met 1 ml Avertin.
  2. Injecteer de oplossing Avertin intraperitoneaal ongeveer 40 ul / g lichaamsgewicht.
  3. Na de muis geen longer reageert op de staart of achterpoot wringt, zorgvuldig over te dragen aan de dissectiemicroscoop werkplek.
  4. Met de muis in rugligging en haar hoofd naar distaal, spuit de muis met 70% waterige ethanol. Zorg ervoor dat een voldoende hoeveelheid 70% ethanol om de hoeveelheid bont de blootgestelde borstholte beperken.

4. Openen van de borstholte

  1. Knijp de vacht en de huid van de muis tussen de twee achterpoten en maken een eerste snede door de epidermis, dermis en de onderliggende membraan.
  2. Terwijl knijpen de huid en het onderliggende membraan gesneden naar voren ledemaat aan beide zijden van de muis zorg vermijden snijdend interne organen.
  3. Vouw de huid en het membraan flap over de ribbenkast en verwijder de zwaardvormig proces om gemakkelijker toegang tot de pancreas voor de inflatie toe te staan.
  4. Heroriënteren van de muis met het hoofd naar proximaal en bewegen de inwendige organen naar de rechterkant van het werk statie aan de dalende aorta onthullen.
  5. Tenzij bloed weefsel wordt verkregen, kan de aorta descendens worden gesneden euthanization voltooien. Geniet van de overtollige bloed met bank papier of een Kimwipe voor gemakkelijkere toegang tot de galbuis.

5. Opblazen van de alvleesklier

  1. Met een dissectiemicroscoop, de positie van de dunne darm, zodat de galbuis vormt een loodrechte lijn met het hoofd van de muis.
  2. Neem een ​​pincet en pak de dunne darm en vind de sfincter van Oddi (Sfincter van ampulla) aan het eind van de galwegen, die splays uit op de dunne darm van de galwegen, de vorming van een witte driehoek op de roze darm. Zodra de sfincter van Oddi is gevestigd, neem een ​​# 5 Dumont tang en schuif de tip onder de galbuis zo dicht mogelijk bij de dunne darm mogelijk, zorg dat het kanaal niet te doorboren.
  3. Na piercing door de dunne darm en het bindweefsel, gebruikt u detip van de Dumont tang om de hechting te begrijpen en trek deze onder de galbuis. Bind de galbuis zo dicht mogelijk bij de sfincter van Oddi mogelijk, zorg ervoor dat de knoop is strak om lekkage te voorkomen.
  4. Pak beide uiteinden van de hechtdraad en trek naar de staart om wat spanning op de galbuis zetten. Met behulp van een vrije hand, maken een kleine incisie met de micro schaar in de galweg net boven de laatste vertakking in de lever. Opmerking: Het is belangrijk niet te dicht bij de sfincter van Oddi snijden omdat dit kan leiden tot een gedeeltelijk opblazen van de alvleesklier en zaag door de galbuis deze zal resulteren in een slechte inflatie.
  5. Terwijl de twee uiteinden van de string met de galweg strak, verwijder de spuit / canule die is voorgeladen met 5 ml collagenase oplossing uit de ijsemmer, vastgelegd de spuit en plaats de afgestompte 30 G naald in de cut galwegen, dat evenwel niet tot het doorprikken van de wall van het kanaal. Als de 30 G-naald is niet breed genoeg voor de galwegen om een ​​afdichting rond, verwijderen en te vervangen door de afgestompte 27 G naald.
  6. Houd de naald op zijn plaats, laat de hechtdraad en pak de spuit 5 ml. Duw langzaam op de zuiger van de spuit. Opmerking: Als de naald is met succes in de galweg geplaatst, zal het uit te breiden.
  7. Blijf de zuiger langzaam en afsteken in een pulserende mode ingedrukt tot het eerste deel van de alvleesklier wordt opgeblazen, gevolgd door zachte constante druk totdat de alvleesklier niet meer opgeblazen. Opmerking: De meeste pancreases houd 3-5 ml voordat u begint te lekken. Ook zal een succesvolle inflatie gelijkmatige verdeling van exocriene weefsel en het deel van de alvleesklier bovenop de maag wordt opgeblazen.
  8. Haal de naald uit de galweg en zet aan de kant.

6. Pancreas Removal

  1. Neem een ​​tang in de ene hand en een gebogen schaar inde andere. Met behulp van de tang, pakt de dunne darm bij de sluitspier van Oddi. Met gesloten schaar, gebruik de tip om apart deel van de alvleesklier van de dunne darm.
  2. Spreid de schaar uit elkaar om de kloof tussen de dunne darm en de alvleesklier te verbreden.
  3. Plaats de "V" van de schaar waar de dunne darm en alvleesklier aan elkaar te bevestigen aan de rechterkant van het gat zojuist gemaakt. Behulp van de tang trek de dunne darm langs de schaar om de alvleesklier te verwijderen.
  4. Blijf werken beneden de dunne darm om de roze bindweefsel. Op dit punt, pak de dunne darm in de buurt waar hij hecht aan de maag en knip de alvleesklier weg van de rest van de dunne darm. Opmerking: Let op dat de alvleesklier niet om snip als het kan beginnen te laten leeglopen.
  5. Voorzichtig grijpen het deel van de alvleesklier aan de maag met een pincet (platte tang werken het beste). Trek voorzichtig omhoog op de alvleesklier, gebruik maken van de curved schaar weg te knippen op de verbindingen tussen de alvleesklier en de maag.
  6. Zoek de milt en houd het met de tang boven de alvleesklier. Neem de gebogen schaar en knip de verbindingen tussen de milt en de alvleesklier.
  7. Vind wanneer de alvleesklier om de dikke darm is gehecht. Pak de dikke darm met een pincet en met de punt van de schaar door te porren. Spreid de schaar uit elkaar voordat een spleet tussen de dikke darm en alvleesklier genereren.
  8. Houd de dikke darm met een tang: dit zal resulteren in de pancreas wegvallen, bloot de precieze verbindingen met de dikke darm. Knip de overige verbindingen weg.
  9. Vind de roze bindweefsel aan de pancreas en de dunne darm en snij zo dicht mogelijk bij de alvleesklier mogelijk. Opmerking: Als het doorboren van de alvleesklier is een punt van zorg, is het aangeraden om te snijden dichter bij de dunne darm als het bindweefsel uit worden gefilterd in latere stappen.
  10. Grab zoveel mogelijk van de alvleesklier mogelijk en til het voorzichtig. Met gebogen schaar, knip de resterende verbindingen tussen de alvleesklier en de borstholte aan de pancreas volledig te verwijderen. Opmerking: De alvleesklier moet nog worden opgeblazen indien correct verwijderd.
  11. Bewaar de verwijderde alvleesklier in ~ 2,5 ml collagenase oplossing in een 50 ml conische buis op ijs tot alle andere pancreases zijn opgeblazen en verwijderd voor het experiment.

7. Wassen

  1. Neem alle geïsoleerd pancreases en verplaats ze naar 50 ml conische buizen te scheiden die elk 25 ml verse collagenaseoplossing
  2. Plaats de 50 ml conische buizen rechtop in een 37 ° C schudwaterbad staat oscillerende op 220-250 rpm, met de shaker uitgeschakeld.
  3. Gas telkens 50 ml conische buis met 95% O 2/5% CO2 gedurende 5 minuten met een Pasteur pipet.
  4. Recapituleren elke buis strak en plaats zijwaarts in het schudden waterbad onder de oppervlakte van het water. Schudden bij 220-250 rpm gedurende 20 sec om de minuut, tot 16 min vanaf min. 6. (Shake op 6, 8, 10, 12, 14, en 16 min)
  5. Onmiddellijk overdracht van de buizen een centrifuge bij kamertemperatuur gedurende een snelle rotatie. Breng de centrifuge tot 1500 rpm (400-500 g) en onmiddellijk uitschakelen.
  6. Met behulp van een vacuüm val, zuig ongeveer 22,5 ml van de collagenase oplossing zonder de pellet te verstoren. Wassen met 10 ml HBSS en vortex voorzichtig te breken van de pellet.
  7. Maak een andere snelle rotatie bij kamertemperatuur tot 1500 rpm (400-500 g).
  8. Zuig ongeveer 10 ml van de oplossing, opnieuw zonder de pellet te verstoren.
  9. Wassen met nog eens 10 ml ijskoud HBSS en vortex voorzichtig opnieuw breken van de pellet. Herhaal de snelle rotatie en zuig 10 ml van de oplossing.
  10. Voorzichtig geschud pellet in de resterende 2,5 ml HBSS oplossing. Giet oplossing dooreen 1000 um mesh in een nieuwe 50 ml conische buis. Dit zal de grote weefselafval niet verteerd door de collagenase te verwijderen.
  11. Spoel de oude 50 ml conische buis met 2,5 ml ijskoude HBSS. Met een Pasteur pipet om de zijkanten van de buis naspoelen Alvorens de 2,5 ml HBSS door de mazen in de nieuwe 50 ml conische buis.
  12. Voer een andere snelle draai bij kamertemperatuur bij 1500 rpm (400-500 g) om het weefsel pellet.
  13. Zuig alle HBSS door het kantelen van de buis in de richting van het vacuüm val. Opmerking: Het is zeer belangrijk om de pellet niet verstoord omdat dit zal resulteren in het verlies van eilandjes. Als de pellet los zit of begint te bewegen in de richting van het vacuüm val, stop opzuigen van de oplossing en opnieuw pellet het weefsel en vervolgens doorgaan met de resterende oplossing te zuigen.
  14. Wanneer alle HBSS is verwijderd, voeg 4,8 ml 25% Ficoll-oplossing en vortex te breken van de pellet.
  15. Layer voorzichtig 2,4 ml van 23% Ficoll-oplossing bovenop de 25% Ficoll-oplossing door toevoeging van 23% Ficoll-oplossing aan de zijkant van de 50 ml conische buis. Om ervoor te zorgen zelfs gelaagdheid, draait u de 50 ml conische buis bij het toevoegen van de Ficoll oplossing.
  16. Herhaal de gelaagdheid proces voor 20,5% en vervolgens 11% Ficoll oplossingen. Opmerking: Als 4 verschillende lagen niet aanwezig zijn, voeg HBSS tot de streep van 50 ml en draai de buis 4-6 keer of totdat de Ficoll gradiënt bestaat niet meer. Re-pellet het weefsel en probeer het opnieuw stappen 7,14-7,16.
  17. Draai de 50 ml conische buis bij kamertemperatuur bij 1820 rpm (800 g) gedurende 15 minuten.
  18. Giet alle Ficoll in een frisse 50 ml conische buis, zorg ervoor dat de pellet van exocriene weefsel achter. Voeg ijskoud HBSS tot de 50 ml markering en draai de buis 4-6 keer om de Ficoll en HBSS door elkaar.
  19. Draai de 50 ml conische buis bij kamertemperatuur bij 1820 rpm (800 g) gedurende 5 minuten.
  20. Aspireren zorgvuldig meeste HBSS / Ficoll mengsel met een stofzuiger trap. Laat de pellet niet storen als het is los en kan gemakkelijk worden opgezogen.
  21. Neem een ​​Pasteur pipet en breng de pellet om een ​​wegwerp cultuur buis.

8. Picking Eilandjes

  1. Voeg 5 ml van het oppakken media (dwz. Aangevuld RPMI 1640 of Krebs Ringer bicarbonaatbuffer) aan de wegwerp cultuur buis. Opmerking: Het plukken van de media is afhankelijk van verdere toepassingen.
  2. Laat de eilandjes naar de bodem van de kweek buis 5 minuten. Overbrengen met behulp van een Pasteur pipet om een ​​15 mm bij 60 mm polystyreen petrischaal. Opmerking: Het is belangrijk om een ​​petrischaal als deze niet behandeld en voorkomen dat de eilandjes van los van de schaal.
  3. In een afzonderlijke 15 mm bij 60 mm polystyreen petrischaal, voeg 5 ml muis eilandje cultuurmedia (100 ml RPMI 1640 De media, 10 ml hitte geïnactiveerd FBS, 1 ml Pen / Strep, filter gesteriliseerd).
  4. Met de hulp van een dissectiemicroscoop met backlight vermogen, gebruik maken van een P-20 pipet om de eilandjes te halen in de petrischaal met eilandje cultuur media, zorg om te vermijden acinair weefsel puin. Bij tegenlicht, zal eilandjes verschijnen bruin-goud en hun buitenste membraan kan glinsteren, terwijl acinair weefsel licht grijs en saai zal verschijnen. Als het eilandje preparaat bevat een grote hoeveelheid vuil, is het raadzaam om de hand plukken eilandjes tweemaal in vers medium. Het verminderen van afval vervuiling zal eilandje klonteren beperken na een nacht incubatie. Het toevoegen van DNAse (3000 U / ml) om de spijsvertering buffer kan ook helpen om eilandje klonteren (JWJ, persoonlijke observatie) te beperken. Opmerking: Het is belangrijk om het aantal eilandjes geïsoleerd plannen voor downstream experimenten tellen.
  5. Incubeer de eilandjes O / N in een incubator ingesteld op 37 ° C met 5% CO2.

9. CAMP Assay

  1. Label 1,7 ml microcentrifuge buizen, een voor elke herhaling van de test. Opmerking: cAMP assays ten minste du hebbenplicates voor elke behandelingsgroep, maar meer herhalingen per behandeling de voorkeur.
  2. Nadat de gasvorming Krebs Ringer bicarbonaatbuffer gedurende 15 minuten met 95% O 2/5% CO 2 bij het ​​Pasteur pipet 0,5% BSA RIA-graad en een uiteindelijke glucoseconcentratie van 1,7 mM (voorincubatie-oplossing). Voeg vervolgens 1 ml van de vers vergaste Krebs aan elke microfugebuis. Twee ml Krebs vereist per buis de voorincubatie en behandeling tijdstippen; Het is echter raadzaam om ten minste 5-10 ml bereiden extra.
  3. Zwenk de eilandjes naar het midden van de petrischaal en met een P-20 pipet hand plukken de eilandjes in nieuw 15 mm bij 60 mm polystyreen petrischaal met 5 ml van de voorincubatie oplossing van het glucose bevattende kweekmedium wassen van de eilandjes.
  4. De cAMP-assay kit is de GE Healthcare cAMP Direct BioTrak EIA. Is dit protocol gebruikt is een modificatie van die beschreven voor "Intracellulaire cAMP measurement met behulp van de niet-acetylering MER-procedure met de roman lysis reagentia, "en is geoptimaliseerd voor gebruik met het minimum aantal eilandjes per buis, waardoor een verhoogd aantal van de behandeling voorwaarden en technische herhalingen. Met behulp van een P-20 pipet, overdracht ten minste 13 eilandjes in elke buis uit stap 9.2, behoud eilandje grootte consistentie tussen de buizen, met 1 ml pre-incubatie buffer. Opmerking: Het verhogen van het aantal herhalingen is voordeliger dan het aantal eilandjes per buis. Echter, als er genoeg eilandjes om het aantal eilandjes per buis gelijkmatig verhogen, is het raadzaam om dit te doen, tot 25-50 eilandjes per buis.
  5. Met de microcentrifugebuis cap open overbrengen naar een 37 ° C incubator ingesteld op 5% CO2 en incubeer gedurende 45 minuten om de insuline secretie van eilandjes normaliseren naar het basisniveau.
  6. Terwijl de monsters incuberen, bereid de behandelingen (bijvoorbeeld 8 mM, 11,1 mM, 16,7 mM glucose, enz.) in de vergaste Krebs frOM stap 9.2. in 15 ml conische buizen, met 1 ml extra om eventuele pipetteerfout. Voeg 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) tot een eindconcentratie van 200 uM. IBMX is een algemene fosfodiësterase remmer blokkeert de afbraak van cAMP, waardoor cAMP te accumuleren in de cel wordt geproduceerd. (Let op:.. Dit is een echte cAMP productie assay Zie de discussie sectie voor meer informatie wanneer het meten van cAMP productie niet wenselijk kan zijn Als IBMX wordt weggelaten uit de test, zal meer eilandjes per buis nodig om cAMP gegevens in het verkrijgen lineaire gebied van de standaardcurve).
  7. Na de 45 minuten pre-incubatie, verwijder de microfugebuizen uit de incubator, cap en pulse-vortex elk monster (minder dan 0,5 sec). Dit mengen van de insuline gradiënt die waarschijnlijk zijn is gegenereerd door de eilandjes geconcentreerd op de bodem van de buis. Zorg moet worden genomen te hard niet te worden geschud, omdat dit een negatieve invloed zouden kunnen hebben het eilandje stabiliteit (Opmerking: Cappedbuizen met eilandjes kunnen voorzichtig worden aangetikt of omgekeerd indien het niet mogelijk om vortex puls zachtjes. Deze opties zullen tijd toevoegen aan de test, die moeten worden overwogen bij de planning van het experiment).
  8. Transfer elke buis een tafelblad centrifuge (RT) en draai totdat de eilandjes bereiken 10.000 rpm (7,000-7500 g) en daarna onmiddellijk uit.
  9. Gebruik een pipet P-1000 de meeste Krebs elke microcentrifugebuis verwijderen, waardoor ongeveer 10-15 ul van Krebs op het eilandje pellet. Gebruik een P-20 pipet om het gedeelte dichtst het eilandje pellet te verwijderen. Als pellet wordt verstoord, pipet de Krebs terug in de buis en re-spin.
    (Opmerking: als de onderzoeker vindt het te moeilijk om alle Krebs van het eilandje pellet te verwijderen zonder te verstoren, kan de laatste 10-15 ul worden gelaten op en verantwoord in het totale volume later in het protocol.
  10. Verkrijg een voldoende hoeveelheid vloeibare stikstof in een geïsoleerde container snap bevriezen de monsters na incubatie.
  11. Neem de monsters uit de incubator, cap, vortex snel (minder dan 0,5 sec) spin de microfugebuizen in een tafelblad centrifuge (RT) tot 10.000 rpm (7,000-7500 g), en schakelt daarna onmiddellijk af. Als insuline of andere metaboliet is een gewenste stroomafwaartse toepassing, gebruik P-1000 pipet een hoeveelheid medium te verzamelen in een microfugebuis en bewaar bij -20 ° C tot verdere analyse. Als stimulatie materiaal niet verzameld, kan worden weggegooid.
    (Opmerking: IBMX is een sterke potentiator van glucose gestimuleerde insuline secretie (GSIS) Daarom GSIS resultaten verkregen uit cAMP stimulatie medium kan niet nauwkeurig de werkelijke effect van specifieke behandelingen op GSIS vertegenwoordigen, vooral als deze effecten zijn subtiel.).
  12. Herhaal stap 9.9 om zo veel stimulatie medium te verwijderen als mogelijk zonder verstoring van het eilandje pellet. Snap stilstaand eilandje pellet in vloeibare stikstof zodra er minder dan 10-15 gl Krebs links op het eilandje pellet. Zodra allemonsters zijn snap bevroren, bewaar bij -80 ° C tot cAMP meting.
  13. Op de dag van cAMP vastberadenheid, bereiden de roman lysis reagens volgens protocol van de fabrikant. Voeg 200 ml lysisreagens 1B aan elke microfugebuis en vortex op topsnelheid gedurende 30 sec. Laat de buizen zitten op ijs gedurende 10 min, vortexen elke 2 min gedurende 30 sec. (Opmerking: Het protocol raadt het uitvoeren van een microscopische analyse met trypanblauw om cellysis te garanderen, maar dit is niet voor eilandjes uitgevoerd).
  14. Bereid de arbeidsnormen en het opzetten van de MER microplaat precies zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Na het enzymsubstraat wordt geïncubeerd met de microplaat gedurende 30 minuten voeren de optionele 1,0 M zwavelzuur stap en bepaal de extinctie van de putjes microplaat bij 450 nm met behulp van een microplaat lezer.
  15. Cyclisch AMP resultaten zullen worden geboekt als fmol / well. Dit moet worden genormaliseerd naar het totale volume van het oorspronkelijke monster (200 pl + eventueleresterende Krebs links op de eilandjes uit stap 9.9). Vervolgens resultaten kunnen ofwel worden genormaliseerd naar het totale aantal eilandjes, waardoor cAMP fmol / eilandje of lysaat monsters kunnen worden onderworpen aan bicinchoninezuur (BCA) eiwitbepaling om de resultaten te normaliseren totale cellulaire eiwit (geven fmol / ug eiwit) . Het laatste wordt aanbevolen wanneer eilandje maten zijn inconsistent tussen de monsters, en kan een surrogaat voor eilandje grootte. De Pierce BCA eiwitassaykit is gebruikt met succes in dit protocol, en vereist slechts 25 ml monster. De BSA normen moeten worden opgesteld in lysisreagens 1B van de cAMP testkit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om een ​​hoge eilandje opbrengst in isolatie te garanderen, moet chirurgische technieken beschreven in het protocol nauwlettend worden gevolgd. Hoewel de hier gepresenteerde technieken worden aangepast aan elk laboratorium, zijn er enkele belangrijke stappen die leiden tot een succesvolle isolatie. Om de galbuis bereikbaar te maken, wordt aanbevolen dat de organen worden verplaatst naar de rechterkant van de muis (Figuur 1). Bovendien zal dit mogelijk de alvleesklier om opblazen met een kleinere hoeveel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Met de prevalentie van diabetes naar verwachting invloed hebben op 7,7% van de wereldbevolking, de eis van nieuwe onderzoekstechnieken is het noodzakelijk om zowel te begrijpen en te behandelen diabetes 18. De huidige eilandje isolatie is een gevestigde protocol dat wordt gebruikt voor in vitro experimenten en is al eerder gepresenteerd met lichte wijzigingen 11,14,16. Hoewel insuline secretie is een veel voorkomende downstream applicatie voor geïsoleerde eilandjes, met de nadruk op upstre...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen graag Renee L. Pasker en Harpreet K. Brar bedanken voor deskundige technische bijstand aan de in dit werk beschreven protocollen. Verder willen we de begeleiding van Christopher B. Newgard erkennen aan de Duke University en Alan D. Attie aan de Universiteit van Wisconsin-Madison, samen met de steun van hun laboratorium leden, wat ons toeliet de tijd en ondersteuning nodig om het optimaliseren van de beschreven protocollen. In het bijzonder danken wij Hans Hohmeier, Danhong Lu, en Helena Winfield in de Newgard Laboratorium en Mary Rabaglia in de Attie Laboratorium voor productieve discussies en advies. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie ​​DK080845 en Juvenile Diabetes 594
Research Foundation subsidie ​​17-2011-608 (MEK)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Collagenase van Clostridium histolyticum geschikt voor het isoleren van actieve eilandjesSigma-AldrichC7657
Ficoll 400Sigma-AldrichF9378
Hanks Balanced Salt Solution 10XInvitrogen (Gibco)14065-056
HEPESSigma-AldrichH3375
RPMI 1640 (poeder)Invitrogen (Gibco)31800-022
Albumine uit runderserum (BSA)Sigma-AldrichA7888
3/0 Zijde SutuurdraadFine Science Tools18020-30
Dumont #5 PincetFine Science Tools11251-10
0.8 mm Pincet  Fine Science Tools11050-10
Gebogen SchaartjeFine Science Tools14061-10
Vannas-Tübingen Spring Schaartje - Recht/Scherp/8.5 cm/5 mm SnijrandFine Science Tools15003-08
Dissectie SchaartjeFine Science Tools14002-14
5 ml BD Luer-Lok SpuitBD309646
1 ml BD spuitBD309628
30 G BD Naald 1/2" LengteBD305106
27 G BD Naald 1/2" LengteBD305109
SlijpsteenFine Science Tools29008-01
2-2-2-tribromoethanolSigma-AldrichT48402-25G
2-methyl-2-butanolSigma-Aldrich240486-100mL
Natriumchloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888
KaliumchlorideSigma-AldrichP3911
Monokaliumfosfaat (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662
Natriumbicarbonaat (NaCHO3)Sigma-AldrichS6014
CaCl2·2H2OSigma-AldrichC3881
MgSO4·7H2OSigma-AldrichM9397
Penicilline-StreptomycineInvitrogen (Gibco)15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS)Fisher ScientificSH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Sigma-Aldrich5879-100MG

Referenties

  1. Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
  2. Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
  3. Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
  4. Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
  5. Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
  6. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  7. Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
  8. Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
  9. Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
  10. Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
  11. Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
  12. Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
  13. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
  15. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
  16. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
  17. Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
  18. Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  19. Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
  20. Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
  21. Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
  22. Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
  23. Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
  24. Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
  25. Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
  26. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van muis eilandjesenzymimmuunassaycollagenase digestiedichtheidsgradi ntcentrifugatiekweekmedium voor eilandjesglucose gestimuleerde insulinesecretiewildtype muizengene knockout muizen
Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.