Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Transcriptomic Analyse van de Mens Retina Chirurgische Specimens gebruiken Journal

7.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50375

⸱

14 augustus 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1U968, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2UMR S 968, Université Pierre et Marie Curie, 3UMR 7210, Centre National de la Recherche Scientifique, 4Départment d'Ophtalmologie, Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux

In dit artikel

Samenvatting

We gebruikten het netvlies monsters uit retinectomy voor een transcriptoom analyse netvliesloslating. We ontwikkelden een procedure die RNA conservering tussen de chirurgische blokken en het laboratorium maakt. We een gestandaardiseerd protocol voor RNA zuivering door cesiumchloride ultracentrifugatie te verzekeren dat de gezuiverde RNA's zijn geschikt voor microarray analyse.

Samenvatting

Netvliesloslating (RD) beschrijft een scheiding van de neurosensorische netvlies van de retinale pigment epitheel (RPE). De RPE is essentieel voor normale functie van de lichtgevoelige neuronen, fotoreceptoren. Loslating van het netvlies van het RPE leidt tot een fysieke spleet die is gevuld met de extracellulaire vloeistof. RD initieert cellulaire en moleculaire bijwerkingen die zowel de neurosensorische netvlies en de RPE sinds de fysiologische uitwisseling van ionen en metabolieten is ernstig verstoord beïnvloeden. De gevolgen voor visie van de duur van de onthechting omdat een snelle reapposition van de twee weefsels leidt tot het herstel van het gezichtsvermogen 1. De behandeling van RD is uitsluitend chirurgische. Verwijdering van glasvocht (vitrectomie) wordt gevolgd door de verwijdering niet essentiële deel van het netvlies in het vrijstaande gebied netvliesloslating begunstigen. De verwijderde retinale exemplaren zijn res nullius (niets) en dus normaal weggegooid.Om RNA te herstellen van deze chirurgische specimens, wij de procedure Journal dat RNA behoud mogelijk maakt tijdens de overdracht van de chirurgische blok naar het laboratorium ontwikkeld. Ook een gestandaardiseerd protocol voor RNA zuivering door cesiumchloride ultracentrifugatie te verzekeren dat de gezuiverde RNA's zijn geschikt voor globale genexpressie analyse. De kwaliteit van RNA werd gevalideerd door zowel RT-PCR en microarray-analyse. Analyse van de gegevens blijkt een gelijktijdige betrokkenheid van ontsteking en fotoreceptor degeneratie tijdens RD.

Inleiding

Het belangrijkste therapeutische doel in netvliesloslating (RD) is een manier om fotoreceptorcel retinale schade en ontsteking als gevolg van de scheiding van de fotoreceptoren van de retinale gepigmenteerde epitheelcellen beperkt zijn. Tijdens RD, zijn RPE cellen geactiveerd, migreren, differentiëren, en vermenigvuldigen op het oppervlak van de vrijstaande netvlies, het uitoefenen van contractiele krachten die leiden tot complicaties. Transcriptomics analyse van RD is een manier om doel genen te identificeren met gewijzigde expressie na RD en dus toekomstige therapeutische moleculen die uiteindelijke visuele resultaat in combinatie met chirurgie zou kunnen verbeteren. Het is bekend ribonucleïnezuur (RNA) niet stabiel zijn desoxyribonucleïnezuur (DNA), welke laatste veel gebruikt voor genetische studies, de stabiliteit had sequentiebepaling van het genoom van Neanderthaler paleontologische monsters van meer dan 30.000 jaar 2 toegelaten. Transcriptie van DNA van de genen van het genoom in messenger RNA is debelangrijke proces genexpressie en de mRNA labiel is om een ​​signaal vormen. RNAs zeer snel afgebroken door RNAse enzymen die het signaal beëindigen. Wanneer weefsels worden geïsoleerd uit een organisme, de RNAs vaak afgebroken voordat de expressie onderzocht in een onderzoekslaboratorium. Gedegradeerde RNA is niet geschikt voor analyse genexpressie. Omdat het laboratorium personeel niet kan deelnemen aan de operatie, we een procedure die is gemakkelijk ontwikkeld en vereist alleen dat de chirurg naar de weefsels te herstellen in een geschikte RNAse-vrije oplossing. Het RNA van de weefsels is stabiel en kan worden geanalyseerd zonder enig teken van afbraak na 72 uur bij kamertemperatuur in deze oplossing. De RNA's van specimens worden gezuiverd door middel van een gestandaardiseerde methode waarbij een ultracentrifuge op een cesiumchloridegradiënt na te zijn overgebracht naar het laboratorium 3. Vervolgens wordt de kwaliteit van het RNA bepaald door agarose gelelektroforese en RT-PCR. Het RNA zuivering protocol heeft devoordeel van het scheiden van de moleculen op dichtheid die verschillend is voor DNA en RNA en verzekert dat de RNA niet door een DNA-moleculen die kunstmatig signalen in genexpressie studies zullen genereren verontreinigd. Bovendien worden de overdracht RNA (tRNA), die kwantitatief zijn de meest voorkomende RNA in een cel, gescheiden naar dezelfde fysieke eigenschap van het ribosomaal RNA (rRNA) en boodschapper RNAs (mRNAs) die laatste twee namelijk de eindproduct van het zuiveringsproces. De verwijdering van tRNA van het preparaat bruikbaar omdat de meeste microarray analyse protocollen bij het ​​gebruik van omgekeerde transcriptasen en RNA polymerasen die worden geremd door tRNA 4-6. Het gezuiverde RNA van chirurgische specimens worden gemerkt met een standaardprotocol en gehybridiseerd met een microarray chip en de resultaten worden geanalyseerd met twee complementaire methoden, de valse ontdekking thode en met een nieuwe methode van wederzijdse informatie en visualisatiezed op het web-based server Retinobase 7,8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Dagboek: Procedure voor de Monsters herstellen van de Surgical Block

In het laboratorium

  1. Krijgen een invoer contract van uitdrukkelijke rederij.
  2. Vul 10 (of 25) scheepvaart vormen met het postadres van het laboratorium met vermelding van de contactpersoon in het laboratorium (telefoonnummer en e-mailadres).
  3. Bereid 10 (of 25) monsters vormen genummerd 1 tot 10 (of 25). Deze vormen zijn toegewijde ruimten te informeren over a) anonieme identificatie van de patiënt, b) de datum van de operatie en c) eventuele aanvullende opmerkingen van de chirurg zou willen toevoegen. Bereid 10 (of 25) gewatteerde enveloppen (150 x 210 mm).
  4. Bereid met RNAse-vrij reagentia 25 (of 65) ml van 6 M guanidine chloride in diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld H 2 O (GHCL).
  5. Vullen 10 of 25 genummerde 5 ml steriele polyethyleen ronde bodem buizen met 2,4 ml GHCL oplossing.
  6. Gebruikt argon gas om het bovenste gedeelte van deze buizen te vullen, dan drukt u op tightly op de dop om de oxidatie van de GHCL oplossing over enkele jaren van opslag in de chirurgische kast te voorkomen.
  7. Introduceer elke 5 ml buizen in een ml steriele polypropyleen conische bodem buis 50 met schroefdop. Gebruik een stuk schoon papier weefsel om de ml buisje 5 houdt in de 50 ml buis, sluit de buis.
  8. Plaats de 50 ml buisjes op een polystyreen rek en de rek in een kartonnen doos met de gewatteerde enveloppen, de scheepvaart vormen, de monsters vormen.
  9. Plak de instructies (zie: 1,12-1,19) binnenkant van het deksel van de doos om hun lezen te vergemakkelijken.
  10. Stuur de kartonnen doos per mail aan de contactpersoon in het ziekenhuis.

In het ziekenhuis

  1. Breng de doos van de kast aan de chirurgische operatiekamer. Let op Let op: indien de procedure betrekt een immuun gecompromitteerde patiënt, het karton mag niet worden naar de operatiekamer gebracht.
  2. Tijdens de operatie, plaatst de retinale preparaten gebruikennl in genummerde 5 ml steriel polypropyleen gevuld met GHCL oplossing. Sluit stevig de buis.
  3. Terug de buis kort.
  4. Plaats de buis op het bloed buis rocker gedurende 10 minuten.
  5. Vul het bijgevoegde monster genummerde formulier.
  6. Meld het identificatienummer op de overeenkomstige genummerde 50 ml buis.
  7. Introduceer de ml buis 5 met de chirurgische specimen in de 50 ml buis, vervangt papieren tissue en schroef de buis.
  8. Introduceer de buis en de gevulde monster vorm in het in een van de begeleidende gewatteerde enveloppen. Sluit het.
  9. Bel de uitdrukkelijke rederij te halen.

2. RNA Purification

In het laboratorium

  1. Homogeniseren het specimen in zijn 5 ml tube polypropyleen met GHCL oplossing met een homogenisator voor 1 min tijdens het verplaatsen van de buis op en neer.
  2. Voeg 270 ul van 2 M kaliumacetaat pH 5,0. Schud krachtig gedurende 10 min door het plaatsen van de buis op een shaker in zijnhorizontale positie (420 min -1).
  3. Centrifugeer 10 minuten bij 5000 rpm (6.500 xg) bij 20 ° C.
  4. Aspireren vlot de oplosbare fractie zonder de pellet te verstoren.
  5. Te zetten in een 14 ml steriel buisje.
  6. Voeg 5,3 ml van 100 mM Tris pH 8,0, N-lauroylsarcosine 1%.
  7. Voeg 3,2 g cesium chloride (CsCl) en meng de buis door vortexen.
  8. Voeg 1,8 ml CsCl / ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) in een steriele 11 ml centrifugebuis polyallomer.
  9. Met ml steriele Pasteur pipet 10, dragen de RNA-oplossing op 1,8 ml CsCl / EDTA door schuiven langzaam aan de rand van de buis te voorkomen dat de dichtheid kussen verstoren.
  10. Plaats de buizen (een tweede buis die de buffers zonder retina indien nodig) in de rotor.
  11. Centrifugeer 24 uur bij 32.000 rpm (225.000 x g) bij 20 ° C.
  12. Verwijder het bovenste deel van de oplossing met een steriele Pasteur pipet, en gooi deze weg.
  13. Verwijder geleidelijk terwijl het controleren van demoment dat het DNA (viskeuze) wordt opgezogen met een tweede steriele Pasteur pipet, en gooi deze weg.
  14. Verwijder de resterende oplossing het verzorgen van de RNA-pellet niet vrij te geven met een derde steriele Pasteur pipet.
  15. Gedeelte de bodem van de buis met een scalpel vlam gesteriliseerd, vervolgens de rest van de buis het ondersteboven op een steriele blik.
  16. Keer de buis en spoel subtiel met 160 ul van GHCL.
  17. Laat het pellet 10 minuten drogen.
  18. Resuspendeer de pellet in 150 ui (10 mM Tris pH 7,5-1 mM EDTA - 0,1% SDS).
  19. Over in een 2 ml steriele microcentrifugebuis, halen er de resterende pellet met 30 ui (10 mM Tris pH 7,5-1 mM EDTA - 0,1% SDS).
  20. Voeg 150 ui (10 mM Tris pH 7,5-1 mM EDTA).
  21. Voeg 30 pl 3 M natriumacetaat pH 5,0, vortex de buis.
  22. Voeg 900 ul 100% ethanol (-20 ° C), vortex de buis.
  23. Plaats de buis 30 min in smeltend ijs.
  24. Centrifuge het buisje 30 minuten bij 15.000 rpm bij 4 ° C.
  25. Aspireren fijntjes de oplosbare fractie, en gooi deze weg.
  26. Voeg 500 ul 70% ethanol (RT), vortex de buis.
  27. Centrifugeer het buisje 20 minuten bij 15.000 rpm (18.000 x g) bij 4 ° C.
  28. Herhaal de spoelstap (70% ethanol).
  29. Centrifugeer kort elimineren van de resterende ethanol met een P200 pipet.
  30. Laat de pellet drogen aan de lucht gedurende 10 minuten.
  31. Resuspendeer de pellet in 50 pl DEPC-behandeld H2O
  32. Meng krachtig door vortexen.
  33. Incubeer 15 min bij 45 ° C in een waterbad.

3. RNA-analyse door gelelektroforese

  1. Voor een agarosegel in een chemische afzuigkap.
  2. In een steriele 1,5 ml microcentrifuge buis, voeg 2 pl RNA te analyseren en 6,4 pl monster prep buffer.
  3. In een tweede ml tube 1.5, voeg 3 ul van RNA normen en 9,6 pi van het monster prep buffer.
  4. Verwarm de buizen 15 minuten bij 65 ° C, Leg ze op ijs.
  5. Voeg 1 ui ethidiumbromide (EB) loading buffer zonder kleurstof in de RNA-monster buis en 1 pl EB ladingsbuffer met kleurstof in de RNA-normen buis.
  6. Voer de gel onder 80-100 V In een chemische kap loopbuffer, totdat een van de kleurstoffen (broomfenolblauw) heeft van 2/3 van de bodem van de gel.
  7. Spoel de gel twee keer 15 minuten met 250 ml de DEPC behandelde 2x SSC.
  8. Neem een ​​gedigitaliseerde afbeelding onder UV-belichting.
  9. Bereken de verhouding tussen de bovenste band (23S rRNA) en de onderste band (16S rRNA).

4. Definitieve Zuivering van het RNA

  1. Het volume van het RNA monster 100 ui met DEPC behandeld H 2 O (indien nodig).
  2. Voeg 100 ul van zure fenol (1 ml fenol verzadigd met DEPC behandeld H 2 O + 130 ui 50 mM natriumacetaat, pH 5,2), vortex krachtig.
  3. Centrifugeer de 10 min bij 13.000 rpm (15.000 xg) bij kamertemperatuur.
  4. Recover zorgvuldig en breng de waterfase (bovenste fase) in een roman een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis.
  5. Voeg 10 pl 3 M natriumacetaat, pH 5,2 en 250 pl 100% ethanol (-20 ° C).
  6. Incubeer het buisje 30 minuten in smeltend ijs.
  7. Centrifugeer het buisje 30 minuten bij 14.000 rpm (18.000 x g) bij 4 ° C.
  8. Verstuif zorgvuldig de oplosbare fractie, en gooi deze weg.
  9. Voeg 500 ul van 70% ethanol (kamertemperatuur), en vortex de buis.
  10. Centrifugeer het buisje 20 minuten bij 14.000 rpm (18.000 x g) bij 4 ° C.
  11. Herhaal de spoelstap (70% ethanol).
  12. Centrifugeer kort elimineren van de resterende ethanol met een P200 pipet.
  13. Laat lucht droog de pellet gedurende 10 minuten.
  14. Resuspendeer de pellet in 50 pl DEPC-behandeld H2O
  15. Incubeer dan buis 15 min bij 45 ° C.
  16. Meet de absorptie (Abs) bij 260 nm en 280 nm op 2 ui van het RNA-monster. Berekende de verhouding Abs260/Abs280.
  17. Store de RNA-monster bij -80 ° C (stabiel gedurende meerdere jaren).

5. Oplossingen en Schoonmaakprocedures

  1. 2 M kaliumacetaat, pH 5,0: Los 19,6 g kaliumacetaat in 70 ml met DEPC behandeld H2O Reinig de pH-meter probe door onderdompeling deze in met 1M NaOH gedurende 15 min, gevolgd door 5 spoelingen met DEPC behandeld H2O Op pH 5,0 met azijnzuur dan het volume op 100 ml met DEPC behandeld H2O
  2. Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, N-lauroylsarcosine 1%: Los 2 g N-lauroylsarcosine (onder een kap) in 40 ml 0,5 M Tris-base pH 8,0. Stel het volume op 200 ml met DEPC behandeld H2O) CsCl / EDTA: 96 g CsCl in 50 ml 10 mM EDTA pH 7,5 bereid met DEPC behandeld H2O Autoclaaf en volume op 100 ml met DEPC behandeld H2O Controleer pH <7,5.
  3. Agarose gel 1%: Doe 1 g agarose in 62 ml DEPC-behandeld H2O Kook in een magnetron. Voeg 18 ml van 12,3 Mformaldehyde, 20 ml 5x MOPS. Giet in een chemische kap.
  4. Sample prep Buffer: Om voorbereid geïmproviseerde zijn. Meng in een chemische kap 8 pl 5x MOPS, 16 gl 12,3 M formaldehyde en 40 pl formamide.
  5. EB laadbuffer (zonder kleurstof): Om voorbereid geïmproviseerde zijn. Voeg 4 pi 10 mg / ml ethidiumbromide in 20 ui 80% glycerol bereid met DEPC behandeld H2O
  6. EB laadbuffer (met kleurstof): Om voorbereid geïmproviseerde zijn. Voeg 2 pi 10 mg / ml ethidiumbromide in 10 ui 80% glycerol bevattende 0,25% houtweefsel cyanol, 0.25% broomfenolblauw met DEPC behandeld H2O
  7. Lopende buffer: Tot 60 ml 5x MOPS, voeg 54 ml van 12,3 M formaldehyde en 186 ml DEPC behandeld H 2 O.
  8. DEPC behandeld H2O: Incubeer gedestilleerd water met 0,1% v / v diethylpyrocarbonaat gedurende 2 uur bij 37 ° C onder roeren. Steriliseren in autoclaaf.
  9. Reinigen homogenisator Voeg 25 ml reinigingsoplossing (RBS) naar 1 L met DEPCbehandeld H 2 O, en dompel de as 1 min. onder roeren. Incubeer 2 uur bij 60 ° C. Grondig met DEPC behandeld H 2 O Wikkel het instrument in aluminium en in de doos instrument. Wikkel de doos. Steriliseren in autoclaaf.
  10. Het reinigen van de elektroforese-inrichting: Was het apparaat, de lade en de 15-wells comb. Incubeer 15 min bij 3% waterstofperoxide. Eenmaal spoelen met 100% ethanol. Lucht drogen.
  11. Het reinigen van de glazen schalen: Reinig de glazen schalen RBS 2% al de nacht, dan spoelen met gedistilleerd water voordat sterilisatie bij 200 ° C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De procedure Journal (figuur 1) biedt ons specimens van retina herstellen van de chirurgische blok gezuiverd RNA, en het transcriptoom van netvliesloslating analyseren. Netvliesloslating resulteert in de verhoogde expressie van de monocyt chemotactische MCP1 gen CCL2, en de afname in expressie van de staaf fotoreceptor transduceren gen GNAT1, korte golf kegel opsin OPN1SW en de homeogene CRX (figuur 2). De inductie van CCL2 resulteert een ont...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De ontwikkeling van een procedure voor weefsel herstel van de chirurgische blok essentieel voor het transcriptoom van netvliesloslating geweest. Men moet opmerken dat dit type van chirurgie wordt beoefend in nood en dat de oogartsen operationele hebben weinig tijd om deel te nemen in een biologisch onderzoeksprogramma wanneer zij opereren. Dit retinectomy wordt ook stochastisch uitgevoerd in elke dienst, zodat het eenvoudiger manier om statistische cijfers te bereiken is om te werken met een netwerk. In dergelijk netwer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Sacha Reichman en Dominique Santiard-Baron voor hun hulp bij het bewerken van de RNA-zuivering protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CentrifugeBeckman CoulterAventi J-E
RotorBeckman CoulterJS-5.3
UltracentrifugeBeckman CoulterLE 80K
RotorBeckman CoulterSW41
Power supplyBioradPac 3000
PolytronTMKinematicaPT 2100Geleeverd met PT-DA 2105:2
Agarose gel elektroforese apparaatBioradMiniGel Cell GT
BeeldvormingssysteemBioradGelDoc-It Imager
5 ml steriele polyethyleenbuisGreiner115261
Steriele polyallomeer centrifugebuisBeckman Coulter331372
Chemische reagentiaSigmaMoleculaire biologie kwaliteit (RNase en DNase vrije producten)
ReinigingsoplossingVWRRBS
Microarray chipAffymetrixHuman U133 plus 2 array

Referenties

  1. Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678(2010).
  2. Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328 (5979), 710(2010).
  3. Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry. 13 (12), 2633(1974).
  4. Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663(1990).
  5. Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315(1975).
  6. Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261(1981).
  7. Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6 (12), e28791(2011).
  8. Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208(2008).
  9. Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425(2007).
  10. Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16(2010).
  11. Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74(2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

NetvliesloslatingRNA-zuiveringcesiumchloride-ultracentrifugatieJournal Proceduremenselijke netvliesmonstersontstekingsmarkersfotoreceptordegeneratiegenexpressieanalysegelelektroforese
Transcriptomic Analyse van de Mens Retina Chirurgische Specimens gebruiken Journal
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.