Toepassing van een<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Protection Assay om stress Mediation Eigenschappen van de Dps Protein Visualiseer

Samenvatting

De DNA-bindend eiwit van uitgehongerde cellen (DPS) speelt een cruciale rol in de strijd tegen bacteriële stress. Dit artikel bespreekt de zuivering van E. coli Dps en het protocol voor een In vitro Assay tonen Dps-gemedieerde bescherming van DNA tegen afbraak door reactieve zuurstof species.

Samenvatting

Oxidatieve stress is een onvermijdelijk bijproduct van aërobe leven. Moleculaire zuurstof is essentieel voor aardse stofwisseling, maar het neemt ook deel aan vele schadelijke reacties in levende organismen. De combinatie van aërobe metabolisme en ijzer, dat een essentieel samenstelling voor het leven, is voldoende om radicalen door Fenton chemie en degraderen cellulaire componenten. DNA-degradatie is misschien wel de meest schadelijke proces waarbij intracellulaire radicalen, zoals DNA-reparatie is verre van triviaal. De bepaling in dit artikel een kwantitatieve methode om het effect van moleculen en enzymen op radicaal-bemiddelde DNA beschadiging gemeten en gevisualiseerd.

De bescherming assay DNA is een eenvoudige, snelle en krachtige instrument voor de in vitro karakterisering van de beschermende eigenschappen van eiwitten of chemicaliën. Het DNA bestaat uit de blootstelling aan een schadelijke oxidatieve reactie en variërende concentraties van de verbinding van belang te voegen. De verlaging of verhoging van DNA schade als functie van verbindingconcentratie wordt gevisualiseerd middels gelelektroforese. In dit artikel tonen we de techniek van het DNA bescherming assay door het meten van de beschermende eigenschappen van het DNA-bindende eiwit van gedepriveerde cellen (Dps). Dps is een mini-ferritine die wordt gebruikt door meer dan 300 bacteriële soorten krachtig tegen milieu-invloeden. Hier presenteren we de Dps zuiveringsprotocol en de geoptimaliseerde testomstandigheden voor de evaluatie van bescherming DNA door Dps.

Inleiding

Aërobe organismen dient steeds kampen met reactieve zuurstof species op hun DNA en andere belangrijke biologische macromoleculen kunnen beschadigen. Een krachtig middel om de toxische effecten van oxidatieve schade tegen het DNA-bindend eiwit van gedepriveerde cellen (Dps). Sinds zijn ontdekking in 1992 van uitgehongerde E. coli cultuur ¹ is Dps geïdentificeerd in meer dan 300 soorten bacteriën en archaebacteriën ^2. Massive opregulatie van Dps tijdens stationaire fase maakt het de meest sterk uitgedrukt nucleoid-geassocieerd eiwit van E. coli onder hongersnood voorwaarden ^{3, 4.} Daarnaast heeft Dps is aangetoond dat zowel bacteriële levensvatbaarheid en DNA-integriteit tijdens de vele verschillende spanningen, waaronder honger, hoge ijzerconcentratie, blootstelling aan UV licht, warmte shock, en oxidatieve stress ^{5, 6} te bewaren.

Structureel, Dps self-vennoten in een stabiele homo-oligomere complex van 12 monomeren, which assembleren in een bolvormige holle schelp. De ~ 4,5 nm gehele inwendige holte is toegankelijk voor het uitwendige oplosmiddel via poriën die de passage van kleine moleculen ⁷ mogelijk en kan gemineraliseerde metalen zoals ijzer ⁸ sekwestreren. Het beschermende effect van Dps komt uit zijn verscheidene biochemische activiteiten, die niet-specifiek DNA-binding ^1, ferroxidase activiteit en ijzeropslageiwit ⁸ omvatten.

Gedetailleerde studie van de gunstige biochemische activiteiten van Dps eerste vereist de zuivering ervan. Dps zuivering is een uitgebreide procedure zoals Dps niet alleen van andere eiwitten worden gescheiden, maar ook elk gebonden DNA ^7. Onze geoptimaliseerde zuivering gebruikt veel voorkomende technieken, bestaande uit twee ionenuitwisselingskolommen en een ammoniumsulfaatprecipitatie stap. Verschillende buffer uitwisselingen zijn nodig, zoals sterk geconcentreerd Dps kan neerslaan uit de oplossing in zoutarm omstandigheden. Zodra Dps eiwit is gezuiverdHet kan worden toegepast op assays die zijn ferroxidase activiteit ^8, DNA-bindingsstoichiometrie ⁹ en mechanismen van ijzerbindend ¹⁰ direct te meten. Gezuiverde Dps heeft ook andere mogelijke toepassingen. De stabiele holle sferische structuur van Dps is gebruikt als steigers voor opslag hydrofobe deeltjes in het eiwit holte ¹¹ en zelfs als een reactiekamer om nieuwe magnetische nanodeeltjes synthetiseren ^12.

Het beschermende vermogen van Dps om schade als gevolg van reactieve zuurstofradicalen bemiddelen kan duidelijk zijn en rechtstreeks aangetoond met behulp van de DNA-protectie-analyse ^{13, 14.} In deze in vitro-procedure, worden radicalen geproduceerd wanneer ijzer katalyseert H ₂ O ₂ degradatie via Fenton chemie. Deze radicalen direct aanwezig DNA schade in de reactie en kan volledig degraderen bij hoge concentraties. Twee belangrijke Dps activiteiten kunnen zowel direct tegengaan van de effecten van Fenton-gemedieerde radicalen. Dps verlaagt de concentratie van katalytisch ijzer door mineralisatie, verbruiken de beschikbare waterstof-peroxide in het proces. Daarnaast Dps binden aan DNA kan mogelijk fysiek afschermen van radicale schade en condenseert het in een kleiner volume met minder reactief oppervlak. De combinatie van deze twee eigenschappen maakt de DNA protectie-analyse geschikt voor het meten beschermende Dps activiteit.

De bescherming assay DNA is zeer veelzijdig en kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen buiten Dps karakterisatie. Radicalen is een veel voorkomende vorm van stress in cellen en vele verschillende eiwitten en chemicaliën worden gebruikt om het tegen. Het algemene principe van de assay, met behulp van DNA integriteit als een marker voor radicalen, kunnen worden gebruikt in combinatie met vrijwel elk radicaal-producerende reactie of tegengaan middel. Onder andere is de test met succes gebruikt om anti-oxidatieve eigenschappen te bepalenvan K. paniculata extract voor gebruik in de voedingsindustrie ^15, om de effecten van urinezuur karakteriseren op hydroxyl schade bemiddeling ^16, en nieuwe inzichten in de functie van Fur transcriptionele regulator eiwitten ^17.

Ondanks de talrijke toepassingen van de assay in gepubliceerde artikelen, vonden we dat optimalisatietechnieken en probleemoplossingsstappen nodig waren, waardoor het opzetten van de test voor het eerst onnodig tijdrovend proces voor veel onderzoekers. Het protocol presenteren we in dit artikel is bedoeld om deze barrière voor vermelding te verwijderen.

Protocol

1. Dps Expressie en zuivering

Het verkrijgen van eiwit van hoge zuiverheid is een essentiële eerste stap voor de DNA-protectie-analyse. Zuivering van Dps eiwit kan worden uitgevoerd in 4-5 dagen.

1. Transformeren van een protease-deficiënte stam van E. coli (zoals BL21 (DE3) pLysS) met pET vector (bijvoorbeeld pET17) waarin de Dps eiwit coderende sequentie gekloond.
2. Strook de getransformeerde cellen uit op Luria Broth (LB) agarplaten die geschikte antibiotica (zoals ampicilline en chlooramfenicol de voorbeelden in 1.1). Incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 ° C.
3. Inoculeren een enkele kolonie van de plaat in 30 ml LB-medium met de juiste antibiotica. Incubeer overnacht bij 37 ° C onder schudden bij 200-250 rpm.
4. Inoculeren 2 x 1 L LB-medium met geschikte antibiotica met elk van de overnacht cultuur 10 ml. Groeien bij 37 ° C onder schudden tot OD ₆₀₀ van ongeveer 0.6. (Groeiende cellen hogere OD toeneemt eiwitopbrengst, zonder merkbaar doen aan de zuiverheid van het eindproduct.) Induceren van expressie Dps door toevoeging van IPTG tot een concentratie van 0,3 mM, en incubeer bij 37 ° C gedurende 3-4 uur onder schudden.
5. Oogst cellen door centrifugeren bij 6000 xg gedurende 15 minuten. Resuspendeer de celpellets in 7,5 ml DEAE buffer A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) per L van geïnduceerde celkweek. Monsters kunnen worden bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C, indien gewenst. De procedure kan vervolgens ontdooien van de monsters in een waterbad worden voortgezet bij 4 ° C.
6. Voeg een mengsel van proteaseremmers (zoals Calbiochem set III proteaseremmers op 0.167 gl per ml celsuspensie) aan de celsuspensie afbraak van overexpressie Dps voorkomen.
7. Bereid cel-vrij extract met behulp van een Franse pers. Prime de Franse pers met 20 ml DEAE Buffer A (bij gebruik van een continue-flow-model), dan verstoringent het monster tweemaal bij 20 kpsi. Centrifugeer het lysaat bij 30.000 xg gedurende 35 min bij 4 ° C tot onoplosbare deeltjes te verduidelijken, en sla het supernatant. De supernatant kan vervolgens worden bevroren met vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C, indien gewenst.
8. Equilibreer een ml DEAE Sepharosekolom 30 CL-6B met DEAE Buffer A, met behulp van een FPLC. Voer buffer door de kolom 1-2 ml / min met een maximale druk van 0,2 MPa over achtergrond. Laad het celvrije extract op de kolom, en beginnen de doorstroming als de OD ₂₈₀ signaal begint te stijgen boven de basislijn verzamelen. Was de kolom met DEAE Buffer A totdat de OD ₂₈₀ waarde keert terug naar de uitgangswaarde, terwijl het continu verzamelen van de doorstroming. De doorstroom dient de meerderheid van de Dps eiwit, vrij van gebonden DNA bevatten. Was de kolom met 100% buffer B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M NaCl, 0,1 mM EDTA). Dit eluaat bevat Dps-DNA complexen en andere eiwitten en kunnen worden weggegooid.
9. Verwijder advertentiebijkomende verontreinigende proteïnen door ammoniumsulfaatprecipitatie. Bepaal de hoeveelheid samengevoegde doorstroom. Langzaam (over een periode van 10-20 min) droog add small-grain ammoniumsulfaat tot 62% verzadiging (390 mg per ml oplossing) bij 4 ° C onder goed roeren. Roer het mengsel gedurende nog eens 20-30 minuten na toevoeging van het laatste gedeelte van ammoniumsulfaat tot volledig evenwicht te waarborgen. Dps zal oplosbaar blijven, terwijl verontreinigende eiwitten zullen neerslaan uit de oplossing.
10. Verwijder geprecipiteerde eiwitten door centrifugeren bij 20.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en bewaar het supernatant.
11. Voeg langzaam een ​​extra 227 mg ammoniumsulfaat per ml supernatant aan 94% verzadiging te bereiken en roeren gedurende 20-30 min om volledige evenwicht te waarborgen. Dps precipitaten in deze hoge zoutconcentratie en bij 20.000 g gedurende 30 min kan worden verzameld door centrifugatie bij 4 ° C. Dps zal in het pellet, de supernatans worden verwijderd. De pellet kan worden opgeslagen bij -80 ° C indien desired.
12. Resuspendeer de Dps-bevattende pellet in Resuspension Buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Pas het monstervolume tot 2,5 ml.
13. Bufferuitwisseling het ammoniumsulfaat te verwijderen met behulp van een PD-10 gelfiltratie kolom. Equilibreer de gel bed met 25 ml hersuspensiebuffer. Breng 2,5 ml van het monster Dps aan de top van de kolom PD-10 en laat het genieten inch Gooi de doorstroom. Verzamel Dps door elutie met 3,5 ml hersuspensiebuffer.
14. Centrifugeer de buffer uitgewisselde monster bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om eventuele onoplosbare componenten te verwijderen, en verdunnen met 6-10 ml verdunningsbuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 0,1 mM EDTA), zodat de zoutconcentratie voldoende lage Dps bindt aan de SP Sepharose kolom. Bijzonder geconcentreerde monsters van Dps kan minder oplosbaar bij verdunning in een lagere zout buffer, zoals blijkt uit de vloeistof troebel worden, maar kan volledig opnieuw opgelost door toevoeging van een kleine Amount van 5 M NaCl-oplossing (extra 10-20 mM).
15. Een evenwicht ml SP Sepharose Fast Flow kolom 30 met SP buffer A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Voer buffer door de kolom 1,5-2 ml / min met een druk van 0,3 MPa grens over achtergrond. Laad het monster in de kolom. Wassen met SP Buffer A totdat de OD ₂₈₀ spoor terug naar de basislijn, en gooi de doorstroming. Voer een 150 ml lineaire gradiënt van 0 tot 100% buffer B, terwijl het verzamelen van fracties van 2 ml. Dps zal elueren in een scherpe piek bij ongeveer 50% B, hoewel variatie door 10% mogelijk is.
16. Voer de elutiefracties op een 15% SDS-PAGE gel, en controleer op verontreiniging van DNA door het meten van de OD ₂₆₀ / OD ₂₈₀ verhouding met behulp van een spectrofotometer. De gel moet dan alleen nog een band rond 19 kDa, en de OD ₂₆₀ / OD ₂₈₀ is meestal rond de 0.7. Zwembad de zuiverste Dps fracties. Gebruik een centrifugale filtereenheid (zoals Amicon Ultrafiltratie Unit) met een10K moleculair gewicht cut-off naar de Dps concentreren en ruilen het in een opslag buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl). Aliquot de gezuiverde Dps, en vries in vloeibare stikstof voor opslag bij -80 ° C.

2. DNA Protection Assay

De bepaling omvat verschillende tijdgevoelige stappen en worden afgestemd op de tweede reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Veel ingrediënten en pipetteerstappen betrokken, dus pipetteren tabel (zie tabel 1) is het raadzaam volgen stappen en volumes houden. De totale tijd die de test is niet meer dan 3 uur.

1. Meet 30 ml water in een luchtdichte flacon, spoel het water met _N2 gedurende 10 min (met twee injectienaalden, een in de vloeistof, een boven) om zuurstof uit de oplossing te verwijderen. Voeg 0,0168 g FeSO ₄ • 7H ₂ O om het water naar een 2 mM voorraad oplossing te verkrijgen. Sluit de flacon en spoelen met stikstof gedurende 5 minuten meer, dan meng. De oplossing moetduidelijk, als een zweem van geel detecteerbaar is, bereiden een nieuw ijzeren oplossing.
2. Maak een 100 mm H ₂ O _2-oplossing (10.87 pi 9.2MH ₂ O ₂ in 1 ml water); houden op ijs en afgeschermd van licht door het wikkelen in aluminiumfolie. Alleen te gebruiken voor ongeveer 1-2 uur na de bereiding te wijten aan spontane verval. De waterstofperoxide stock is eveneens onderworpen aan afbraak, die deels kan worden verminderd door droging (in het donker bij 4 ° C). Regelmatige controles van de voorraad concentratie door het meten van de OD ₂₄₀ worden aanbevolen.
3. Dooi een hoeveelheid van gezuiverd Dps snel in een kamer-temperatuur waterbad, en blijf op ijs. Centrifugeer gedurende 10 sec bij 4000 xg in een tafelblad picocentrifuge neer te slaan aggregaten. Meet concentratie na centrifugeren met een spectrofotometer (OD ₂₈₀ = 1,547 geeft een concentratie van 100 uM monomeer Dps).
4. Verdunnen lineair DNA van hoge concentratie voorraad met 12x reactiebuffer (1M MOPS-KOH pH 7,0, 1 M NaCl) tot een concentratie van 100 ng / ul. Lineair DNA wordt gebruikt voor kwantificering vergemakkelijken, maar plasmide-DNA kan worden gebruikt.
5. Pipetteer 1 ui van de DNA-buffer mengsel in een PCR buis. Voeg voldoende water in het reactiemengsel, zodat het uiteindelijke reactievolume (minus SDS) 12 gl is. Dit bedrag moet vooraf kunnen worden berekend met behulp van het pipetteren tafel. Dps toevoegen aan een uiteindelijke dodecameer concentratie van 3 uM. Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur om voor Dps te binden aan DNA.
6. Voeg genoeg 2 mM FeSO ₄ oplossing om de gewenste concentratie te bereiken. Een typisch experiment maakt gebruik van een reeks concentraties van 0 tot 1 mM FeSO _4. Hogere concentraties leiden tot meer uitgebreide DNA degradatie maar kan ook leiden tot de vorming van ferri precipitaten in het reactiemengsel. Snel voeg 1 pl van de 100 mM H ₂ O _2-oplossing (10 mM eindconcentratie) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten om de Fenton toe-Gemedieerde afbraak reactie plaatsvindt.
7. Voeg 0,8 pl 20% SDS (natriumdodecylsulfaat). Meng en incubeer bij 85 ° C gedurende 5 minuten aan de Dps-DNA complexen verstoren. De SDS destabiliseert de Dps-DNA-complex en voorkomt ongewenste gel verschuivingen voor het DNA, die het gemak van de kwantificering verbetert. Een optionele stap is de reactie van katalytisch degraderen het waterstofperoxide tot niet-toxische producten te stoppen. Voor de in dit protocol omschreven voorwaarden, is deze stap niet nodig is om een ​​breed scala van DNA degradatie te verkrijgen.
8. Incubeer op ijs gedurende 1 min, voeg laden kleurstof en laad op een agarosegel. Run de gel, en vlek voor DNA met behulp van ethidiumbromide. De gel dient gekleurd na elektroforese plaats vóór elektroforese, om te voorkomen dat het SDS te mengen met ethidium bromide verdeling in de gel.

Resultaten

De zuiveringswerkwijze voor Dps hier beschreven zeer reproduceerbaar. Dps zuivering volgens het beschreven protocol, met 2 L van E. coli cultuur als uitgangspunt, zal typisch opbrengst 2,5 ml eiwit dat Dps ₁₂ bij concentraties tussen 5 en 12 pM. Langere inductietijden (4 uur) lijken deze variabiliteit te verminderen. Proteïne zuiverheid constant boven 99%, zoals blijkt uit SDS-PAGE gels (figuur 1). De mate van verontreiniging DNA is altijd verwaarloosbaar, zoals blijkt zowel door aga...

Discussie

Het zuiveringsproces van Dps zoals beschreven in dit artikel is zeer robuust. Zuiverheid vaste hoog (> 99%), geen andere eiwitten op SDS-PAGE gels zichtbare banden. Ondanks dit, sommige batches van gezuiverd Dps lijken nucleaseactiviteit hebben, zoals blijkt uit de gedeeltelijke DNA-degradatie bij incubatie met zeer hoge concentraties van Dps. Dit zou de aanwezigheid van zeer actieve DNasen in een lage concentratie dat we niet in staat waren tot zuivering te verwijderen geven. Echter, dit DNA degradatie alleen waarge...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BL21(DE3)pLysS competent cells	Promega	L1195
pET-17b DNA	EMD-Millipore	69663-3
LB broth powder	Sigma-Aldrich	L3022
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
HEPES	BDH	441476L
Potassium hydroxide	Merck	105033
Sodium chloride	VWR	443824T
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Protease Inhibitor Cocktail Set III	EMD-Millipore	539134
DEAE-Sepharose	Sigma-Aldrich	DFF100
Ammonium sulphate	Sigma-Aldrich	A4418
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare LS	17-0851-01
SP-Sepharose	Sigma-Aldrich	S1799
Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO)	Millipore	UFC901024
Ferrous Sulphate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8048
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763
MOPS	Calbiochem	475898
SDS solution	Bio-Rad	161-0418
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510
Static incubator	Hettich	INE500
Shaking Incubator	New Brunswick Sc.	Inova 44
Cooled centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-E
Table-top centrifuge	Eppendorf	5424
Cell disrupter	Constant Systems Ltd.	TS2/40/AA/AA
FPLC Purifier	General Electric	AKTA
Airtight vials	Cole-Parmer	EW-08918-85
Syringe needles	BD	305128
Pipettes	Eppendorf	Z683779-1EA, Z683795-1EA