Bereiding van acinaire cellen ten behoeve van Calcium Imaging, Cell Injury Metingen en adenovirale infectie

Samenvatting

We beschrijven een reproduceerbare werkwijze voor het bereiden muizen acinaire cellen van een muis voor het onderzoek van acinaire cel calcium signalen en celbeschadiging met fysiologisch en pathologisch relevant stimuli. Werkwijze voor adenovirale infectie van deze cellen is ook voorzien.

Samenvatting

Het acinaire cel het belangrijkste parenchymale cel van de exocriene pancreas en speelt een grote rol bij de secretie van pancreasenzymen in de ductus pancreaticus. Het is ook de plaats voor de initiatie van pancreatitis. Hier beschrijven we hoe acinar cellen worden geïsoleerd uit hele pancreas weefsel en intracellulair calcium signalen worden gemeten. Verder beschrijven we de technieken van deze cellen transfecteren met adenovirale constructen, en vervolgens het meten van de lekkage van lactaat dehydrogenase, een marker van celschade, in omstandigheden die acinar celbeschadiging in vitro te induceren. Deze technieken zorgen voor een krachtig hulpmiddel te karakteriseren acinar cel fysiologie en pathologie.

Inleiding

Dynamische veranderingen in cytosolische calcium zijn nodig voor zowel de fysiologische en pathologische acinar cel gebeurtenissen. Deze uiteenlopende effecten van calcium wordt gedacht dat het gevolg zijn van verschillende ruimtelijke en temporele patronen van calcium signalering ^1. Bijvoorbeeld, enzym en secretie vloeistof uit de acinaire cel verbonden calcium pieken van een beperkt gebied van het apicale pool waar afscheiding plaatsvindt ^2. In tegenstelling, is een wereldwijde calcium golf gevolgd door intense niet-oscillerende calcium signalen geassocieerd met vroege pathologische gebeurtenissen die leiden tot acute pancreatitis ^3,4. Deze omvatten intra-acinar protease activering, verminderde enzym secretie, en acinar celschade. Ons laboratorium gebruikt geïsoleerde pancreatische acini deze eerste pathologische gebeurtenissen die leiden tot ziekte zowel in vivo en in vitro onderzoeken ^5-7. De methoden die hier gedetailleerd beschrijven isolatie van primaire acinaire cellen voor het meten van cytosolic calciumgehalte en celschade. Werkwijze voor adenovirale infectie van deze cellen is ook voorzien.

Protocol

1. Voorbereiding Pancreatic Acinaire Cellen voor Calcium Imaging

1. Bereid HEPES incubatiebuffer bevattende 20 mM HEPES, 95 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM _MgCl2, 1,3 mM _CaCl2, 10 mM glucose, 2 mM glutamine en 1 x minimale Eagle's medium niet-essentiële aminozuren. Stel de uiteindelijke oplossing op pH 7,4 met NaOH.
2. Bereid een BSA incubatiebuffer door toevoeging BSA (1% w / v final) tot 25 ml HEPES incubatiebuffer (hierboven beschreven).
3. Bereid een collagenase digestie buffer door het toevoegen van 1,1 mg / ml (200 eenheden / ml) type-4 collagenase en 1 mg / ml sojaboon trypsine remmer 6 ml BSA incubatiebuffer (hierboven beschreven).
4. Acid-wash 22x22 mm dekglaasjes door onderdompeling in twee delen _HNO3 en enerzijds HCl gedurende 2 uur. Decanteren dan met DI-water en op te slaan in 70% ethanol.
5. Euthanaseren een muis door CO ₂ stikken. Oriënteer het dier in rugligging, en bereiden de buikoppervlak door cleaning met 70% ethanol. Voer een laparotomie de buikholte bloot. Ontleden de alvleesklier en onmiddellijk in een kleine wegen boot met 6 ml collagenase spijsvertering buffer.
6. Ontleden weg elke grote stukken vet of zichtbare bloedvaten, verwijder vervolgens 5 ml collagenase spijsvertering buffer en voeg het terug naar de 15 ml conische buis.
7. Met behulp van fijne dissectie schaar gehakt de alvleesklier in de kleine wegen boot met 1 ml collagenase spijsvertering buffer. Hak tot de verkregen oplossing wordt gelijkmatig gedispergeerd.
8. Breng het gehakte product in een 125 ml Erlenmeyer kolf plastic en voeg de rest 5 ml collagenase digestie buffer aan de container. Zorg ervoor dat het weefsel wordt volledig ondergedompeld in buffer.
9. Plaats de kolf in een 37 ° C waterbad en schud bij 90 rpm gedurende 30 minuten. Tijdens deze korte periode van downtime, bereiden calcium activerende agonisten (bv. caerulein, carbachol) en spoel de 22x22 mm zuur gewassen dekselslips met DI-water. Droog, en dan boven op een vlakke ondergrond omzoomd door laboratorium film.
10. Na de 30 min digest is voltooid, de overdracht van de schorsing terug tot de 15 ml conische buis en laat de cellen om zich te vestigen. Voorzichtig pipet uit de collagenase spijsvertering buffer en vervangen met 6 ml BSA incubatiebuffer. Schud de buis met de hand gedurende 10 seconden om de cellen te dispergeren in kleinere clusters. Onmiddellijk na het schudden, verwijder alle grote, drijvend vuil uit de wisselvalligheid media.
11. Laat de resterende cellen om zich te vestigen, en wisselen de media met verse BSA incubatie buffer.
12. Herhaal stap 1.11 maal, totdat de suspensie slechts uit kleine clusters die alleen fijn zichtbaar voor het blote oog. De cellen moeten lijken op die in figuur 1A (bovenste rij).
13. Verwijder de BSA incubatiebuffer en te vervangen door HEPES incubatie buffer.
14. Bereid een 750 uM, 100X voorraad van Fluo-4:00 in 10% DMSO.
15. Plaats de cellen in de 15 ml conische buis met de celsuspensie en BSA-vrij HEPES incubatiebuffer. Om dit te doen, voeg een geschikt volume (1:100 verdunning) van de voorraad oplossing voor de celsuspensie. Dan plaat 500 ul van deze suspensie op elk 22x22 mm dekglaasje.
16. Houd dekglaasjes in het donker bij kamertemperatuur. Neem de eerste Ca ^{2 +} metingen 30 min. na het laden. De kleurstof wordt automatisch uit het medium verwijderd bij het opstarten van de perfusie, die optreedt na 30 min dye laden.

2. Het meten van calcium in Pancreatic Acinaire Cellen

1. Spoel elke perfusie set-up met DI-water en vullen met een geschikte hoeveelheid buffer of agonist. Prime elke spuit met buffer of agonist om een ​​goede doorstroming te verzekeren. Klem spuiten om een ​​ring te staan ​​ongeveer 1-2 meter boven de microscoop podium.
2. Gebruik fijn pincet om zorgvuldig te begrijpen van zijn kant een dekglaasje bevattende celsuspensie. Kantel het dekselslip 45 °, en laat het overtollige buffer weg kan lopen. Plaats het dekglaasje bovenop de rubberen pakking de cellen bovenop het dekglaasje en monteer de kamer (Figuren 2A en 2B).
3. Beveilig de perfusie kamer naar het podium en steek de slang die buffer in de eerste inlaat van de kamer (figuur 2C) bevat. Draai de spuit met buffer op en laat de buffer perfuseren over het gehele oppervlak van het dekglaasje. Zodra de buffer de andere kant van de kamer is bereikt, plaatst een vacuümleiding in de vacuüminlaat. Steek geen andere buizen (met agonist, remmers, enz.) in hun juiste positie langs de kamer.
4. Visualiseren cellen met behulp van een 200X of 400X, 1,4 numerieke apertuur objectief en een argon laser om de kleurstof Fluo-04:00 wekken bij een golflengte van 488 nm (figuur 1A, bodem). De energie-instellingen van de laser worden aangepast dat de fotomultiplicator (PMT) Wordt niet verzadigd door het uitgezonden licht. Bovendien is de spanning over de PMT moet worden geoptimaliseerd voor een maximale lichtdetectie.
5. Long pass emissiesignalen van> 515 nm worden verzameld bij framesnelheden van 2,5 sec / frame visualiseren langzaam oscillerende patronen en 0,2-0,3 sec / frame visualiseren sneller globale calciumgolven (figuren 3 en 4).
6. Na beeldvorming is voltooid, sluit u de spuiten en verwijder alle slangen. Demonteer de kamer en herhaal de stappen 2,2-2,4.
7. Verzamelen van gegevens als numerieke waarden van fluorescentie-intensiteit in de tijd en transfer naar Afbeelding J (software pakket geboden als freeware door de National Institutes of Health en is te vinden op http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
8. Bekijk real-time beelden van de cel en het identificeren van gebieden van belang (ROI; dwz apicale, basolaterale, kernenergie, enz.)
9. Acquire fluorescentie-intensiteiten voor deze ROI en represent als fluorescentie-intensiteit / basislijn fluorescentie-intensiteit (dwz F/F0).
10. Genereer traces door het uitzetten van F / F ₀ versus tijd. Naast doordrukken worden representatieve beelden gangbare en weergegeven met pseudocolor.

3. Voorbereiding van de Alvleesklier Acinaire Cellen voor mobiele Injury Testen

1. Warm DMEM F-12 media (zonder fenol rood) tot 37 ° C.
2. Voeg BSA (0,1% w / v final) en HCl (50 uM final) de DMEM F-12 media.
3. Aliquot 50 ml DMEM in een conische buis.
4. Bereid een collagenase buffer door het toevoegen van 0,5 mg / ml (12 U / ml) van collagenase type IV tot 10 ml aangevuld DMEM F-12 media.
5. Euthanaseren een muis door CO ₂ stikken. Oriënteer het dier in rugligging, en bereiden de buikoppervlak door reiniging met 70% ethanol. Voer een laparotomie de buikholte bloot. Ontleden de alvleesklier en onmiddellijk in een kleine weegschuitje containing 6 ml collagenase buffer.
6. Gehakt het weefsel met behulp van fijne dissectie schaar voor 3-5 minuten of totdat de verkregen oplossing lijkt gelijkmatig verspreid.
7. Breng het gehakt weefsel naar een 125 ml erlenmeyer met 5 ml extra collagenase buffer, vervolgens plaats in een 37 ° C waterbad onder schudden bij 90 rpm gedurende 5 minuten.
8. Haal ze uit de shaker, zodat cellen te kort af te wikkelen, en uitwisseling met 5 ml vers collagenase buffer. Dan Incubeer nog eens 35 min in een 37 ° C waterbad onder schudden bij 90 rpm.
9. Krachtig resuspendeer de digest met een transfer pipet totdat de suspensie er homogeen zonder duidelijke celklonten. Dan zachtjes pipet de celsuspensie door middel van een pre-natte nylon in een erlenmeyer.
10. Krachtig pipet nog 3 ml vers DMEM F-12 media (met collagenase) door het gaas, om erdoor eventuele resterende cellen.
11. Voeg nog een 6-10 ml DMEM F-12 media en eenllow de cellen om zich te vestigen voor 2-3 minuten. Herhaal deze stap twee keer, en verwijder het supernatant na de laatste wasbeurt.
12. Voeg vers DMEM F-12 media, resuspendeer de cellen, en de plaat 500 pi celsuspensie in elk putje van een 48-well weefselkweek platen. De cellen moeten lijken op die afgebeeld in figuur 1B.
13. Laat de plaat te zitten in een 37 ° C waterbad bij 90 rpm gedurende 5 min voor het toevoegen van agonisten.
14. Stimuleren van de cellen met verschillende agonisten voor 2-4 uur.
15. Kantel de plaat in een hoek, zodat de cellen om zich te vestigen en voorzichtig pipet uit een hoeveelheid van de media (meestal 100 pl) en flits bevriezen in vloeibare stikstof.
16. Flits bevriezen de resterende celsuspensie. Flash Koud essentieel LDH metingen. Als alternatief monsters op ijs worden bewaard indien zij op dezelfde dag worden getest of opgeslagen in -20 ° C voor lange termijn opslag.

4. Meten lactaatdehydrogenase Lekkage

1. Meet lactaat dehydrogenase (LDH) lekkage in de eerste plaats het gebruik van de reagentia en instructies geleverd in de Promega CytoTox 96 Non-Radioactive cytotoxiciteitstest kit (zie Tabel van specifieke reagentia en materialen).
2. Los het LDH substraat (dat is verschaft in de kit) met 12 ml assaybuffer (ook).
3. Ontdooi ingevroren celsuspensie en media monsters in een waterbad bij kamertemperatuur.
4. Plaat 50 ul van elk monster media in een 96-well plaat.
5. Aan de celsuspensie, voeg de nodige volume 10X lysis buffer zodat de uiteindelijke concentratie 1X. Vortex kort en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
6. Centrifugeer gelyseerde monsters bij 250 xg gedurende 4 minuten tot pellet celresten.
7. Voor cellysaten plate 50 ui van een 1:10 verdunning in elk putje van een 96 putjesplaat.
8. Voeg 50 ul van gereconstitueerde substraat aan elk putje, incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
9. Stop de reactie doortoevoegen van 50 pi van de stopoplossing (verschaft in de kit) aan elk putje.
10. Meet absorptie bij 490 nm.
11. Gebruik de volgende formules om% LDH lekkage te berekenen. De optische dichtheden hieronder worden gecorrigeerd door het aftrekken van een blanco OD lezen van een goed met alleen PBS, substraat, en stop oplossing.

LDH in media = (Media OD492) x (media verdunningsfactor) x (vol. van media) * Aangezien het meestal niet nodig om media monsters te verdunnen, zal de verdunningsfactor vaakst equal1.

Totale LDH = ((Lysate OD ₄₉₀₎ x (lysate verdunningsfactor) x (vol. in cel suspensie)) + ((Media OD ₄₉₀₎ x (verdunningsfactor) x (vol. van media gealiquoteerd voor bemonstering))

5. Infecteren Pancreatic Acinaire Cellen met Adenovirus

1. Bereidenacinaire cellen zoals beschreven in paragraaf 3.
2. Na stap 3.12, voeg 10 ⁷ infectieuze eenheden (IFUs) van adenovirus aan de celsuspensie en incubeer 30 minuten bij 37 ° C.
3. Gelijkmatig plaat 2 ml celsuspensie in een 6-wells plaat.
4. Voor de meeste expressie constructen, moeten cellen adequaat worden besmet binnen 18 uur, en voor sommige luciferaseconstructies, net binnen 6 uur.

Resultaten

Een voorbeeld van acinaire cel calcium metingen in respons op fysiologische stimuli wordt verschaft in Figuur 3. Acinaire cellen werden beladen met de calcium kleurstof Fluo-4 en geperfuseerd met acetylcholine analoge carbachol (CCh, 1 uM)) ^8. Cellen gereageerd in de vorm van een calcium-golf die initieert in het apicale gebied en propageert aan de basolaterale regio ^3,9. Vertegenwoordiger traces weergegeven in figuur 3B tonen de typische piek-plateau patroon vaak ...

Discussie

De celisolatie methode en de daaropvolgende analyses afgeschilderd hier vertegenwoordigen krachtige instrumenten om de fysiologische en pathofysiologische kenmerken van de exocriene pancreas bestuderen. Werkwijze voor het isoleren gedispergeerde acinaire cellen werd eerst beschreven door Amsterdam en Jamieson in 1972 ^11. De methoden die hier gepresenteerd zijn op basis van meer recente isolatie methoden beschreven door Van Acker en collega's ^12. Hoewel deze technieken zijn zeer reproduceerbaar ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Mice	NCI	N/A	Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.
HEPES	American Bioanalytical	AB00892
Sodium Chloride	J.T. Baker	3624-05
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Magnesium Chloride	Sigma	M-8266
Calcium Chloride	Fischer	C79
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
L-Glutamine	Sigma	G-8540
1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture	Gibco	11140-050
Sodium Hydroxide	EM	SX0593
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	4188
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T-9003
Carbon Dioxide	Matheson Gas	124-38-9
125 ml Erlenmeyer plastic flask	Crystalgen	26-0005
Dissection kit	Fine Science Tools	14161-10
70% Ethanol	LabChem	LC222102
P1000, P100, P10 pipettes	Gilson	FA10005P
Weighing boat	Heathrow Scientific	HS1420A
Plastic transfer pipettes	USA Scientific	1020-2500
15 ml conical tubes	BD Falcon	352095
50 ml conical tubes	BD Falcon	352070
1.5 ml micro-centrifuge tube	Fisher	05-408-129
0.65 ml micro-centrifuge tube	VWR	20170-293
22 x 22 mm glass coverslips	Fisher	032811-9
Nitric Acid	Fischer	A483-212
Hydrochloric Acid	Fischer	A142-212
Deionized water	N/A	N/A
18 x 18 mm coverslips	Fischer	021510-9
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
Dimethylsulfoxide	Sigma	D2650
Luer lock	Becton Dickinson	932777
60 ml syringe	BD Bioscience	DG567805
23 ¾ gauge needle	BD Bioscience	9328270
PE50 tubing	Clay Adam	PE50-427411
Flat head screwdriver	N/A	N/A
DMEM F-12, no Phenol Red	Gibco	21041-025
30.5 gauge needle	BD Bioscience	305106
5 CC syringe	BD Bioscience	309603
25 ml Erlenmeyer flask	Fischer	FB50025
Nylon mesh filter	Nitex	03-150/38	150 um pore size
48 well tissue culture plate	Costar	3548
96 well tissue culture plate	Costar	3795
6 well tissue culture plate	Costar	3506
Liquid nitrogen	Matheson Gas	7727-37-9
Cytotoxicity assay kit	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	Gift from J. Williams
Equipment
Ring stand with clamps	United Scientific	SET462
Perifusion chamber	N/A	N/A	Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University
Vacuum line	Manostat	72-100-000
Water bath with shaker	Precision Scientific	51220076
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710
BioTek Synergy H1 plate reader	BioTek	11-120-534
Tissue culture hood	Nuaire	NU-425-600
Tissue culture Incubator	Thermo	3110