Pyrosequentiebepaling voor Microbiële identificatie en karakterisering

Summary

Pyrosequencing is een veelzijdige techniek die microbiële genoom die kan worden gebruikt om bacteriële species te identificeren, discrimineren bacteriestammen en detecteren genetische mutaties die resistentie tegen antimicrobiële middelen vergemakkelijkt. In deze video, zal de procedure voor microbiële amplicon generatie, amplicon pyrosequencing, en DNA-sequentie-analyse worden aangetoond.

Abstract

Pyrosequencing is een veelzijdige techniek die microbiële genoom die kan worden gebruikt om bacteriële species te identificeren, onderscheiden bacteriestammen en detecteren genetische mutaties die resistentie tegen antimicrobiële middelen vergemakkelijkt. De voordelen van pyrosequentiebepaling voor microbiologie toepassingen zijn onder meer een snelle en betrouwbare high-throughput screening en accurate identificatie van microben en microbiële genoom mutaties. Pyrosequencing omvat sequentiebepaling van DNA door het synthetiseren van de complementaire streng een basisstation tegelijk, het bepalen van de specifieke nucleotide wezen opgenomen tijdens de synthesereactie. De reactie op geïmmobiliseerd enkelstrengs matrijs-DNA waar de vier deoxyribonucleotiden (dNTP) achtereenvolgens toegevoegd en de niet opgenomen dNTP enzymatisch afgebroken vóór toevoeging van de volgende dNTP de synthesereactie. Detectie van de specifieke base opgenomen in de sjabloon wordt gecontroleerd door generatie chemiluminescent signalen. De volgorde van dNTPs die de chemiluminescerende signalen produceren bepaalt de DNA sequentie van de matrijs. De real-time sequencing vermogen van pyrosequencing technologie maakt snelle microbiële identificatie in een enkele assay. Bovendien is de pyrosequencing instrument kan analyseren volledige genetische diversiteit van antimicrobiële resistentie, inclusief de typering van SNPs, puntmutaties, inserties en deleties, en kwantificering van meerdere genkopieën voordoen bij sommige antimicrobiële resistentie patronen.

Introduction

Pyrosequencing is een snelle en accurate manier om sequentie nucleïnezuren die is gebaseerd op het principe van "sequentiebepaling door synthese". "Sequencing door synthese" omvat met een enkelstrengs DNA-matrijs van de complementaire streng een basisstation tegelijk synthetiseren, en het detecteren van de opgenomen base (A, T, G of C) bij elke stap door detectie van een chemiluminescent signaal. Het reactiemengsel omvat pyrosequentiebepaling matrijs DNA, dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA-polymerase, ATP sulfurylase, luciferine, luciferase en apyrase. De synthese reactie wordt geïnitieerd door de toevoeging van een van de vier dNTP's en DNA polymerase de enkelstrengige gebiotinyleerde matrijs-DNA. DNA polymerase bevat de aanvullende dNTP op de mal, met de daaropvolgende afgifte van pyrofosfaat (figuur 1). ATP sulfurylase zet de verhouding pyrofosfaat aan ATP. ATP werkt als een katalysator voor de luciferase-gemedieerde omzetting van luciferine tot oxyluciferine, welkegenereert licht (figuur 2). De intensiteit van het licht is evenredig met het aantal nucleotiden opgenomen en bepaalt of een of meer specifieke dNTP's (dATP, dTTP, dGTP en dCTP) aanwezig op de matrijsstreng achtereenvolgens (figuur 3) is. Eventuele niet opgenomen dNTP wordt afgebroken door apyrase vóór toevoeging van de volgende dNTP voor de voortzetting van de synthesereactie. Deze "sequentiebepaling door synthese" reactie wordt herhaald met toevoeging van elk van de vier dNTPs tot de DNA-sequentie van het enkelstrengs DNA-matrijs wordt bepaald.

Om een animatie van de pyrosequentiebepaling reactie te bekijken Klik hier om de film te bekijken .

Protocol

Inleiding: Een enkele bacteriekolonie moeten worden gebruikt om een geschikt kweekmedium dat wordt overnacht geïncubeerd inoculeren. Een bacteriële pellet wordt vervolgens op genomisch DNA met behulp van een commercieel verkrijgbare isolatiekit genomische zuiveren. De gezuiverde genomisch DNA zou een verhouding 260/280 (nm) moet> 1,8 te verzekeren dat het monster geen eiwit verontreinigingen. De hoeveelheid genomisch DNA vereist voor het genereren van de pyrosequencing template 10-20 ng.

A. Versterking van de Template

(PyroMark PCR Handbook; www.qiagen.com / handboeken ¹⁾

Het opzetten van de PCR-reactie

Opmerking: Een primer moet gebiotinyleerd aan het 5'-uiteinde, en het wordt aanbevolen dat het zijn HPLC gezuiverd voor de voorbereiding template. Wij raden de PyroMark Assay Design Software 2.0 voor PCR en seQuence primer ontwerp die zijn geoptimaliseerd voor korte-read sequencing echter Primer-BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome ) van NCBI kan ook worden gebruikt voor primer design.

1. Dooi alle benodigde oplossingen (vermeld in tabel 1) en meng elk grondig. Stel de reactie volgens tabel 1. Al het werk gedaan kan worden op kamertemperatuur.

Opmerking: De PCR Master Mix bevat _MgCl2 voor een eindconcentratie van 1,5 mM, die bevredigende resultaten oplevert in de meeste gevallen. Indien een hogere ^{Mg2 +} concentratie is vereist, kan tot 3,5 ui 25 mM _MgCl2 toegevoegd aan een reactiemengsel.

2. De reactie mix goed te mengen door voorzichtig en neer te pipetteren, vervolgens afzien adequate volumes over in PCR-buisjes.
3. Voeg template DNA aan elke PCR buis. Wij raden aan 10 ng genomisch DNA.
4. Programmeer de thermische cycler volgens tabel 2. Een laatste houden bij 4 ° C wordt aanbevolen voor het gemak. Bij gebruik van een PCR-apparaat zonder verwarmde deksel, overlay reacties met 100 ui minerale olie.
5. Plaats de PCR-buizen in de cycler en de cyclus te starten programma.

B. Vacuum Workstation Protocol

Het immobiliseren van het gebiotinyleerde PCR-producten

1. Voeg een master mix volgens figuur 4.

Opmerking: Voor het pipetteren, schud de fles streptavidine-gecoate Sepharosekorrels om een homogene suspensie te garanderen.

2. Afhankelijk van de hoeveelheid PCR-product gebruikt afgeven 60-75 pi Master Mix in elk putje van een PCR plaat tot een totaal volume van 80 gl per putje.
3. Voeg 5-20 ul gebiotinyleerde PCR-product aan elk putje.
4. Verzegelen van de putten met strip caps en schud de PCR plaat bij 1400 rpm gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur (15-25 ° C) met behulp van een schudapparaat.

Denaturatie van DNA en toevoeging van sequentiebepalingsprimer

1. Verdun de sequencing primers met 0,3 uM annealing buffer en 25 pl afzien in elk putje van een reactieplaat. Plaats de plaat op het werkstation.
2. Vul het werkstation goten volgens fig. 5 diagram.
3. Schakel de vacuümpomp, en zorg ervoor dat de schakelaar op het vacuüm gereedschap is ingeschakeld (Figuur 6). Spoel het filter sondes met een hoge zuiverheidsgraad water (Milli-Q 18,2 MW x cm of gelijkwaardig) in trog 5 (figuur 5). Vul de bak met verse hoogzuivere water voor gebruik in stap 12.
4. Snel te werken, de positie van de PCR-plaat met kralen op de werkplek. Controleer of beide platen in dezelfde richting als bij de monsters werden geladen.
5. Met de vacuüm-schakelaar ON, verlagen het vacuümGereedschap in de putjes van de PCR-plaat gedurende 20 seconden of tot al volume is afgezogen. De beads worden opgevangen door het vacuüm gereedschap (figuur 7).
6. Met het vacuüm nog ON, spoelt u de tool met 70% ethanol (trog 1) gedurende 20 seconden of totdat alle volume is opgezogen.
7. Met vacuum ON, spoelt u de tool met denaturatie-oplossing (goot 2) gedurende 20 seconden of totdat alle volume is opgezogen.

Opmerking: De denaturatie oplossing bevat natriumhydroxide, die een oog en huidirritatie. Draag altijd een laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril.

8. Met vacuum ON, spoelt u de tool met wasbuffer (goot 3) gedurende 20 seconden of totdat alle volume is opgezogen.
9. Met vacuum ON, verhogen het vacuüm tool om buiten 90 ° verticaal voor 5 seconden, zodat alle vloeistof uit de vacuüm tool. Schakel de pomp uit, en lijn het vacuüm tool met de reactie plaat. Laat de stofzuiger gereedschap in deputten en schud van links naar rechts om de kralen introductie in de putjes die sequencing primer.
10. Om het vacuüm hiervan schoon schud het filter probes in hoge zuiver water (goot 4) gedurende 10 sec.
11. Schakel de stofzuiger aan en spoel de tool met een hoge zuiverheidsgraad water (trog 5) gedurende 20 seconden of totdat alle volume is opgezogen.
12. Hef het vacuüm tool om buiten 90 ° C verticaal voor 5 sec, zet vervolgens de stofzuiger uit en op te slaan in de stand "Park".

Gloeien sequencing primer om DNA-strengen

1. Plaats de reactie plaat in een voorverwarmde plaat houder.
2. Verwarm de plaat op een verwarmingsblok bij 80 ° C gedurende 2 minuten.
3. Verwijder de plaat uit de houder en plaats op de teller afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.

Pyromark Q24 Operation

Opmerking: Schakel het apparaat met de schakelaar boven de stroomkabel. Stertup kan tot 1 min.

1. Vul een cartridge volgens de instructies in de PyroMark Gold Q24 Reagentia Handboek ^2. Om te bepalen volumes nodig, het opzetten van een run-bestand in het instrument software, en onder het menu Extra selecteert Pre Run Informatie
2. Als het instrument was al op, ervoor te zorgen dat het niet is het uitvoeren van een run en open vervolgens het deksel. Een akoestisch waarschuwingssignaal zal worden uitgezonden als de deksel wordt geopend wanneer het onveilig is om dat te doen.
3. Open de cartridge poort en plaats de cassette met het label naar voren (figuur 8). Zorg ervoor dat de cartridge goed is geplaatst (een lijn moet zichtbaar zijn aan de voorzijde te zijn) en sluit de poort.
4. Open de plaathoudende frame en plaats de plaat met samples in het instrument.
5. Sluit de plaathoudende frame en het instrument deksel (Figuur 9).

Het starten van een run

1. Steek de USB-stick met de run-bestands gemaakt met het instrument software in de USB-poort aan de voorzijde van het instrument.
2. Selecteer 'Uitvoeren' in het hoofdmenu en druk op "OK".
3. Gebruik de pijltoetsen om het gewenste run bestand te selecteren en druk op "Select".

Opmerking: Het instrument zal beginnen doseren reagentia als alle vooraf ingestelde druk en temperatuur zijn bereikt (dit kan enkele minuten duren). Tijdens een run, het scherm toont het toestel de pyrogram van de geselecteerde goed in real-time. Gebruik de pijltoetsen om de pyrogram van andere bronnen bekijken.

Het invullen van een run

1. Wanneer het instrument bevestigt dat de run is voltooid en de run bestand is opgeslagen op de USB-stick, druk op "Close".
2. Verwijder de USB-stick. Indien het werd verwijderd voordat de run klaar, steek de USB-stick. Selecteer "Beheer" en vervolgens "Copy-opgeslagen Runs".
3. De run-bestand kan nu worden geopend en geanalyseerd met behulp van het instrument software en vergelekeneen bibliotheek van bekende bacteriën met de Identifire software.

Results

De resultaten van een typische run pyrosequencing met de software toont de locatie van de voorwaartse en achterwaartse primers die voor amplicon productie en de sequencing primer voor de pyrosequencing reactie binnen het geconserveerde 16S ribosomale sequentie (Figuur 10). De hypervariabele sequentie tussen de primer plaatsen maakt bacteriële identificatie van een groot aantal bacteriesoorten met de geconserveerde sequentie primer (5'-TACATGCAAGTCGA). Als een interne kwaliteitscontrole, de DNA sequentie bracketing het variabele gebied kunnen worden gecontroleerd om te verzekeren dat de juiste DNA gebied geanalyseerd . De pyrosequentiebepaling software maakt vergelijking en aanpassing van de gegenereerde sequentie een interne database van bacteriële ribosomale sequenties voor identificatie van bacteriën. Daarnaast kan een sequentie worden geanalyseerd om mutaties die antibioticum resistentie bepalen. Bijvoorbeeld, analyse van mutaties in het 23S ribosomale genen Helicobacter pylori toont twee mutatie patronen (GAA of AGA) dat resistentie tegen antibiotica verlenen (figuur 11). Analyse van meerdere isolaten van dezelfde patiënt kunnen gelijktijdig worden getest op het ontstaan ​​van resistentie tegen geneesmiddelen te volgen in de tijd om te helpen bij epidemiologisch onderzoek naar resistentie tegen antibiotica uitbraken.

Figuur 1. Gebiotinyleerd PCR-product wordt gebruikt als een sjabloon om dNTP nemen door DNA polymerase, waardoor de vorming van pyrofosfaat (PPi).

Figuur 2. ATP sulfurylase converteert verhouding pyrofosfaat aan ATP. ATP katalyseert de luciferase-gemedieerde omzetting van luciferine tot oxyluciferine, dat licht dat pro genereertgepasseerde de hoeveelheid ATP. Het licht wordt opgenomen als piek op de pyrogram spoor en geeft nucleotide incorporatie. De niet opgenomen dNTPs zijn afgebroken door apyrase voordat de volgende dNTP wordt toegevoegd voor de voortzetting van de synthese.

Figuur 3. De intensiteit van het opgewekte licht geeft aan of een of meer specifieke dNTP's (dATP, dTTP, dGTP en dCTP) werd achtereenvolgens opgenomen op de matrijsstreng.

Figuur 4. Stroomschema voor de bereiding van master mix aan het gebiotinyleerde PCR-product te immobiliseren.

ge = "altijd"> Figuur 5. PyroMark werkstation, met PCR-plaat, PyroMark plaat, en dal locaties.

Figuur 6. Locaties van de Vacuum schakelaar aan en uit posities.

Figuur 7. Vacuüm tool. Deskundige behandeling van het vacuüm tool.

Figuur 8. Cartridge poort met cartridge geopend in plaats.

Figuur 9. Cartridge correct geplaatst met poort gesloten.

"Fo: keep-together.within-page =" altijd ">
Figuur 10. Pyrosequencing based bacteriële identificatieresultaten. PCR primers ontworpen voor geconserveerde gebieden van de DNA-matrijs en de primer sequentie onmiddellijk stroomopwaarts van een goed gekarakteriseerd identificeren hypervariabele DNA sequentie in het amplicon (in blauw).

Figuur 11. Detectie van antibiotica resistentie in Helicobacter pylori met pyrosequencing. Analyse van de mutaties in het 23S genen die antibacteriële resistentie in Helicobacter pylori met GAA of AGA sequenties. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Component	Volume per reactie	Eindconcentratie
Pyro PCR Master Mix, 2x	12,5 ul	1x
CoralLoad Concentrate, 10x	2,5 pl	1x
25 mM MgCl2 (optioneel)	Veranderlijk	≥ 1,5 mM
Q-Solution, 5x (optioneel)	5 pi	1x
Primer A / Primer B	Variabele / Variabele	0.2 μM/0.2 uM
RNase-free water	Veranderlijk	-
Totaal Volume (na toevoeging van het template-DNA)	25 gl

Tabel 1. PCR reactiemengsel.

	& Nbsp;		Aanvullende opmerkingen
Eerste PCR activeringsstap	15 min	95 ° C	HotStartTaq DNA Polymerase geactiveerd
3 stap fietsen: Denaturatie	30 sec	94 ° C
Gloeien	30 sec	60 ° C 56 ° C	Voor genomisch DNA Voor bisulfiet omgezet DNA
Uitbreiding	30 sec	72 ° C
Aantal cycli	45
Laatste verlenging	10 min	72 ° C

Tabel 2. PCR Cycle Specificaties.

Discussion

Verschillende nieuwe next generation sequencing methoden zijn gecommercialiseerd. Drie van de meest gebruikte methoden ion halfgeleider sequencing, molecuul realtime sequencing en sequentiebepaling door synthese (SBS). ^3-11 Elk van deze werkwijzen afhankelijk van sequentiebepaling door synthese maar investeren nieuwe platforms voor de detectie van de opgenomen nucleotiden. In ion halfgeleider sequencing, een enkele streng van DNA dient als een matrijs voor de sequentiebepaling streng. ¹² Polymerase en nucleotiden opeenvolgend in pyrosequencing toegevoegd. Wanneer een nucleotide wordt toegevoegd aan de groeiende DNA-streng, is een waterstof-ion vrijgegeven. De waterstof ionen wordt gedetecteerd door een veldeffect transistor gebaseerde sensor.

Single molecule realtime sequencing afhankelijk van de nul-stand golfgeleider (ZMW). ZMW ¹³ is een kleine structuur waarin een polymerase molecule is bevestigd aan de bodem van de put. Het wordt belicht zodanig dat een floregeur molecuul kan worden gedetecteerd. Elke nucleotide is gelabeld met een fluorescerend molecuul. Als fluorescent gelabeld nucleotide wordt geïncorporeerd, een detector identificeert de nucleotide. Wanneer de volgende nucleotide wordt toegevoegd, wordt de fluorescerende molecule gesplitst. ¹⁴

Sequentiebepaling door synthese (SBS) maakt gebruik van een unieke methode voor het amplificeren van de doelwit DNA zodat clusters van unieke sequenties worden gegenereerd. Single ¹⁵ matrijzen worden gegenereerd en de complementaire streng wordt gesynthetiseerd. Elk nucleotide wordt gelabeld met een fluorescerend molecuul en na elke toevoeging base de fluorescentie van de toegevoegde base wordt opgenomen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PyroMark PCR Master Mix, 2x	Qiagen	978703
CoralLoad Concentrate, 10x	Qiagen	978703, 978705
Q-Solution, 5x	Qiagen	978703, 978705
MgCl2, 25 mM	Qiagen	978703, 978705
RNase-Free Water	Qiagen	129112
Primers	Qiagen	978776 or 978777	Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM.
Pyromark Gold Q24 Reagents	Qiagen	970802
High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent)
Streptavidin Sepharose High Performance Beads	GE Healthcare	17-5113-07
PyroMark Annealing Buffer	Qiagen	979009
PyroMark Denaturation Solution	Qiagen	979007
PyroMark Wash Buffer	Qiagen	979008
PyroMark Q24	Qiagen	9001514
PyroMark Q24 Cartridge	Qiagen	979202
PyroMark Q96 HS Tip Holder Box	Qiagen	979105
PyroMark Q24 Vacuum Workstation	Qiagen	9001516
PyroMark Q24 Plate Holder	Qiagen	9022273
Orbital shaker	Fisher	11-675-297
Heat block	Fisher	11-718Q