Dit protocol beschrijft een hoge doorverbonden colorimetrische methode die is gebaseerd op de vorming van een complex tussen jodium en ketens van glucose moleculen in zetmeel. Jodium vormt complexen met zowel amylose en lange ketens binnen amylopectine. Na de toevoeging van jodium aan een zetmeelmonster, de maximale absorptie van amylose en amylopectine optreedt bij 620 en 550 nm respectievelijk. De amylose / amylopectine verhouding kan worden geschat uit de verhouding tussen de 620 en 550 nm absorptiewaarden en ze te vergelijken met een standaard curve waarbij bepaalde bekende concentraties zijn uitgezet tegen absorptiewaarden. Deze hoge throughput, goedkope methode betrouwbaar en reproduceerbaar, waardoor de evaluatie van grote populaties van aardappel klonen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Rapid High Throughput Amylose Bepaling in gevriesdroogde aardappelknol Samples
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit protocol beschrijft een hoge doorverbonden colorimetrische methode die is gebaseerd op de vorming van een complex tussen jodium en ketens van glucose moleculen in zetmeel. Jodium vormt complexen met zowel amylose en lange ketens binnen amylopectine. Na de toevoeging van jodium aan een zetmeelmonster, de maximale absorptie van amylose en amylopectine optreedt bij 620 en 550 nm respectievelijk. De amylose / amylopectine verhouding kan worden geschat uit de verhouding tussen de 620 en 550 nm absorptiewaarden en ze te vergelijken met een standaard curve waarbij bepaalde bekende concentraties zijn uitgezet tegen absorptiewaarden. Deze hoge throughput, goedkope methode betrouwbaar en reproduceerbaar, waardoor de evaluatie van grote populaties van aardappel klonen.
Inleiding
Ongeveer 80% van het versgewicht van een aardappel water, vrijwel alle resterende droge stof zetmeel 1. Het merendeel van het zetmeel (70%) bestaat uit amylopectine, terwijl de rest amylose. De verhouding tussen amylose en amylopectine is de belangrijkste eigenschap die de fysische eigenschappen van zetmeel. Amylose is een lineair alfa 1-4 glucose-keten, terwijl amylopectine een lineair alfa 1-4 ketting met alpha 1-6 vertakkingen 2. Werkwijzen zoals jodium binden, differentiële scanning calorimetrie (DSC), hoge prestatie grootte-uitsluitingschromatografie (HPSEC) en concanavaline A interacties ontwikkeld voor bepaling zetmeel in verschillende gewassoorten 3,4. Elk protocol vereist speciale vaardigheden en apparatuur, waardoor het moeilijk te schalen talrijke monsters te kwantificeren tegelijk. De methode die we hier presenteren is een aangepaste protocol van Hovenkamp-Hermelink et al.. 5 dat is een dubbele golflengte jodium bindenmethode van gekleurd zetmeelkorrels. De voordelen van deze methode versus andere amylose omvatten de bepaling van onverwerkt zetmeel zonder zuiveren en het gebruik van de dubbele golflengte systeem de nauwkeurigheid van de werkwijze 4,6 te verhogen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Amylose Bepaling van Potato knolzetmeel
- Schil en snijd verse knollen in kleine blokjes.
- Plaats aardappelblokjes in kleine bruine zakken en bewaar overnacht bij -80 ° C.
- Transfer aardappelblokjes aan nylon zakken en voor vriesdrogen.
- Na gevriesdroogde, slijp de aardappel monster tot poeder met behulp van vijzel en stamper of een Wiley Mill.
- In een 50 ml buis, voeg 20-30 mg van de gevriesdroogde, gemalen knol monster.
- Bereid een oplossing van 45% (w / v) perchloorzuur (meng 24,4 ml 60% perchloorzuur en 25,6 ml ultrazuiver water.
- Voeg 500 ui 45% (w / v) perchloorzuur en schudden of swirl aan zetmeelkorrels dispergeren.
- Na vier minuten incubatieperiode bij kamertemperatuur, voeg 16 ml ultrazuiver water aan de oplossing en door vortexen gemengd.
- Na onoplosbare materiaal afgerekend naar de bodem van de buis (7-10 min later), overdracht 40 ul van de oplossing van een microtiterplaat (het vermijden van het pipetteren van deeltjes).
- Voeg 50 ul van jodium-oplossing (2 g KI + 1 g I 2 in 900 ml ultrapuur water) en meng het monster door pipetteren.
- Lees de absorptie bij 550 nm en 620 nm onmiddellijk.
- Bepaal het percentage amylose een vergelijking van de amylose / amylopectine verhouding van elk monster (620 nm/550 nm absorptie) met een standaardcurve gegenereerd uit amylose en amylopectine oplossingen bij verschillende concentraties. Deze procedure zal vervolgens worden beschreven. Lees de blanco (joodoplossing en perchloorzuur) samen met de proefmonsters. Gebruik gewist gegevens voor de analyses.
2. Amylose / amylopectine Curve
- In afzonderlijke buizen weegt 12,5 mg van amylose en 12,5 mg van amylopectine.
- Aan elke buis 5 ml 45% (w / v) perchloorzuur en volledig zijn opgelost.
- Voor elk van de oplossingen (amylose en amylopectine), breng op een eindvolume van 50 ml met ultrazuiver water.
- Meng 6.25ml amylose voorraad van de vorige stap met 18,75 ml ultrapuur water. Dit zal een 6,25 mg / ml amylose oplossing.
- Herhaal de procedure voor de amylopectine-oplossing.
- De amylose en amylopectine standaardoplossingen van stap 2.4 en 2.5, bereid het percentage amylose normen 0-100% amylose (100-0% amylopectine) tot een eindvolume van 5 ml van de standaard curve 10% intervallen te creëren.
Bijvoorbeeld, voor te bereiden:
De 0% amylose / amylopectine 100% standaard Pipetteer 5 ml amylopectine-oplossing.
De 10% amylose / 90% amylopectine standaard combineren 0,5 ml 4,5 ml amylose en amylopectine oplossingen.
De 20% amylose / 80% amylopectine standaard combineren 1,0 ml 4,0 ml amylose en amylopectine oplossingen.
De 30% amylose / 70% amylopectine standaard combineren 1,5 ml 3,5 ml amylose en amylopectine oplossingen.
De 40% amylose / 60% amylopectine standaard combineren 2,0 ml 2,0 ml amylose en amylopectine oplossingen.
De 50% amylose/ 50% amylopectine standaard combineren 2,5 ml 2,5 ml amylose en amylopectine oplossingen.
De 60% amylose / 40% amylopectine standaard combineren 3,0 ml 2,0 ml amylose en amylopectine, enzovoort). - Transfer 40 pi van elke standaard mengsel in een microtiterplaat. Voeg een put met 40 pl 45% (w / v) perchloorzuur als blanco.
- Voeg 50 ul joodoplossing (2 g KI + 1 g I 2 in 900 ml ultrazuiver water) en meng elk monster (inclusief de blanco) door pipetteren.
- Lees absorptie bij 550 nm en 620 nm onmiddellijk en bereken de amylose / amylopectine verhouding voor elke concentratie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De standaardkromme geconstrueerd uit gestanst gegevens van verschillende amylose / amylopectine concentratie oplossingen toont bij benadering absorptie verhoudingen variërend 0,7-1,6 (tabel 1). Een lineaire regressie trendlijn van deze data wordt later gebruikt voor het afleiden van amylose-gehalte in gevriesdroogde aardappel monsters (Figuur 1).
De plantaardige productie-omgeving heeft een aantal gevolgen voor de amylose-gehalte in de aardappelknol 7.<...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Zetmeelgehalte in aardappelknollen varieert doorgaans 20-35% 7,8. Als de meeste waarden buiten dit bereik, deze mogelijke fouten: 1) ruwe gegevens werden gebruikt in plaats van blanked gegevens voor de bouw van de amylose / amylopectine standaard curve 2) ruwe gegevens werden gebruikt in plaats van blanked gegevens voor de bepaling van de amylose / amylopectine-verhoudingen van de aardappel monsters, of 3) het water dat wordt gebruikt voor de analyse was niet zuiver genoeg. We hebben gemerkt dat met gedestill...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De financiering van dit onderzoek werd mede verzorgd door de USDA-ARS Research Associate Program en de USDA Crop Kiemplasma Comite.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagentia | |||
| Amylose | Sigma | 859656 | |
| Amylopectine | Sigma | A8515 | |
| Perchlorigzuur 60% | Sigma | 311413 | Zeer gevaarlijk voor de huid en ogen |
| Jodium | Sigma | 23214TD | |
| Kaliumjodide | Sigma | 08625JE | |
| Apparatuur | |||
| Plate Reader | Bio Tek | ELx800 |
Referenties
- Composition Hoover, R. molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review. Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).
- Bertoft, E., Blennow, A. Structure of Potato Starch. Advances in Potato Chemistry and Technology. , 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).
- Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds. Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).
- Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique. Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).
- Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato. Potato Res. 31, 241-246 (1988).
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. Starch. , 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).
- Haase, N. U., Plate, J. Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors. Stärke. 48 (5), 167-171 (1996).
- Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules. Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).
- Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A. J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).
- Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A. Starch. 42, 302-305 (1990).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
