Gebruik van<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging aan de progressie van de Experimentele Mouse Cytomegalovirusinfectie in Pasgeborenen Monitor

Samenvatting

Human cytomegalovirus (HCMV) infectie van pasgeborenen is een belangrijke oorzaak van mentale retardatie, maar de moleculaire gebeurtenissen die tot virus-geïnduceerde pathogenese zijn nog steeds slecht begrepen. Om de dynamiek van de hersenen infectie te onderzoeken, hebben we aangepast hele-dier In vivo Beeldvorming om tijdsverloop analyse van pasgeborenen besmet met een luciferase-recombinant virus uit te voeren.

Samenvatting

Human cytomegalovirus (HCMV of HHV-5) is een levensbedreigende ziekteverwekker bij immuun-gecompromitteerde individuen. Bij congenitale of neonatale infectie kan het virus infecteren en repliceren in de ontwikkelende hersenen, die ernstige neurologische schade, waaronder doofheid en mentale retardatie kan leiden. Ondanks de mogelijke ernst van de symptomen, zijn de therapeutische opties beperkt door het ontbreken van een vaccin en de afwezigheid van een specifieke antivirale therapie. Verder is een nauwkeurige beschrijving van de moleculaire gebeurtenissen tijdens infectie van het centrale zenuwstelsel (CZS) nog ontbreken omdat observaties voornamelijk voort uit de autopsie van geïnfecteerde kinderen. Verschillende diermodellen, zoals rhesus macaque CMV, ontwikkeld en belangrijke inzichten in pathogenese CMV in het CZS. Ondanks de evolutionaire nabijheid van mensen, werd dit model beperkt door de intracraniale inoculatie procedure voor de dieren en nadelen infecterenistently induceren CNS infectie. Bovendien hebben ethische overwegingen de ontwikkeling van alternatieve modellen gepromoot, waaronder neonatale infectie van pasgeboren muizen met muizen cytomegalovirus (MCMV) heeft onlangs geleid tot een significante vooruitgang. Bijvoorbeeld werd gemeld dat intraperitoneale injectie van MCMV aan Balb / c pasgeborenen leidt tot infectie van neuronen en gliale cellen in specifieke gebieden van de hersenen. Deze bevindingen suggereerden dat experimentele inoculatie van muizen de tekorten veroorzaakt door HCMV infectie bij kinderen zou kunnen herhalen. Niettemin is een dynamische analyse van MCMV infectie van pasgeborenen is moeilijk uit te voeren omdat klassieke methoden nodig het offeren van een groot aantal dieren op verschillende tijdstippen van de virale last en / of immuun-gerelateerde parameters te analyseren. Om dit knelpunt te omzeilen en toekomstige onderzoeken van zeldzame gemuteerde dieren mogelijk te maken, hebben we in vivo imaging-technologie toegepast op een tijd-cursus analyse van de Vira voerenl verspreiding in de hersenen bij perifere injectie van een recombinant luciferase tot expressie MCMV C57BL / 6 pasgeborenen.

Inleiding

Human Cytomegalovirus (HCMV/HHV-5) is een lid van de β-herpesvirusfamilie. HCMV is een veel voorkomende, opportunistische pathogeen die meestal tijdens het vroege leven wordt verkregen als een asymptomatische infectie ^1. Net als alle herpesvirussen, HCMV blijft gedurende de gehele levensduur van de gastheer bij wie het immuunsysteem strak regelt virale replicatie. Afleveringen van virale reactivering vooral optreden bij immuungecompromitteerde personen, zoals transplantatie patiënten die medicijnen om afstoting te voorkomen ^2. Bij volwassenen is HCMV ook verbonden met glioblastoma ^3. Daarnaast HCMV is een prominente pathogeen voor pasgeborenen met onvolwassen immuniteit ^4-6. Primaire infectie in de zich ontwikkelende foetus of pasgeboren kind kan ernstige gevolgen hebben. HCMV infectie is de meest voorkomende infectieuze oorzaak van aangeboren afwijkingen en stoornissen bij kinderen in ontwikkelde landen. Er wordt geschat dat de incidentie van neonatale HCMV infectie treft 0,5-1% of alle levendgeborenen waaronder 5-10% zal lijden aan ernstige symptomen zoals microcefalie of cerebellaire hypoplasie. Daarnaast zal 10% van de geïnfecteerde zuigelingen met subklinische virale infectie ontwikkelen later restverschijnselen leiden tot mentale retardatie, gehoorverlies, visuele gebreken of inbeslagneming en epilepsie ^7,8.

In tegenstelling tot andere humane herpesvirussen zoals Herpes Simplex 1 (HSV-1/HHV-1) die kan worden geïnoculeerd in muizen via verschillende routes van injectie ^9, cytomegalovirus replicatie soortspecifiek. Deze functie is ernstig belemmerd onderzoeken HCMV pathogenese die worden uitgevoerd in verschillende diermodellen (muis, rat, cavia, rhesus aap) en hun werkelijke gastheerspecifiek CMVs. Alle CMVs vertonen belangrijke overeenkomsten in het genoom omvang en organisatie, weefseltropisme en regulatie van genexpressie. Ze veroorzaken ook gelijkaardige pathologieën in hun respectievelijke gastheer. Ondanks genomische diversiteittween HCMV cytomegalovirus en muis (MCMV) (50% van de ORF's aanwezig in het humane virus zijn geïdentificeerd in het muizen CMV), heeft het muismodel onlangs bleek gunstig, vooral omdat mutante stammen kunnen worden getest op hun vermogen om controle virale replicatie in vivo. Dit heeft geleid tot een genetische screen, die een schatting van het aantal muisgenen expressie in het volwassen stadium waarin de "resistoom" om dit virus ¹⁰ samen ingeschakeld. In totaal betekent dit dat MCMV-geïnfecteerde muizen vormen een aantrekkelijk model voor de studie van gastheer-virus interacties bij volwassenen. De exploratie van congenitale CMV-infectie is complexer, omdat de verschillen in de placenta layer organisatie tussen menselijke en muizen aantasting van de moeder-aan-foetus overdracht van de virale infectie in muizen. Onlangs, heeft directe injectie van MCMV in de placenta op dag 12.5 van de dracht hersenen infectie van muizen pasgeborenen die leidde tot slechthorendheid ¹¹ ingeschakeld. De meeste investigations gebruiken nu intraperitoneale injectie van 4-20 hr-oude neonaten tot systemische virale verspreiding mogelijk leidt tot hematogene hersenen infectie, een model dat is meer relevant dan die van een intracraniële injectie geven. Dit protocol belangrijke inzichten in de pathogenese CMV en meer in het bijzonder werd aangetoond dat MCMV infectie van pasgeborenen resulteert in virale replicatie in neuronen en gliale cellen in inflammatoire foci die zijn geïnfiltreerd met mononucleaire cellen zoals macrofagen ^12. Dit rapport beschreef ook veranderd morfogenese van het cerebellum gepaard met een verminderde korrelige neuron proliferatie en migratie en de inductie van meerdere interferon gestimuleerde genen. De essentiële rol van CD8 + T-cellen voor de bestrijding van MCMV in het centrale zenuwstelsel werd ook door dezelfde groep ^13. Een belangrijk aspect om te overwegen bij het analyseren van de pathologische gevolgen van een microbe is de dynamiek van het infecterenion. Bij MCMV, is het bijzonder belangrijk te onderzoeken en kwantificeren van de progressie van virale verspreiding in de ontwikkelende hersenen om te begrijpen en anticiperen op de omvang van de toekomstige neurobiologische verwondingen. Traditioneel is de kwantificering van de progressie van een infectie vereist regelmatig offer van besmette dieren het pathogeen in weefsels zoals de hersenen, die anders ontoegankelijk titreren. Dit type protocol wordt nu uitgedaagd door noodzakelijke verbetering van het dierenwelzijn en de 3 V's (vermindering, verfijning, Vervangen) principes ^14. Met behulp van in vivo imaging technologieën kan toestaan ​​dat een drastische vermindering van het aantal dieren die nodig zijn in vivo infectie-experimenten. Hier melden wij en beschrijven een tijdsverloop analyse van virale verspreiding in de hersenen na intraperitoneale MCMV-Luc injectie om de muis pasgeborenen. Met dezelfde dieren we gevolgd en gecontroleerd in vivo het plaatsen van intense viral replicatie gedurende een periode van 2 weken.

Protocol

1. Bereiding van virale Suspension

1. Verkrijgen van de Smith stam van MCMV uiten Luciferase (MCMV-Luc ¹⁵⁾ uit het laboratorium Ulrich Koszninowski's. In deze recombinant, wordt de luciferase-gen ingevoegd in de locus van de ie2 MCMV genoom.
2. Om versterken MCMV-Luc, infecteren een muizen beenmerg stromale cellijn (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) met MCMV op verschillende multipliciteit van infectie (MOI, ,001-1) ^16. Hierbij voeg virus gekweekte cellen in serumvrij medium bij 37 ° C. Na een uur, de bovenstaande vloeistof en vervangen door DMEM aangevuld met 10% foetaal kalf serum (FCS). Vijf dagen later, oogsten het kweekmedium en bewaar monsters bij -80 ° C tot verder gebruik.
3. Titratie van de virussuspensie door plaque assay.
   1. Split 3T3-cellen (ATCC # CRL-1658) in een plaat met 24 putjes bij 40.000 cellen / putje in 1 ml DMEM gesupplementeerd met 10% FCS met penicilline (200 IU / ml) en steptomycin (200 mg / ml) En incubeer 24 uur bij 37 ° C.
   2. Bereid seriële verdunningen (10 ^-1 tot 10 ^-8) een aliquot van MCMV suspensie in DMEM en infecteren doelcellen (3T3) met 200 gl verdunning na verwijdering celkweekmedium. Incubeer 1 uur bij 37 ° C. Voeg 1 ml van Top Medium (DMEM 3% FCS, 2% (v / v) gentamycine, 200 IU / ml penicilline, 200 mg / ml streptomycine, 8 g / L carboxymethylcellulose) en incubeer 5 dagen bij 37 ° C.
   3. Fixeer de cellen door toevoeging van 200 pi 10% formaldehyde (verdunning van formaldehyde met water moet worden gedaan in een chemische kap toxische inhalaties voorkomen) aan elk putje en incuberen 6 uur bij kamertemperatuur geroerd. Verwijder kweekmedium + fixator door pipetteren uit en voeg 200 ul cellen kleuroplossing (1% kristalviolet (w / v) in 20% ethanol). Verdun voor gebruik 1 deel met 9 delen milli-Q water. Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur, was de plaat 3-4x door een behandeling in water, laten drogen en tel het aantal plaques met een verrekijker.
4. Verdun MCMV-Luc in DMEM met 50 pfu's te verkrijgen in 50 ui en laat op ijs tot gebruik. Het gebruik van hogere viral inoculums induceert dodelijkheid voor de pasgeborenen bereiken 2-3 weken oud zijn. In onze ervaring, 500 pfu induceren dodelijkheid in elke pasgeborene 5 tot 7 dagen na de injectie.

2. Injectie van pasgeborenen

1. Bij neonaten (4 tot 20 uur oude muizen) zijn beschikbaar, manipuleren het strooisel en de uitwerpselen van de kooi met handschoenen voordat zorgvuldig omgaan met de pups om besmetting met "vreemde" geuren die de moeder zou benadrukken en induceren de afwijzing van de pups te voorkomen .
2. Voer een intraperitoneale injectie met een insulinespuit (29 G) zoals weergegeven in figuur 1A. Houd de pasgeborene met de dorsale huid. Met ventrale zijde naar boven, de invoering van de naald onder het voorbeen en duw het voorzichtig subcutaan naar de buikholte (een beetje onder de navel) te bereiken. We hebben momenteel injecteren 1% Methyleenblauw verdund in DPBS en bewaken overleven tot practice de techniek voordat virale infecties. Omdat Methyleenblauw is duidelijk zichtbaar tijdens de injectie proces, raden wij u aan deze "opleiding" injectie eerst voor een goede levering van de virale suspensie in de intraperitoneale holte te garanderen.
3. Elimineer de kleine bloeddruppels die zich kunnen voordoen en plaats de pasgeborene terug in de kooi.

3. In vivo beeldvorming

1. Op dag 7, behandelen de pasgeborenen met dezelfde waarschuwingen als eerder vermeld. Intraperitoneaal injecteren van een mengsel van anesthetica (4 mg / ml ketamine, 0,8 mg / ml xylazine) en luciferine (0,15 mg / g lichaamsgewicht) in 50 pl in elk dier. Gemiddelde lichaamsgewicht van de dieren 1-2 g en de dosis verdovingsmiddelen per dier is: 40 mg ketamine, xylazine 8 ug wachten 12-15 min tot luciferine de maximum emissie bereikt. Dit moet worden bepaald vooraf en afhankelijk van de luciferine provider en beeldvormingssysteem gebruikt.
2. Terwijl de pups zijn anesthetized, tag ze voor toekomstige identificatie en oogst een klein stukje weefsel, dat vervolgens kan worden gebruikt voor toekomstige genotypering als mutant dieren worden gebruikt.
3. Plaats de pups in het beeldvormingssysteem en voert acquisitie van het uitgestraalde licht door het hele lichaam. Zeven dagen na infectie, is het virus gerepliceerd in talrijke exemplaren in doelorganen zoals lever, nieren, longen en speekselklieren, daarom is de duur van de blootstelling kort. In ons geval, voeren we de overname 10 tot 20 seconden (Figuur 1B). Het platform in de overname kamer van de imaging-apparaat moet worden verwarmd tot overmatige afkoeling van de lichaamstemperatuur van verdoofde dieren te voorkomen. Daarnaast is het nuttig om lage resolutie afbeeldingen van verschillende dieren krijgen binnen een ronde van verwerving en vervolgens overgaan tot de platform dichter bij de lens van de camera om zich te richten op een deel van een bepaald dier of een geïsoleerd orgaan na dissectie. De software moet snelle veranderingen mogelijkvan de parameters (belichtingstijd, afstand monster / lens, gevoeligheid), kwantificatie van gedefinieerde gebieden van belang en de toekomstige export van snapshot beelden.
4. Om lichtsignaal ontvangt alleen uit het hoofd, bedekken het lichaam van de pasgeborenen liggen lateraal met een dikke, donker papier dat zal maskeren de fotonen die op het niveau van de organen waar hoge virale replicatie plaatsvindt (lever, longen, speekselklieren) en het uitvoeren van acquisitie gedurende 5 tot 10 minuten (figuur 1C). Voer verwerving van de tegenoverliggende zijde van het dier onder dezelfde omstandigheden.
5. Opnieuw de pups in de kooi en plaats een warmtelamp boven aan overmatige afkoeling van de verdoofde pasgeborenen te voorkomen. Regelmatig toezicht post-anesthesie recovery. Met de aangegeven dosis anesthesie duurt nog 30 minuten.
6. Herhaal dezelfde procedure op dagen 9, 11 en 14. Op dagen 11 en 14, verandert de dosis verdovingsmiddelen (6 mg / ml ketamine, 1,2 mg / ml xylazine).

Resultaten

Een representatief experiment wordt getoond in figuur 1. Bij intraperitoneale injectie van 50 pfu van MCMV-Luc (Paneel A toont een soortgelijke injectie uitgevoerd met Methyleenblauw aan de subcutane toediening van de naald te visualiseren), pasgeborenen werden verdoofd en kregen tegelijkertijd 0,3 mg van het luciferasesubstraat (Luciferin, remklauw). Vijftien minuten later, dieren werden in de overname kamer van de IVIS 50 (In vivo Imaging System, remklauw) geplaatst buikzijde en het licht dat door het...

Discussie

Met behulp van in vivo beeldtechnologie MCMV-Luc verspreiding in muizen pasgeborenen volgen, waren we in staat om virale verspreiding acht in hersenen van mutante dieren, in tegenstelling tot wild-type. Verdere ontleding van het dier en ex vivo beeldvorming van de hersenen bevestigde de aanwezigheid van luminescente virus in het centrale zenuwstelsel. Daarnaast hebben we ook uitgevoerd immunohistochemie (niet getoond) aan hersenen dunne secties met een antilichaam specifiek voor MCMV E1 vroege eiwitten...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens/Materiaal
DMEM	Fisher Scientific	W3523A
Methyleenblauw	Sigma Aldrich	319112
Insuline naalden	VWR	613-4897
Ketamine	CentraVet	Ket 201
Xylazine/Vetranal	Sigma Aldrich	46995
DPBS	DUTSCHER	P0436500
Luciferine	Caliper	760504
gentamycine	Sigma Aldrich	G1272
penicilline/streptomycine	Gibco	15070
carboxymethylcellulose	Sigma Aldrich	C4888
formaldehyde	Sigma Aldrich	F8775
kristal violet	Sigma Aldrich	C3886
Apparatuur
IVIS 50	Caliper/Perkin Elmer