Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis

Samenvatting

Beeldvorming van cerebrovasculaire ontwikkeling in larvale zebravis wordt beschreven. Technieken om 3D-beeldvorming te vergemakkelijken en het gebruik van chemische behandelingen cerebrovasculaire ontwikkeling passen zijn ook aanwezig.

Samenvatting

Zebravis is een krachtig hulpmiddel om de ontwikkelingsbiologie en pathologie te bestuderen in vivo. Het kleine formaat en de relatieve transparantie van de zebravis embryo's maken ze bijzonder nuttig voor het visuele onderzoek van de processen, zoals hart-en vasculaire ontwikkeling. In verschillende recente studies transgene zebravis die EGFP expressie in vasculaire endotheelcellen werden gebruikt om beelden en complexe vasculaire netwerken te analyseren in de hersenen en het netvlies, met confocale microscopie. Beschrijvingen zijn gegeven voor te bereiden, te behandelen en imago zebravis embryo's die versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) te uiten, en dan het genereren van uitgebreide 3D renderings van het cerebrovasculaire systeem. Protocollen omvatten de behandeling van embryo, confocale beeldvorming en fixatie protocollen die EGFP fluorescentie behouden. Verder, nuttige tips over het verkrijgen van beelden van hoge kwaliteit van cerebrovasculaire structuren, zoals het verwijderen van de ogen zonder schadelijke nabijgelegen zenuwweefsel zijn aanwezig. Mogelijke valkuilenmet confocale beelden worden besproken, samen met de stappen die nodig zijn om 3D-reconstructies van confocale beeld stapels met behulp van vrij beschikbare open source software te genereren.

Inleiding

Zebravis een krachtig systeem om ontwikkelingsbiologie te bestuderen, en de relatieve transparantie van hun embryo vatbaar is voor-imaging gebaseerde studies ^1. De zebravis is nu gebruikt als een model voor de ontwikkeling van vertebraten decennia. Teleosten, met inbegrip van de zebravis, een vereenvoudigde gewervelde vasculaire systeem dat geen redelijk homoloog in ongewervelde dieren heeft. Bloed wordt door kieuwen, waar het zuurstof uit de voorste kamer van een twee-chambered hart gepompt. Bloed uit de kieuwen convergeert op de dorsale aorta en loopt door slagaders die tak in kleinere en kleinere schepen, en bereikte uiteindelijk haarvaten in orgaanweefsels. Binnen haarvaten zuurstof vrijkomt en kooldioxide wordt geabsorbeerd. Aan de aderlijke kant van capillairen bloed stroomt in steeds grotere aders en uiteindelijk getrokken in de achterste kamer van het hart, waarbij de cyclus herhaalt.

Een volwassen zebravissen kunnen 200 of meer eieren te leggen in een tijd, en ONCe bevrucht, ontwikkelen ze snel ^2. Binnen een dag het lichaam as is goed ontwikkeld, met inbegrip van spieren die overeenkomst en het embryo verplaatsen binnen het chorion membraan. Vanaf 2-7 dagen na de bevruchting (DPF) de meeste systemen van het lichaam te ontwikkelen, met inbegrip van ogen en een centrale zenuwstelsel die kan coördineren zwemmen ten opzichte van voedsel of uit de buurt van fel licht. Tot 7 dpf embryo's zijn klein genoeg om voor visualisatie met microscopie. Transgene lijnen die fluorescerende eiwitten tot expressie kunnen worden afgebeeld met confocale of fluorescentie microscopie. Confocale beeldvorming kan worden gecombineerd met open-source software ³ naar 3D renderings van complete vasculaire structuren te creëren in de zebravis embryo's die een systeembiologie perspectief van vasculaire ontwikkeling. Bezig met veranderingen in de vasculaire en cerebrovasculaire complexiteit studies zullen profiteren van dit protocol omdat het zorgt voor een systeemniveau analyse van vasculaire netwerken ^4,5. Een compilatie van methoden en middelen te verstrekkend om gemakkelijk te kunnen aannemen en van deze technieken voor studies die beeldvorming van vasculaire structuren in embryonale zebravis vereisen. De kostenefficiëntie van de zebravis als diermodel is het combineren met opkomende imaging technologieën om nieuwe platforms waarmee angiogene effecten van moleculaire pathways in gewervelde ontwikkeling en homeostase beoordelen.

Protocol

1. Zebravis Veehouderij, Embryo Generation, en behandeling

1. Voeren de volgende zebravis protocollen onder de begeleiding van een institutionele Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en binnen dierverzorging richtlijnen van de NIH of andere regelgevende instanties / richtlijnen.
2. Zebravis stammen die fluorescerende eiwitten tot expressie in specifieke weefsels, cellen of organen zijn verkrijgbaar bij de zebravis International Resource Center (Zirc). Bijvoorbeeld, Tg (KDR: EGPF) s843 EGFP expressie in vasculaire endotheelcellen ^6, die kan worden gebruikt om volledige 3D vasculaire structuren te produceren zoals in dit protocol. Andere lijnen van transgene zebravis zijn verkrijgbaar bij Zirc.
3. Huis volwassen zebravissen in een geschikt aquacultuur systeem dat pH, zoutgehalte, temperatuur, opgeloste zuurstof, licht, en andere omgevingsfactoren ⁷ bewaakt. De hier getoonde zebravis werden gehuisvest in een Aquaneering Inc systeem (San Diego, CA) en 28.5 ° C met een 14 uur light/10 uur donker cyclus. Feed volwassen zebravissen een uitgebalanceerd dieet van pekel garnalen en NRD 4/6 Visvoer (Brine Shrimp Direct, Ogden, Utah).
4. Volwassen mannelijke en vrouwelijke zebravis van vruchtbare leeftijd dienen afzonderlijk te worden gehuisvest aan de paring succesvol te verhogen.
5. Stimuleer de eileg en bemesting door het plaatsen van vrouwen (2-4) en mannen (4-6) samen in een paring container die een mesh bodem met gaten groot genoeg voor de eieren te vallen door heeft, maar te klein voor de zebravis volwassenen te passeren . Opzetten van paringen de avond voor; eieren worden gelegd in de buurt van de dageraad, meestal terwijl het overdag licht cyclus langzaam in intensiteit toeneemt (dageraad). Controleer eieren op de bodem van de houder koppelen elke 15-30 minuten.
6. Verzamel eieren met behulp van een zeef en schoon met E3 buffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM _CaCl2, 0,33 mM _MgSO4). Breng de eieren tot 100 mm cultuur platen gevuld met E3 buffer en op te slaan in een 28 ° C incubator.
7. Chemische stoffen die cer veranderen studerenebrovascular vertakking voegen gewenste chemische concentraties. Bijvoorbeeld neovascularisatie vertakking kan worden geïnduceerd met γ-secretase inhibitor (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butylester) opgelost in DMSO ^4, beginnend 24 uur na de bevruchting (HPF). Op dat moment-point embryo's nog steeds binnen het chorion, en vele chemicaliën doorheen kan ^8. Als een behandelingsconditie heeft neurale of motorische effecten die het vermogen van embryo zonder de chorion breken kan beïnvloeden, dan embryo's worden de-chorionated tussen 24 en 48 HPF, die kan worden gedaan met ofwel tang pronase ^2. Embryo's getoond in de beelden geleverd werden dechorionated door voorzichtig grijpen de chorion met twee geslepen pincet en scheurt hem open.
8. Indien nodig / gewenst pigmentvorming kan worden geremd door toevoeging van 0,003% N-fenylthioureum (PTU) het E3 buffer 24 HPF.

2. Confocale beeldvorming van Cerebrovascular Structgelen in Vaste zebravis embryo's

1. Offer embryo in 250 mg / L tricaïne methaansulfonaat, en vervolgens lossen door onderdompeling in 2 - 4% paraformaldehyde gedurende de nacht bij 4 ° C. Containers met fluorescerende embryo's moet worden verpakt in folie. Eenmaal vastgesteld, moet embryo's worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C totdat afgebeeld - EGFP fluorescentie-intensiteit minder opgelost na ongeveer een week, maar morfologie (zoals gezien in helderveld) is veel langer bewaard.
2. Bereid je voor om het embryo te monteren door eerst een oog met behulp van een scherpe wolfraam naald. Snij het weefsel verbinden het oog het eerst knip dan de spieren, en uiteindelijk snijd de oogzenuw aan het oog te verdringen. (Opmerking: als beeldvorming beide kanten gewenst verwijderen beide ogen.)
3. Zodra het oog wordt verwijderd, monteer het embryo op een dekglaasje met behulp van een daling van 3% methylcellulose. Richt het embryo, zodat de kant met het verwijderde oog wordt geconfronteerd met de dekglaasje en is zo dicht mogelijk bij het glas mogelijk. Bedek de hele embryo met methyllcellulose uitdroging tijdens de beeldvorming te voorkomen.
4. Afbeelding gemonteerde embryo onmiddellijk met een omgekeerde confocale microscoop met een hoge kwaliteit 20x Plan Apo objectief (numerieke lensopening = 0,75 of beter). Deze configuratie verdient de voorkeur om een ​​niet-geïnverteerde microscoop die zou vereisen daartussen het embryo tussen twee glazen vlakken, en op de embryo tegen de bovenkant glas.
5. Verzamel optische schijfjes in 1 micrometer stappen van het gebruik van een middelgroot of groot diafragma. Grotere stappen van 2,5 urn kan worden gebruikt, maar het kan moeilijk zijn om de ruimtelijke organisatie van kleinere objecten bepalen. Kleine openingen scherpere details, maar langere scans vereiste bleken EGFP en beperken ook de diepte van de beeldvorming in het embryo kan worden bereikt. Een confocale microscoop maakt beeldvorming ongeveer halverwege een embryo.
6. Als beeldvorming van de hele vis wordt gewenst, verwijder beide ogen in het begin (zie opmerking in stap 3.2), draait het embryo na imaging ene kant en herhaal de stappen 2,3-2,5 voor de andere kant.

3. 3D Reconstructie van embryonale zebravis Cerebrovasculature

1. Gebruik de Fiji distributie ³ van open source ImageJ (http://fiji.sc), die is geoptimaliseerd voor 3D renderings, kosteloos, en compatibel met PC, Mac en Linux-computers.
2. Import confocale stapels naar Fiji door te gaan naar Plugins> LOCI> BioFormats importeur ⁹ selecteer vervolgens de confocale bestand, bijvoorbeeld name.ids voor Nikon stacks (Figuur 2A). Selecteer Bekijk stack met HyperStack, Kleur-modus: grijswaarden, check autoscale, check split kanalen.
3. Deze selecties zullen vier apart kanaal panelen te openen; enige voor EGFP nodig zal zijn, meestal de derde naar beneden. Sluit de andere drie panelen (rood, blauw en alpha) beeld 16-bits waardoor een lange naam gevolgd door C = 1 (Figuur 2A).
4. Pas de drempel door het scannen hoewel het beeld met behulp van de scroll-tab langs de onderkant om een stukje dat de regio of de structuur van belang is te vinden, ga dan naar Afbeelding> Aanpassingen> Drempel (figuur 2C).
5. In het panel dat omhoog komt, schuif de bovenste balk (zwartniveau) naar links zodat de structuur heel goed te zien is op de achtergrond, en laat de onderste schuif (wit-niveau) waar het is (figuur 2D). Selecteer B & W, selecteert Donkere achtergrond. Heeft berekenen Drempel voor elk beeld niet selecteren, tenzij anders aanpassingen nodig zijn voor elk segment, selecteert Zwarte achtergrond. Dit proces creëert nieuwe afbeelding een 8-bit.
6. WAARSCHUWING: Threshold kan niet ongedaan worden gemaakt of opgeslagen in ImageJ, zodat de confocale stack zal elke keer een verandering nodig is om te worden herladen. Noteer de nummers en probeer verschillende instellingen totdat het gewenste resultaat is bereikt.
7. Ga naar Plugins> 3D Viewer> Drempel 0, Resampling factor 1 (beste) of 2 (goed), schakelt u de rode en blauwe kleur dozen aan een groene 3D output maken - anders will produceren een witte rendering - selecteer Apply (niet automatisch) (figuur 2E).
8. Roteren, draaien en zoomen het 3D-beeld met behulp van de muis en het toetsenbord controles (figuur 2F).
9. Opslaan van stilstaande beelden op elk punt met de optie capture in het menu. De grootte van het beeld doos op het scherm dicteert pixelafmetingen van de afbeelding geproduceerd dus als een hoge resolutie gewenst make het vak groter door het slepen van de rechter benedenhoek.
10. Maak een draaiende 3D-film via Beeld> Record 360 graden rotatie (figuur 2G). Rotatie standaard 2 graden per stap, maar het kan worden veranderd tot 5 graden bijvoorbeeld, die veel kleinere bestanden zal leiden, maar kan schokkerige toe te voegen aan de animatie.
11. Sla het bestand op in een van de verschillende beschikbare formaten om later te bekijken met mediaspelers, uploaden naar het internet, of het gebruik in PowerPoint-presentaties. De open source mediaspeler VLC ( http :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), is gratis en behandelt deze video's heel goed.

Resultaten

3D-reconstructie van vasculaire structuren biedt een uitgebreide en visueel interessant perspectief van ontwikkeling van de zebravis. Figuren 1 en 2 tonen methoden zoals ze meestal gedaan. Figuur 3 toont verschillende invalshoeken van vasculaire structuren in een 6 DPF zebravis embryo dat EGFP tot expressie in endotheelcellen. Met een solide groene of witte kleur kan het moeilijk zijn om het signaal intensiteit te waarderen; pseudo-kleuren bieden afbeelding intensiteit van een look-up-tafel en zorgt voor een betere diepte zien wanneer structuren overlappen. Een voorbeeld van een pseudo-gekleurde 3D ​​beeld van de vasculatuur in een 6 dpf zebravis wordt verschaft in Figuur 4. Fluorescentie beeldvorming van levende embryo's kunnen worden gebruikt om fysiologische kenmerken ogen en lichaamsbeweging omvatten bestuderen en hartactiviteit. Figuren 3 en 4 tonen representatieve resultaten verkregen met deze methoden, met behulp van de transgene zebravis lijn beschreven. Imaging resolutie is afhankelijk van microscoop kenmerken, maar de helderheid van het EGFP signaal is voldoende voor een goede beeldkwaliteit met de meeste commerciële systemen. Wederopbouw en weergave van 3D-voorstellingen is consistent en opties binnen deze open-source software bieden consistent goede resultaten.

Figuur 1. Verwijderen Eye. A) Een vast 3 dpf embryo met een wolfraam behoefte gepositioneerd naast het oog. Weefsel wordt gesneden rond het oog van deze positie. B) Het oog is valt uit en de onderliggende oogspieren en oogzenuw worden gesneden. De lege oogkas is aangegeven met gestreepte cirkel. C) Dezelfde embryo wordt omgekeerd en gemonteerd met methyl-cellulose, met de intacte oog naar boven. hres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Stap-voor-stap 3D reconstructie van een confocale afbeelding stapel. A) Open bestand (4104.1.ids) geladen binnen Fiji gebruik Plugins> LOCI> Bioformat aan. B) te selecteren Na het vinden van een schijfje met de regio van belang, drempel aanpassing heeft gekozen, zoals. C) De drempel wordt ingesteld op 214 met behulp van de top schuif en toepassen is geselecteerd. D) 3D-viewer wordt genoemd als afgebeeld. E) De 3D-reconstructie getoond van een zebravis met het oog intact, voor oriëntatie. F) Het beeld is ingezoomd en gedraaid. G) Een 360 graden rotatie film gemaakt zijn. res.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Perspectieven van 3D reconstructie. A) Medial perspectief van 6 DPF embryo afgebeeld met 10x objectief, mond is aan de rechterkant, niet kieuwen in de mond. B) Laterale van hetzelfde embryo, nota vin is een lus in het midden. C) Zelfde embryo afgebeeld met 20x objectief, mediale perspectief, nota kieuw resolutie. D) Laterale perspectief van 20x objectieve beeldvorming. De vin is aan de rechter rand van het paneel. E) Antero-mediaal aanzicht van 20x objectieve beeldvorming, nota kieuwen in de mond. F) Buik van hetzelfde embryo afgebeeld met een 20x doelstelling, het hoofd naar rechts. Opmerking vaatstelsel op de dooierzak in de rechterbenedenhoek.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Intensiteit verschillen in 6 dpf embryo. Afbeelding van een 6 DPF reconstrueren aan de hand van een pseudokleur look-up-table voor de intensiteit van het signaal. Mond, hersenen, kieuwen en dooierzak zijn gelabeld voor oriëntatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5. Filmpje van gereconstrueerde vasculaire systeem in een 4 DPF zebravis. De vis werd in beeld gebracht op 2,5 micrometer. De beelden warenbeeldvorming van de helft van de embryo. Vergelijk vasculaire structuren structuren in een GSI behandelde zebravis verschaft in Figuur 6. Noteer de lagere dichtheid van bloedvaten in het hoofd en grotere kieuwen. (Zie de "Zfish_spin.avi" aanvullend bestand onder Downloads)

Figuur 6. 3D-film van vasculaire systeem in een GSI-behandelde embryo in 4 dpf. De vis werd in beeld gebracht op 2,5 micrometer door van lateraal naar middellijn. Vergelijk vasculaire structuren met de besturing 4 dpf figuur 5 vissen. De gebogen rug en een kleiner formaat zijn typisch in embryo's die met deze chemische stof. (Zie de "GSI-treated_4dpf_fish.avi" aanvullend bestand onder Downloads)

Discussie

De hier beschreven methoden leveren een basis voor visueel onderzoek van het vaatstelsel in het ontwikkelen van de zebravis. Levende exemplaren kunnen worden gebruikt om fysiologische parameters, zoals hartslag en slagvolume beoordelen, terwijl gefixeerde monsters kunnen worden gebruikt voor hoge-resolutie confocale beeldvorming. Drosophila en C. elegans zorgen voor het gehele lichaam, maar zebravis zijn vertebraten en een nuttig model voor gewervelde weefsels, met inbegrip van een endotheelcel beklede bloedvaten. Deze studies kunnen belangrijke transgene lijnen en genomische hulpbronnen te nemen vanuit de zebravis onderzoeksgemeenschap. 3D reconstructie en weergave van confocale beelden van embryonale zebravis, zoals hier beschreven, zorgen voor een systeembiologie aanpak van vasculaire vertakking en bloedvat dichtheid die niet mogelijk is met grotere diermodellen zoals ratten en muizen. Verder, zoals amniotes zebravis ontwikkelen in een veranderbare omgeving (E3 buffer), waar men kan gemakkelijk c toevoegenhemicals die specifieke enzymen of andere processen die vasculaire ontwikkeling beïnvloeden remmen. De concentratie en de timing van chemische levering kan worden gewijzigd, zodat de onderzoeker te fine-tunen van de behandeling.

1. Wijzigingen en het oplossen van problemen

Wijzigingen in dit systeem transgene lijnen zebravis die EGFP of andere fluorescerende eiwitten tot expressie in een verscheidenheid van weefsel, orgaan of regiospecifieke patronen ¹⁰ opgenomen. Verdere analyse van neovasculaire ontwikkeling van de zebravis netvlies is onlangs gepubliceerd ^5. Problemen met de pigmentatie in oudere embryo's en volwassen zebravissen kan worden gecompenseerd door kruising met transgene lijnen die niet produceren schaal pigmenten of retinale pigment. Problemen met verminderde fluorescentie meestal het gevolg zijn van een onjuiste fixatie voorwaarden. Paraformaldehyde (4%) gedurende 1 dag optimaal, maar sterker fixatieven, zoals glutaaraldehyde, osmiumtetroxide of alcohol, kanvernietigen EGFP fluorescentie. Na fixatie moet embryo in PBS bewaard bij 4 ° C en altijd beschermd tegen direct zonlicht.

2. Beperkingen van deze techniek

De kwaliteit en de resolutie 3D renderings geproduceerd met dit protocol afhankelijk van de kwaliteit van de beelden gegenereerd. Lichtinval door middel van deze embryo's is beperkt tot het sagittale middenvlak met een standaard confocale microscoop. Dit aspect van de beeldvorming beperkt de diepte van de beeldvorming bij oudere embryo's en volwassenen, maar meer geavanceerde multi-foton microscopie systemen maken het mogelijk voor de beeldvorming op grotere diepte.

3. Belang met betrekking tot bestaande methoden

Dit protocol stelt een aanpak voor de analyse van netwerken bloedvat op een systeem dat zorgt voor een hele dier kan nemen. Eerdere voorstellingen van deze gegevens vaak ingeroepen reeks samen aangelegd beelden, maar 3D-weergave zorgt voor een betere resolutie van de ruimtelijke relatietionships betrokken.

4. Toekomstige toepassingen

Nieuwe ontwikkelingen in de beeldvorming en weefselverwerking zullen veel nieuwe toepassingen voor deze methoden die kunnen bestaan ​​uit het maken van oudere embryo's of volwassenen transparant ^11-14 bieden. Meer transparantie zal sterk toenemen weefselpenetratie door confocale en multi-foton-lasers. Verder, aangezien de snelheid van camera en fotomultiplicatorbuizen verhogen binnenkort mogelijk om 3D weergaven van de vissen in realtime, die een ^4e dimensie analyse.

5. Kritische stappen

Een cruciale stap in dit protocol is de voorbereiding voor de beeldvorming, die een goede fixatie omvat. Imaging moet zo snel mogelijk na fixatie met een hoge kwaliteit doelstellingen die de beste numerieke openingen beschikbaar hebben. Afhankelijk van de gebruikte beeldvormingssysteem gebruikt zodat hoogwaardige systemen algemeen beter. Het genereren van 3D-renderings vergt veel geheugenvoor zo nieuwere, high-end computers met een grote hoeveelheid geheugen en goede grafische processors worden aanbevolen.

De visuele biologie systeem beschreven is geoptimaliseerd voor transgene zebravis die EGFP expressie in vasculaire endotheelcellen, maar deze werkwijzen kunnen worden aangepast om transgene embryo's die GFP of andere fluorescerende eiwitten tot expressie, in populaties van neuronen, spieren, klieren of een aantal andere cellen. Het grote voordeel van het werken met dit systeem is de mogelijkheid om te onderzoeken wat er in het gehele embryo op enig moment gedurende deze ontwikkelingsfase in vaste en / of levende dieren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
N – Phenylthiourea	Alfa Aesar, catalog #41972		0,2 M in E3 buffer, bewaard bij 4 °C
E3 buffer	Sigma		5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4
Confocal microscope	Nikon		D-EclipseC1 op een Nikon TE-2000U
Glazen bodem schalen	Mat-Tek
GSI IX/DAPT			N-[N-(3,5-Difluorofenacetyl-L-alanyl)]-S-fenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences
24 wel platen	Becton-Dickinson, cat# 351147		BD Falcon
Transfer pipetten	VWR, cat #414004-001		VWR wegwerp transfer pipetten
Methyl-cellulose	Alfa Aesar, cat#43146		3% in E3 buffer
NRD 4/6 Visvoer	Brine Shrimp Direct		Gedroogd
Brineeuwtjes	Brine Shrimp Direct		Levend
Wolfraamdraad	Small Parts # TW-016-60		0,016” OD
Tricaine	VWR # 101107-950		Tricaine methaansulfonaat 250 mg/L in E3 buffer