Procedures voor volledige reconstructie van een prototype voltage-gated kalium kanaal in lipide membranen beschreven. De gereconstitueerde kanalen zijn geschikt voor biochemische assays, elektrische opnamen ligand screening en elektronenmicroscopie kristallografische studies. Deze methoden kunnen hebben algemene toepassingen om de structurele en functionele studies van andere membraaneiwitten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Om de lipide-eiwit interacties in een reductionistische manier bestuderen, is het noodzakelijk om de membraaneiwitten nemen in membranen van goed gedefinieerde lipidensamenstelling. We bestuderen de lipide-afhankelijke gating effecten in een prototype voltage-gated kalium (Kv) kanaal, en de gedetailleerde procedures voor het oplossen van de kanalen zijn uitgewerkt in verschillende membraan systemen. De reconstitutie die rekening houden beide detergent-geïnduceerde fusie van vesicles en het fusie-eiwit / detergens micellen van het lipide / detergens micellen en het van belang is om een evenwichtsverdeling van lipiden bij de eiwit / reinigende / lipiden en detergens / lipide micellen. Onze data suggereerde dat het inbrengen van de kanalen in het lipide vesicles relatief willekeurig oriëntaties en de reconstitutie efficiëntie zo hoog dat er geen detecteerbare eiwitcomplexen werden bij fractionering experimenten. We hebben het reconstrueren benutd kanalen conformationele toestanden van de kanalen te bepalen in verschillende lipiden, opnemen elektrische activiteiten van een klein aantal kanalen opgenomen in vlakke lipide dubbellagen scherm conformatie-specifieke liganden van een faagweergegeven peptidebibliotheek en de groei van kristallen 2D van de kanalen in membranen. De reconstitutie hier beschreven kan worden aangepast voor het bestuderen van andere membraaneiwitten in lipide bilagen, met name voor het onderzoek van de effecten op de lipiden eukaryote voltage-gated ionenkanalen.
Inleiding
Cellen wisselen materiaal en informatie met hun omgeving door de functies van specifieke membraaneiwitten 1. Membraaneiwitten in celmembranen functioneren als pompen, kanalen, receptoren, intramembranair enzymen, linkers en structurele supporters over membranen. Mutaties die de membraaneiwitten invloed zijn gerelateerd aan vele menselijke ziekten. In feite, hebben veel membraaneiwitten de primaire drug targets, omdat ze belangrijk zijn en gemakkelijk toegankelijk zijn in celmembranen. Het is daarom erg belangrijk om de structuur en functie van diverse membraaneiwitten in membranen begrijpen, en maken het mogelijk om nieuwe methoden te ontwikkelen om de nad....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Expressie en zuivering van KvAP kanaal (figuur 1)
- Voorbereiding Werk - Dag 0
- Spoel de glazen kolven voor de bacteriecultuur met gedemineraliseerd water (dih 2 O) en MilliQ H 2 O (MQH 2 O) om spoor van wasmiddel te verwijderen uit algemene afwassen.
- Autoclaaf 1000 ml LB-medium in 2.8 L erlenmeyers (totaal twee-liter cultuur als een voorbeeld hier). Lage hardheid van het water bleek belangrijk te zijn voor de succesvolle kweek van de getransformeerde bacteriën.
- Autoclaaf 100 ml LB-medium in 500 ml flesjes
- Transformeren 60 pi XL1-Blue competente cellen met 200 ng van het plasmide pQE60....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De algemene stroom van de experimenten voor het zuiveren van de KvAP kanaal in biochemische homogeniteit wordt beschreven in figuur 1A. Typische monsters tijdens de expressie en zuivering van het eiwit wordt getoond in de SDS-PAGE gel in Figuur 1B. Het eiwit na de IMAC zuivering relatief zuiver. De opbrengst van de KvAP kanaal ongeveer 1,0 mg / liter kweek.
Oplosbaarheid van lipide blaasjes met reinigingsmiddelen dient te worden uitgewerkt voor elk paar van .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De reconstitutie van de KvAP kanalen in verschillende membranen is gebruikt in verscheidene studies 8-10. Na het idee voor de distributie van lipiden tussen detergens / lipide micellen en de eiwit / reinigende / lipide micellen, kunnen wij nagenoeg volledig oplossen van de KvAP bereiken in membranen gemaakt van zeer verschillende lipiden. Elke tetrameric KvAP kanaal moet ~ 100 vetmoleculen om volledig te dekken zijn transmembraan domein. De belangrijkste voorwaarde is om genoeg vetmoleculen te smelten in de e.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De studies over KvAP in de Jiang lab hebben aanzienlijke hulp verkregen van het laboratorium van Dr Roderick MacKinnon's aan de Rockefeller University. Speciale dank gaat uit naar Dr Kathlynn Brown en Michael McQuire voor hun advies en hulp op onze faag-scherm experimenten. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (GM088745 en GM093271 naar Q-XJ) en AHA (12IRG9400019 naar Q-XJ).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
Referenties
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Galand Science. New York. (2007).
- Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203(2005).
- Lee, A. G.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
