De gist mitochondriale nucleoid eiwit, Mgm101, is een rad52-soort recombinatie eiwit dat grote oligomere ringen vormt. Een protocol wordt beschreven aan oplosbare recombinant Mgm101 bereiden met behulp van de maltosebindingseiwit (MBP)-tagging strategie in combinatie met kationuitwisseling en size exclusion chromatografie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bereiding van de Mgm101 recombinatie eiwit met MBP-based Tagging strategie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De MGM101 gen werd 20 jaar geleden geïdentificeerd voor zijn rol in het onderhoud van mitochondriaal DNA. Studies uit verschillende groepen hebben gesuggereerd dat de Mgm101 eiwit betrokken is bij de reparatie van recombinational mitochondriaal DNA. Recente onderzoekingen hebben aangegeven dat Mgm101 is gerelateerd aan het RAD52 type recombinatie eiwitfamilie. Deze eiwitten vormen grote oligomere ringen en bevordering van de annealing van de homologe enkelstrengs DNA-moleculen. Echter, de karakterisering van Mgm101 gehinderd door de moeilijkheid in het produceren van het recombinante eiwit. Hier is een betrouwbare werkwijze voor de bereiding van recombinant Mgm101 beschreven. Maltose bindend eiwit (MBP)-gelabeld Mgm101 eerst tot expressie in Escherichia coli. Het fusie-eiwit wordt eerst gezuiverd door affiniteitschromatografie amylose. Na zijn vrijlating door proteolytische splitsing, wordt Mgm101 gescheiden van MBP door kationische uitwisselingschromatografie. Monodisperse Mgm101 wordt dan verkregendoor grootte-uitsluitingschromatografie. Een opbrengst van -0,87 mg Mgm101 per liter bacteriekweek kan routinematig verkregen. De recombinant Mgm101 heeft minimale verontreiniging van DNA. De geprepareerde monsters worden met succes gebruikt voor biochemische, structurele en single particle image analyses van Mgm101. Dit protocol kan ook gebruikt worden voor de bereiding van andere grote oligomere DNA-bindende eiwitten die kunnen worden verkeerd gevouwen en giftig voor bacteriële cellen.
Inleiding
Homologe recombinatie is belangrijk voor de reparatie van dubbelstrengige breuken (DSB) en InterStrand verknopingen en de her-initiatie van DNA replicatie van ingestorte replicatievorken 1. In conventionele homologe recombinatie, wordt de centrale reactie gekatalyseerd door de ATP-afhankelijke recombinases zoals RecA in prokaryoten en Rad51 en DMC1 in eukaryoten 1-3. Deze recombinasen vormen nucleoproteïne filamenten ssDNA, die essentieel zijn voor het initiëren homologieonderzoek en streng invasie in duplex DNA-matrijzen (figuur 1, linker paneel) 4-7 zijn. Naast de gebruikelijke regeling kan homologe recombinatie ook plaatsvinden in een RecA/Rad51-independent wijze (Figuur 1, rechter paneel). Zo kan de gist Rad59 eiwitten RAD52 en direct katalyseren het hybridiseren van complementaire ssDNA strengen die worden blootgesteld door wegsnijden van dsDNA onderbrekingen. Deze recombinatie proces, bekend als zingenle streng gloeien, over het algemeen niet gepaard homoloog koppeling met dsDNA templates. Na hybridisatie worden heterologe staarten verwijderd door exonucleasen en nicks worden geligeerd aan genoom continuïteit 8-10 herstellen. Reparatie door de enkele streng gloeien mechanisme wordt vaak vergezeld door deleties van genomische sequenties tussen direct herhaalde regio.
Rad52 behoort tot een diverse groep van recombinatie eiwitten die wijdverbreid onder bacteriofagen 11. Deze eiwitten zijn ook bekend als Single Strand Gloeien Proteins (SSAPs), op basis van hun activiteit bij het bevorderen van de annealing van de homologe enkelstrengs DNA-moleculen. De beste gekenmerkt bacteriofaag SSAPs zijn Redp en Erf uit de bacteriofagen λ en P22, RecT uit de profaag rac en de Sak eiwit uit de lactococcale faag ul36. De SSAPs structureel zijn typische β-β-β-α voudig, hoewel overeenstemming vrijwel undetectkunnen in de primaire sequenties. Ze maken allemaal grote homo-oligomere ringen van 10 - 14 voudige symmetrie in vitro 12-14. De functionele implicaties van deze karakteristieke hogere orde structurele organisatie is niet goed begrepen.
Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen van het mechanisme van homologe recombinatie in het mitochondriaal genoom. We hebben eerder geïdentificeerd MGM101 het gen dat essentieel is voor het behoud van mtDNA in Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 bleek vervolgens worden geassocieerd met mitochondriale nucleoids en is vereist voor de tolerantie van mtDNA aan DNA-beschadigende middelen 16. Echter, de studie van Mgm101 werd weer gehouden in de afgelopen tien jaar door de moeilijkheid om recombinant Mgm101 produceren. We hebben onlangs in geslaagd in het produceren van oplosbare Mgm101 op grote hoeveelheden van E. coli met behulp van de MBP-fusie strategie. Dit heeft ons in staat aan te tonen dat Mgm101 aandelenbiochemische en structurele overeenkomsten met de rad52-familie van eiwitten 17,18. In dit rapport wordt een drie-stappen zuivering procedure beschreven, die homogeen Mgm101for biochemische en structurele analyses (figuur 2) produceert.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Eerdere studies hebben aangetoond dat de eerste amino-terminale 22 resten van Mgm101 worden gesplitst na invoer in mitochondria 19. Voor expressie in Escherichia coli, wordt het MGM101 open leesraam zonder de eerste 22 codons geamplificeerd door PCR en stroomafwaarts geplaatst van de malE sequentie die codeert voor het maltose bindend eiwit (MBP) in een gemodificeerde versie van de expressievector pMAL-C2E. Dit genereert het MBP-Mgm101 fusie met een linker met een splitsingsplaats voor PreScission protease (Figuur 3). Het plasmide wordt eerst gebouwd door het selecteren van E. coli transformanten zonder de IPTG en Xgal blauw / witte selectie. Het resulterende plasmide pMAL-C2E-MGM101 wordt vervolgens in de E. coli stam BL21-CodonPlus (DE3)-RIL door op ampicilline en chlooramfenicol resistente kolonies.
1. Uitdrukking, Inductie, Cell Lysis en DNase I behandeling
- Inoculeren verse transformanten in 10 ml LB medium (1% Bacto trypton, 0,5% gistextract, 1% NaCl) aangevuld met glucose (0,2%), ampicilline (100 ug / ml) en chlooramfenicol (50 ug / ml). Incubeer bij 37 ° CO / N onder schudden bij 200 rpm.
- Inoculeer de 10 ml precultuur in 2 liter van het aangevuld LB-medium zoals hierboven. Groeien de cellen bij 37 ° C onder schudden totdat OD600 0,5 bereikt.
- Induceren expressie van de MBP-Mgm101 fusie-eiwit door toevoeging van isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) tot een eindconcentratie van 0,3 mM. Kweek de cellen onder schudden bij 30 ° C gedurende 5 uur.
- Verzamel de cellen door centrifugatie met behulp van een Beckman JA-10 rotor (5.500 xg, 4 ° C, 10 min). Na weggooien van de supernatant, resuspendeer de celpellet in 30 ml lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 en 1 mM EDTA, pH 7,4) met proteaseremmers (25 uM leupeptine, 1 pM pepstatine A, 1 mM PMSF).
- Ultrasone trillingen celsuspensie op ijs gedurende 20sec met behulp van een ultrasone processor (Heat Systems; Model W-385) bij 50% inschakelduur, laat afkoelen op ijs gedurende 30 seconden, en herhaal 2x.
- Voeg 1 ml DNAse 1 stock bij 2 mg / ml. Schommel cellysaat bij 4 ° C gedurende 2 uur.
- Stel NaCl tot een uiteindelijke concentratie van 500 mM.
- Verwijder de celresten door centrifugatie bij 10.000 xg bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
2. Zuivering met Amylose Affiniteitschromatografie
- Evenwicht 1.5 ml amylose hars (50% suspensie) in de lysisbuffer. Voeg de geëquilibreerd amylose hars het cellysaat. Schommel zachtjes bij 4 ° CO / N.
- Laad het lysaat-harsmengsel op een Econo-kolomchromatografie kolom in een koude kamer geplaatst. Laat de ongebonden eiwitten aan de kolom passeren door de zwaartekracht.
- Was de amylose hars met 300 ml van de wasbuffer I (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, en 0,2 mM PMSF).
- Herhaal het wassen met 150 ml wasbuffer II (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, en 0,2 mM PMSF).
- Voeg 5 ml elutiebuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, en 0,2 mM PMSF, 10 mM maltose) van de kolom, incuberen bij 4 ° C gedurende 10 min, verzamelen het eluaat en herhaal voor meerdere keren.
- Combineer de eluaten Bepaal de opbrengst en zuiverheid van MBP-Mgm101 door het laden van een portie van het eluaat op een SDS-PAGE gel gevolgd door Coomassie-kleuring (figuur 4).
3. PreScission proteasesplitsing en kationuitwisselingschromatografie
- Voeg 50 eenheden van PreScission protease aan het MBP-Mgm101 eluaat. Voer de splitsing bij 4 ° CO / N en deze te blijven tijdens dialyse tegen dialyse buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7,4, en 0,2 mM PMSF)
- Controleer de efficiëntie van splitsing op een SDS-PAGE gel (Figuur 5A).
- Laad de gekliefde MBP-Mgm101 door meerdere injecterenionen op een Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge is aangesloten op een Bio-Rad Biologic DuoFlow FPLC systeem.
- Start de kationenuitwisselingschromatografie door een stap zoutgradiënt van 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM en 1,000 mM NaCl die wordt gemaakt door het mengen van buffer A (5 mM NaCl, 10 mM Na-fosfaat, pH 7,2, 1 mM PMSF) en buffer B (1 M NaCl, 10 mM Na-fosfaat, pH 7,2, 1 mM PMSF). Stel het debiet van 0,5 ml / min. Verzamel de Mgm101 fractie en controleer de zuiverheid van het eiwit op een SDS-PAGE gel (Figuur 5B).
4. Size Exclusion Chromatography
- Combineer de eiwitfracties van kationenuitwisselingschromatografie. Dialyseer het eiwit in GF equilibratiebuffer (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 5 mM 2-mercaptoethanol, 0,2 mM PMSF).
- Concentreer het eiwit met Vivaspin 15R Ultrafiltratie spinkolom om het volume op ~ 1 ml verminderen spinnen bij 3000 xg bij 4 ° C.
- Laad Mgm101 ona gekalibreerde Superose 6 prep kwaliteit kolom geëquilibreerd met chromatografie buffer (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,2 mM PMSF).
- Start de grootte uitsluiting met de chromatografie buffer draaien bij een debiet van 0,5 ml / min.
- Het verzamelen van de fracties van het gezuiverde Mgm101 pieken. Laad aliquots van de fracties op een 12% SDS-PAGE voor het controleren van de uiteindelijke kwaliteit van het eiwit.
- Concentreer het eiwit met Vivaspin 6, dan snel bevriezen van de monsters in vloeibare N2 en bewaar bij -80 ° C.
- Gebruik Mgm101 monsters na 6-12 maanden ssDNA-binding assay (figuur 8) en structurele visualisatie door transmissie-elektronenmicroscopie (Figuur 9).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Mgm101 een RAD52-gerelateerde recombinatie eiwit in mitochondria. Rad52 is uitgebreid bestudeerd om zijn rol in het mitochondriaal DNA recombinatie (Figuur 1). Recombinant Mgm101 kunnen worden bereid door een drie-stappen-procedure (figuur 2). Dit wordt vergemakkelijkt door het gebruik van het MBP-tagging strategie waarmee Mgm101 worden uitgedrukt in een oplosbare vorm en vervolgens het label vrijgegeven door proteolytische splitsing (figuur 3).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het is een uitdaging om een stabiele, inheemse recombinant Mgm101 eiwit uit E. coli mogelijk vanwege zijn onoplosbaarheid in bacteriële cellen. In dit verslag tonen we dat het MBP-fusie-strategie kan het eiwit op een redelijk hoog niveau tot expressie. Door negatieve kleuring transmissie-elektronenmicroscopie en gelpermeatiechromatografie, hebben we eerder aangetoond dat de MBP-fusie-eiwit vormt oligomeren uniform in vitro 18. Het is mogelijk dat de vouwen en oligomerisatie van Mgm101 langza...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij danken Stephan Wilkens voor hulp bij transmissie elektronenmicroscopie. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant R01AG023731.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Expressievector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cellen | Strategene | #230245 | |
| Leupeptine | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylosehars | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatografiekolom | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltratiespinkolom (10.000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade kolom | Amersham Biosciences | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltratiespinkolom (5.000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
Referenties
- San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
- Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
- Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
- Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
- Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
- Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
- Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
- Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
- Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
- Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
- Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
- Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
- Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
- Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
- Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
- Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
- Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
- Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
- Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
- Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
- Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
