Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Transplantatie in de voorste kamer van het oog voor Longitudinaal, niet-invasieve

13.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50466

⸱

10 maart 2013

 ,  , 
1Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Medicine, University of Miami Miller School of Medicine, 4Department of Physiology & Biophysics, University of Miami Miller School of Medicine, 5The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet

In dit artikel

Samenvatting

Een nieuwe benadering van het combineren van de intra-oculaire transplantatie en confocale microscopie maakt longitudinale, niet-invasieve real-time beeldvorming met single-cell resolutie binnen geënt weefsels In vivo. We laten zien hoe je pancreaseilandjes transplantatie in de voorste kamer van de muis oog.

Samenvatting

Intravitale beeldvorming heeft zich ontpopt als een onmisbaar instrument in biologisch onderzoek. In dit proces hebben vele beeldvormende technieken ontwikkeld om verschillende biologische processen bij dieren niet-invasief. Een groot technische beperking in bestaande intravitale beeldvorming is het onvermogen om non-invasieve, longitudinale beeldvorming te combineren met eencellige mogelijke resolutie. We laten hier hoe transplantatie in de voorste kamer van het oog zulke belangrijke beperking aanbieden van een veelzijdig experimenteel platform dat niet-invasieve, longitudinale beeldvorming met cellulaire resolutie in vivo mogelijk omzeilt. We tonen de transplantatie procedure in de muis en representatieve resultaten leveren met een model met klinische relevantie, namelijk eilandjes van Langerhans transplantatie. Naast directe visualisatie mogelijk in diverse weefsels getransplanteerd in de voorste kamer van het oog, deze benadering biedt een platform voor screen drugs door het uitvoeren van lange-termijn follow-up en de controle in de te onderzoeken weefsels. Door zijn veelzijdigheid, weefsel / cel transplantatie in de voorste kamer van het oog komt niet alleen transplantatie therapieën, dat zich uitstrekt tot andere in vivo toepassingen bestuderen fysiologische en pathofysiologische processen zoals signaaltransductie en kanker of auto-immuunziekte ontwikkeling.

Inleiding

Advances in intravitale microscopie gebleken fysiologisch niet voorspeld door in vitro studies 1. Dit benadrukt de uitdaging in het vertalen van bevindingen verkregen door conventionele in vitro methoden in het levende dier. In het laatste decennium werd visualisatie van weefsels in levende dieren aanzienlijk verbeterd door technologische vooruitgang in beeldvormingsmodaliteiten 2, 3, 4, 5, 6. Dit heeft aangezet tot een behoefte aan in vivo imaging aanpak met haalbare toepassing in experimentele diermodellen longitudinale visualisatie van doelweefsels niet-invasieve toestaat.

Beeldvormende technieken zoals magnetische resonantie beeldvorming en positron emissie tomografie of bioluminescentie in staat hebben gesteld niet-invasieve beeldvorming van organen / weefsels diep in het lichaam 7-8, 9. Deze technieken kunnen worden gedaan cel resolutie door hoge achtergrondsignalen en lage ruimtelijke resolutie, ondanks het gebruik of hoog contrast materiaal of weefsel-specifieke luminescentie 4. Dit werd behandeld met de komst van twee-foton fluorescentie confocale microscopie 10. Twee-foton microscopie ingeschakeld intravitale imaging studies te visualiseren en cellulaire gebeurtenissen te kwantificeren met ongekende detail 11, 12. Dit heeft geleid tot de karakterisering van de belangrijkste biologische processen bij gezondheid en ziekte 13, 14, 15, 16. Terwijl baanbrekende intravitale imaging studies hebben voornamelijk "nagebootst" in vivo omstandigheden uitgesneden weefsel (bijvoorbeeld lymfeknopen) hebben andere studies gebruikt invasieve benaderingen beeld blootgesteld doelweefsels in situ 17, 18, ​​19, 20, 21. Andere studies hebben ook "venster kamer modellen" van de beperkingen in verband met invasieve benaderingen en beperkte beeldvorming resolutie in vivo 22, 23, 24, 25 te omzeilen. In het venster kamermodel wordt een kamer met een transparant venster chirurgisch geïmplanteerd in de huid diffehuur locaties (dorsale of oor huid, uiervet pad, lever, enz.) op het dier (bijv. muis, rat, konijn). Hoewel deze benadering duidelijk maakt hoge-resolutie in vivo imaging, vereist een invasieve operatie te implanteren de kamer en kan niet in staat zijn longitudinale imaging studies gedurende enkele weken of maanden 22 passen.

Het werd onlangs aangetoond dat het combineren van hoge resolutie confocale microscopie met een minimaal invasieve procedure, namelijk transplantatie in de voorste kamer van het oog (ACE) een 'natuurlijke lichaam window "bepaalt een krachtige en veelzijdige in vivo imaging platform 26, 27. Transplantatie in het ACE is gebruikt in de afgelopen decennia biologische aspecten van verschillende weefsels 28, 29, 30 bestuderen en de recente combinatie met hoge resoluties mogelijk de fysiologie van pancreaseilandjes met enkele cel resolutie niet invasief en longitudinaal 26, 27. Deze benadering werd gebruikt om auto-immuunreacties studie tijdens de ontwikkeling van type 1 diabetes in diermodellen (ongepubliceerde gegevens). Het werd ook gebruikt om alvleesklier ontwikkeling te bestuderen, en in studies van nierfunctie door transplantatie in de ACE alvleesklier knoppen of individuele glomeruli respectievelijk (ongepubliceerde gegevens). In een recent rapport met behulp van deze aanpak verder aangetoond de toepassing ervan op de immuunrespons studeren na eilandjes van Langerhans transplantatie 31. Belangrijker dit onderzoek bleek dat transplantatie in de voorste kamer van het oog een natuurlijke lichaam venster te voeren: (1) longitudinaal, niet-invasieve beeldvorming van getransplanteerde weefsels in vivo, (2) in vivo cytolabeling om cellulaire fenotype en levensvatbaarheid in beoordelen situ, (3) real-time tracking van infiltrerende immuuncellen in het doelweefsel, en (4) de lokale ingrijpen door topische applicatie of intra-oculaire injectie.

Hier hebben we demonstrate hoe transplantatie uit te voeren in de voorste kamer van het oog met behulp van pancreatische eilandjes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De volgende procedure wordt uitgevoerd onder de stereoscoop in 2 stappen, de eerste stap is het plaatsen van de eilandjes in de canule en de tweede stap is het daadwerkelijk transplantatie in het ACE. Alle procedures uitgevoerd op dieren werden goedgekeurd door de institutionele dierlijke zorg en gebruik commissie (IACUC) van de Universiteit van Miami.

1. Laden Eilandjes in Canule voor Transplantatie

  1. Centreer de eilandjes in cultuur schotel door het draaien van de schotel in vernauwing kringen.
  2. Koppel de canule van het "reservoir" en plaats de canule en het aansluiten van leidingen op een schoon oppervlak. Het reservoir kan worden vervaardigd uit een 300 pl plastic wegwerp pipet zonder filter (figuur 1a).
  3. Spoel luchtbellen uit het reservoir naar continue stroom van eilandjes waarborgen bij aspireren in het reservoir. Spoelen van de reservoir wordt gedaan door het aansturen van de hands-free gemotoriseerde injectiespuit-aandrijver met behulp van het voetpedaal(Figuur 1b, c). Dit zal ook ruimte in de injectiespuit om aspiratie van de eilandjes kunnen in het reservoir (voorgeladen met steriele oplossing zoals een zoutoplossing, PBS of kweekmedia).
  4. Zuig gewenste hoeveelheid eilandjes in het reservoir. Eilandjes de neiging om werveling als ze in het reservoir en elkaar blijven naar beneden. Aspiratie wordt gedaan door het rijden achteruit de gemotoriseerde injectiespuit-aandrijver met behulp van het voetpedaal.
  5. Sluit de canule om het reservoir via de verbindingsslangen.
  6. Plaats de canule tip weer in de kweekschaal en spoel de eilandjes uit het reservoir in de buis dan in de canule. Zorg ervoor dat samen eilandjes blijven als u de slang / canule back-vullen door voorzichtig "vegen" (tikken) van de buis (figuur 1d). Stop vóór of na luchtbellen vóór de eilandjes worden weggespoeld de canule. Als het niet zeker, stoppen als eilandjes op de achterkant van de canule in te voeren als de resterende luchtbellen voor op eilandjes kan helpen voorkomen dat reflux (terugstroom) van eilandjes uit de ACE. Zal 's nachts af te voeren.
  7. In dit stadium, bent u klaar om de eilandjes te injecteren in het ACE (zie volgende stappen).

2. Islet Transplantation in de voorste kamer van het oog

  1. Plaats de verdoofde muis op een warme pad onder stereoscoop.
  2. Plaats de snuit van de muis in anesthesie "mask" verbonden met zuurstof / isofluraananesthesie machine. Het masker is gemaakt van een 1 ml plastic wegwerp pipet (zonder filter) en verbonden met verdoving slang door het dunne uiteinde (figuur 2a, b).
  3. Voorzichtig terug te trekken van de oogleden van het oog te transplanteren met behulp van de wijsvinger en duim van de vrije hand en "pop" de ogen open voor een betere belichting en gemakkelijke toegang (figuur 2c). Dit vereist enige oefening te perfectioneren zonder belemmering van de ademhaling van de muis door overmatige druk op denek of blokkeren de bloedstroom naar het hoofd.
  4. Met een disposable insulinespuit (29 - 31G) als scalpel zorgvuldig dringen slechts de tip in de cornea en een enkele laterale incisie. Maak de insnijding midden tussen de top van het hoornvlies en limbus met reflux van de eilandjes te minimaliseren tijdens injectie van het ACE (figuur 2d).
  5. Steek de canule (voorgeladen met eilandjes) door de incisie.
  6. Langzaam uitwerpen eilandjes van de canule en neer te leggen bovenop de iris. Om eilandje reflux door overmatige drukopbouw in de ACE voorkomen, verwijdert de eilandjes in korte stoot in slechts volume (s) mogelijk in het kwadrant tegenover de incisie. Dit kan verder worden gewaarborgd door het verdichten van eilandjes in de slang tijdens het laden van de canule (zie stap 1.6).
  7. Langzaam trekken de canule uit de ACE. Dit is een kritieke stap, vooral wanneer een grote hoeveelheid eilandjes werd geïnjecteerd als eilandje reflux door preszeker opbouwen in de ACE kan onvermijdelijk zijn. Om een ​​einde te / minimaliseren eilandje reflux, voorzichtig draai de canule, terwijl in de ACE overdruk via de incisie rond de canule los te maken. Controleer op tekenen van reflux als u probeert om de canule te trekken en, indien nodig, tot de druk verdwijnt wachten voordat volledig terugtrekken van de canule uit de ACE.
  8. Spoel de getransplanteerde oog met steriele PBS of zoutoplossing.
  9. Injecteer buprenorfine voor post-operatieve analgesie (0,05-0,1 mg / kg, subcutaan) voor de eerste 48 uur.
  10. Breng erytromycine oogheelkundige antibiotische zalf op de getransplanteerde oog onmiddellijk na de transplantatie.
  11. Plaats het dier in een kooi verwarmd om het herstel van anesthesie mogelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Er zijn een paar parameters die een "goede" transplantatie te definiëren. Een goede transplantatie is er een die verloopt zonder bloeden bij het maken van de snede te zien in de video. Bloeden wordt voorkomen / geminimaliseerd door te dringen slechts het topje van de scalpel (naald) in de ACE (figuur 3a). Dit zal ook helpen voorkomen dat contact en punctie van de iris. Het zal ook zorgen voor een kleine incisie die zeer goed te genezen zonder dat vertroebeling van het hoornvlies in de tijd

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Murine pancreatische eilandjes werden geïsoleerd met collagenase digestie gevolgd door zuivering op dichtheidsgradiënten, zoals eerder 33 beschreven. Geïsoleerde eilandjes werden overnacht gekweekt voor transplantatie. Hoewel dit niet vereist, verdient het aanbeveling om de eilandjes te herstellen van de isolatieprocedure. Dit is essentieel bij transplantatie wordt uitgevoerd in diabetische ontvangers als het ervoor zal zorgen transplantatie te overleven / robuuste eilandjes.

Tran...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

PO.B. is een van de oprichters van het biotechbedrijf Biocrine, die gaat naar de voorste kamer van het oog te gebruiken als een commercieel service platform. AC op de octrooibescherming deze technologie.

Dankbetuigingen

Wij erkennen Drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier en Daniel Nyqvist voor vruchtbare gesprekken. We danken ook Eleut Hernandez en Diego Espinosa-Heidmann voor technische bijstand, en Mike Valdes en Margaret Formoso voor hulp bij video-opname. Byron Maldonado opgenomen, bewerkt en geproduceerd de uiteindelijke video. Ondersteuning van het onderzoek werd aangeleverd door het Diabetes Research Institute Foundation ( www.DiabetesResearch.org ), de NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 aan MHA, NIH RO3DK075487 naar AC; U01DK089538 te PO.B.). Aanvullend onderzoek ter ondersteuning van PO.B werd voorzien met middelen uit het Karolinska Institutet, de Zweedse Research Council, de Zweedse Diabetes Foundation, de familie Erling Persson-Stichting, de familie Knut en Alice Wallenberg Foundation, de Skandia Insurance Company Ltd, TRILLENDE ( FP7-228933-2), Strategic Research Program in Diabetes bij Karolinska Institutet, de Novo Nordisk Foundation, en de Berth von Kantzow's Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het reagens Vennootschap Catalogusnummer Omschrijving / opmerkingen
IsoTHESIA (Isofluraan) Buttler Animal Health Supply 11695-6775-2 99,9% isofluraan / ml
Ketaset (Ketamine HCL) Fort Dodge Animal Health 0856-2013-01 Alternatieve injecteerbare anesthesie
Beprenex (Buprenorfine HCL) Reckitt Benckiser Gezondheidszorg (UK) Ltd 12496-075-7-1 0,3 mg / ml
Erythromycine oogzalf USP, 0,5% Akron 17478-070-35 Profylactisch toegepast op getransplanteerde oog
0,9% natriumchloride (zout) Hospira Inc 0409-7983-03 Voor iv injectie. Steriel
PBS Gibco 10010-023 1X. Steriel
CMRL medium 1066 Cellgro 98-304-CV Aangevuld, CIT wijziging. Aanbevolen media voor eilandjes

Referenties

  1. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
  2. Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival - a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
  3. Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
  4. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
  5. Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
  6. Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
  7. Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
  8. Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
  9. Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
  10. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  11. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
  12. Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  13. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
  14. Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
  15. Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99(2011).
  16. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
  17. Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of 'color-coded' effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
  18. Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
  19. Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732(2010).
  20. Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
  21. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678(2008).
  22. Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
  23. Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
  24. Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit's ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
  25. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
  26. Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  27. Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
  28. Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, Suppl 14. 1082(1959).
  29. Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
  30. Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
  31. Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
  32. Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
  33. Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Transplantatie van de voorste oogkamertransplantatie van pancreaseilandjesbeeldvorming van het muisenzoglongitudinale in vivo beeldvormingintravitale beeldvormingstechniekprocedure voor het vullen van de canulegemotoriseerde spuitdrivermethode voor hoornvliesincisietransplantatie van oogweefsel
Transplantatie in de voorste kamer van het oog voor Longitudinaal, niet-invasieve
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.