Analyse van vestibulaire haar celfunctie wordt bemoeilijkt door hun locatie diep in het moeilijkste deel van de schedel, de petrous temporale bot. Meest functionele haarcellen studies hebben acuut gebruikt geïsoleerde haarcellen. Hier beschrijven we een semi-intacte bereiding van muis vestibulaire epitheel voor elektrofysiologische en twee-foton microscopie studies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Geà ¯ soleerde semi-intacte Voorbereiding van de muis Vestibulaire Sensory epitheel voor elektrofysiologie en hoge-resolutie twee-foton microscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Inzicht vestibulaire haarcellen functioneren onder normale omstandigheden, of hoe trauma, ziekte en veroudering deze te verstoren is een essentiële stap in de ontwikkeling van preventieve benaderingen en / of nieuwe therapeutische strategieën. Toch hebben de meeste studies kijken naar abnormale vestibulaire functie niet op cellulair niveau geweest, maar vooral gericht op gedrags-assays van vestibulaire disfunctie, zoals gang analyses en vestibulo-oculaire reflex prestaties. Hoewel dit werk heeft waardevolle gegevens over wat er gebeurt als er iets misgaat opgeleverd, is weinig informatie die verkregen wordt met betrekking tot de onderliggende oorzaken van disfunctioneren. Van de studies die zich richten op de cellulaire en subcellulaire processen die vestibulaire functie ten grondslag liggen, de meeste hebben zich op acuut geïsoleerd haarcellen, verstoken van hun synaptische verbindingen en ondersteunende cel milieu. Daarom is een grote technische uitdaging toegang tot de uiterst gevoelig vestibulaire haarcellen geweest in een prepreiding, dat is tenminste verstoord, fysiologisch. Hier laten we zien een semi-intacte voorbereiding van de muis vestibulaire sensorische epitheel dat de lokale micro-omgeving behoudt waaronder haarcel / primaire afferente complexen.
Inleiding
Ondanks de belangrijke bijdrage van het evenwichtsorgaan aan ons dagelijks leven, een duidelijk begrip van de processen die verantwoordelijk zijn voor de waargenomen achteruitgang van vestibulaire functie met de leeftijd blijven ongrijpbaar. Een reden voor dit gebrek aan kennis is dat daling van vestibulaire functie is vrijwel uitsluitend werd onderzocht met behulp van gedrags-assays, waaronder de vestibulo-oculaire reflex (VOR), een nauwkeurige indicator van extrinsieke vestibulaire functie, maar biedt beperkte inzicht in de veranderingen van de intrinsieke componenten . Dit is een belangrijke belemmering voor ons begrip van vestibulaire haar cel functie in gezondheid, ziekte of veroudering.
Hoewel er veel studies van individuele vestibulaire haarcellen zijn, is een ernstige tekortkoming is de afhankelijkheid van acute haarcel preparaten die haarcellen en zelfs kelk afferente terminals uit hun normale omgeving worden verwijderd door mechanische en / of enzymatische behandeling. Dergelijke benaderingen onvermijdelijkebly verstoren de delicate microarchitectuur tussen haar cel en kelk, en haar cel en ondersteunende cel. Met de ontwikkeling van semi-intacte preparaten 1-5 en een geïsoleerde muis labyrint bereiding 6, is er nu een mogelijkheid om de verschillende vormen van synaptische communicatie bestuderen onder omstandigheden die sterker lijken op die in vivo. Inderdaad, Lim et al.. (2011) toonde duidelijke verschillen in gehele cellen stromen opgenomen met acuut geïsoleerde type I vestibulaire haarcellen vergelijking met die welke bleven ingebed in de neuroepithelium. Concreet wordt gedacht aan kalium ophopen in de intercellulaire ruimte, tussen de haren cel en kelk afferente en aanzienlijk veranderen haar cel respons 7. Dit soort informatie zou onmogelijk te verkrijgen zonder dat de semi-intacte voorbereiding van de vestibulaire sensorische epitheel hier beschreven zijn. We tonen de semi-intacte voorbereiding van de muis crista 3, En tonen representatieve resultaten van whole-cell patch elektrofysiologie, en twee-foton calcium beeldvorming.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Dieren
- Muizen werden verkregen van de Australische Knaagdieren Centre (ARC, Perth, Australië) en hield aan de Universiteit van Sydney Bosch Animal Facility op een normale 12-uur licht / donker cyclus met het milieu verrijking. Alle experimenten beschreven werden goedgekeurd door de Universiteit van Sydney Animal Ethics Committee.
- Mannelijke en vrouwelijke muizen (C57/Bl6) werden gebruikt voor alle experimenten aangezien deze stam wordt gebruikt als achtergrond voor genetische manipulatie, en gelijkwaardige wildtype 8-9 kan worden beschouwd.
2. Tissue Voorbereiding
- Bereid 300 ml van een glycerol-based kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) bestaande uit (in mM): 26 NaHCO3, 11 glucose, 250 glycerol, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2PO 4, 1,2 MgCl2, CaCl2 en 2.5. Voorafgaand aan de toevoeging van CaCl2, gas de oplossing met carbogeen (95% O2 en 5% CO2) om vast apH van 7,4 en voorkomen dat calcium neerslag (troebeling). Bevries de oplossing in een -80 ° C vriezer gedurende 45 min zodat een ijs slurrie wordt gevormd.
- Diep verdoven muizen met ketamine (100 mg / kg) (Parnell, Alexandria, Australië) via een intraperitoneale injectie.
- Zodra achterste ledematen snuifje reflexen zijn afwezig decapitate muizen met scherp roestvrij stalen schaar en maak een sagittale incisie in de huid met behulp van een scheermesje (afgerond # 22) om de schedel bloot te leggen. Op dit punt en het hele stappen 2,3-2,8 de neurocranium, hersenen, en de onderliggende vestibulum zo koel mogelijk door regelmatige toepassing van ijskoude ACSF over het weefsel moeten worden gehouden.
- Met behulp van de puntige arm van standaard patroon schaar (FST, North Vancouver, Canada) maakt een kleine incisie in de schedel bij Lambda en snijd langs de pijlnaad. Zorg ervoor dat de hersenen niet "gesleept" door de schaarblad tijdens deze stap.
- Zorgvuldig verwijderen van de pariëtale botten weg lateraal en de occipitale bot posteriorly behulp van ondiepe bocht pearson rongeurs (FST).
- Een kleine roestvrijstalen spatel wordt vervolgens gebruikt om de hersenen til van het oppervlak van de middelste en achterste craniale fossae, en de blootgestelde vestibulocochlea zenuw (CNVIII) snijden halverwege tussen het binnenoor en de hersenstam met een paar fijne iris schaar. Snijden deze zenuw minimaliseert onnodige spanning op axonen van de primaire afferenten en hun connecties met haarcellen.
- Na doorsnijding van GN VIII de hersenen wordt verwijderd in toto.
- Het vestibulaire labyrint is nu duidelijk zichtbaar in het midden craniale fossa, met het slakkenhuis wijzen anteromedially. Rongeur weerszijden van de vestibulaire labyrint voordat zachtjes weg te snijden door het vastgrijpen van de voorste halfronde gracht en lateraal trekken.
- Dompel de weggesneden labyrinten (figuur 1) in een dissectie schotel met de ijskoude, voortdurend vergast ACSF in paragraaf 2.1 beschreven. Onder een stereomicroscoop, houdt het labyrint tede bodem van de schotel door het vastgrijpen van de cochlea. Gebruik fijn pincet om weg te krassen op het bot bovenop de voorste halfronde gracht ampul. Zodra een klein gaatje in het bot wordt bereikt begint te flick het bot weg van de ampul. Voorzichtigheid is geboden niet aan de tang duwen door het bot, want dit kan schade aan de onderliggende membraneuze labyrint en sensorische epitheel veroorzaken. Ga door met deze procedure totdat zowel de voorste en de aangrenzende horizontale halfronde membraneuze leidingen en ampullen worden blootgesteld (Figuur 2).
Figuur 1. De geïsoleerde muis vestibulaire labyrint. A. Linkerpaneel) Schematische weergave van de geïsoleerde muis vestibulaire labyrint. Belangrijke referentiepunten voor de toegang tot de vestibulaire sensorische epitheel, het slakkenhuis, anterior, en horizontale halfcirkelvormige kanalen zijn labeLED. Sterretjes geven de halfronde gracht ampul met daarin de vestibulaire sensorische epitheel. B. Rechter paneel) Photomicrograph van de geïsoleerde vestibulaire labyrint van een 1-maand-oude muis.
Figuur 2. Blootstelling van de membraneuze vestibulaire labyrint. Het bot bovenop de voorste en horizontale halfcirkelvormige kanaal ampullen zijn gekrast weg naar de zwart / bruin-gespikkelde membraneuze ampullen en bijbehorende ampullaire zenuwen (CNVIII) te onthullen. Het schema in het onderste paneel geeft de structuren in het gemarkeerde gebied van de microfoto toont en de relatie van de booggang afvoersystemen naar ampullen en CNVIII.
- Met behulp van fijne tang, til de ampullen en de bijbehorende utricle weg van het benige labyrint, ervoor te zorgen dat de centrale regio van de ampullen (containing de sensorische epitheel) niet wordt beschadigd. In sommige gevallen moet het proximale deel van de halfronde membraneuze kanaal te snijden met een schaar om de iris ampullen vrij uit het bot.
- Breng de triade met de twee ampullen en utricle in een petrischaal gevuld met Leibovitz L-15 kweekmedium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Gebruik een glasvezel naar "backlight" het weefsel. Dit maakt duidelijke visualisatie van de crista met de sensorische epitheel binnen de ampullen.
- Maak voorzichtig een incisie in de gespikkelde "dak" van de utricle met de fijne iris schaar. Ga door met deze incisie door het dak van de voorste en vervolgens de horizontale ampullen. Maak de insnijding zo dicht bij de rand van het sensorische epitheel mogelijk zonder in aanraking te brengen (Figuur 3A). Zorg ervoor dat er geen stukjes membraan bovenop de sensorische epitheel (figuur 3B)
- Breng de geïsoleerde semi intact voorbereiding op een klein glass-bodem opname kamer gevuld met L-15 media. Verzwaren van de bereiding met behulp van een raster van fijne nylon vezels bevestigd aan een afgeplatte U-vormige platina draad (Figuur 3B). Idealiter zou de vezels van het rooster niet bedekken de sensorische epitheel, maar in sommige gevallen meer stabiel moet een enkele vezel doorsnijden het sensorische epithelium misschien voorkeur.
Figuur 3. De semi-geïsoleerde intacte voorbereiding van het vestibulaire sensorische epithelium. A. Schematische weergave van de semi-intacte voorbereiding en elektrodenconfiguratie. De ampul bovenop de crista heeft "de dak" aan het oppervlak van het sensorische epitheel (groen) blootgesteld geweest. B. Microfoto van de semi-intacte "triade" preparaat met de voorste (ac) en horizontale (hc) crista (utricle verduisterd wordenachterpoten ac). Let op de nylonvezels wordt bij het bevestigen aan de basis van de opname kamer. Schaalbalk:. 100 micrometer C. Een registratie-elektrode geplaatst op individuele vestibulaire haar cel. Schaalbalk: 15 micrometer.
3. Elektrofysiologie
- Perfuseren de semi-intacte voorbereiding met continu zuurstof L-15 medium. Het medium bevat een pH indicator (fenolrood) en de kleur van het medium in de opnames worden gecontroleerd. De pH met zuurstof moet 7,3-7,4 en overeenkomen met een rode kleur.
- Bereid opname pipetten van 1,5 mm (1,19 mm ID) borosilicaatglas met een tweestaps protocol (warmte stap 1: 72, en warmte stap 2: 50) op een micropipet trekker (Narishige, Japan, model PP-830) te komen tot een uiteindelijke impedantie van 3-4 MQ.
- Vul de schacht van de pipet met 3-4 mm van kalium-fluoride gebaseerde interne oplossing bevattende (in mM) 110 KF, 12 KCl, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl2,3 D-glucose, 2 en Na-ATP, pH 7,4 met KOH.
- Wikkel de schacht van de pipet 2-3 keer en zo ver tot de top mogelijk met een dunne strook van parafilm op de elektrode isoleert en vermindering pipet capaciteit.
- Plaats de pipet over de sensorische epitheel onder lage vermogen vergroting (5X) op een rechtopstaande microscoop (Olympus BX51). Schakel over naar een hoog vermogen (40x) en individuele vestibulaire haarcellen met een bijgevoegd CCD-camera te visualiseren.
- Positie pipet op het membraan van een gevisualiseerd haarcel (figuur 3C) met een micromanipulator (Sutter Instruments, California, USA). Zodra een gigaohm afdichting wordt bereikt, breken de celmembraan met een kleine hoeveelheid negatieve druk uitgeoefend via een aanzuigopening van de pipet houder.
- Voeg whole-cell voltage clamp middels standaardtechnieken 8-9.
4. Twee-foton microscopie
- Bereid een 0,9% zoutoplossing met 5 mM Oregon Green488 BAPTA-1 (OGB-1; hexapotassium zout, Invitrogen, Duitsland).
- Hoewel nog steeds onder water, plaats de "de-dak" semi-intacte triade voorbereiding op een klein stukje filtreerpapier (4x4 mm, 0,8 micrometer dik; Millipore, Duitsland) ervoor te zorgen dat de sensorische epitheel is vrij van boven.
- Breng het filtreerpapier en voorbereiding op de zoutoplossing behandeld base platina-elektrode (7 ui) van een electroporator bestaande uit de combinatie van een pulsgenerator en een breedbandige versterker en deksel met een verdere 5 ui 5 mM oplossing van de synthetische calcium indicatorkleurstof Oregon Green 488 BAPTA-1 (Figuur 4).
Figuur 4. Bulk elektroporatie. A. schematisch weergegeven dwarsdoorsnede van elektroporatie configuratie. De semi-intacte preparaat (*) is geplaatst op een stuk filtreerpapier gedompeld in calcium dye (Oregon Green 488 BAPTA-1) en stroom aangelegd tussen 2 platina elektroden. Aangepast van Briggman en Euler, 2011 10.
- Breng de bovenste platina-elektrode parallel met de basis-elektrode op een afstand van ongeveer 2 mm, voorzichtig de oriëntatie van het preparaat niet te verstoren bij contact met de Oregon Green 488 BAPTA-1 oplossing wordt bereid.
- Passeren een korte stroomstoot over de voorbereiding (Parameters voor de huidige, 13 V, 10 msec pulsbreedte, 1 Hz, 10 blokvormige pulsen) 10-11.
- Op de bodem van een glazen bodem opname kamer gevuld met L-15 medium, zet een klein beetje siliconenolie en plaats de semi-intacte voorbereiding op het, zorgt op de sensorische epitheel is vrij van boven. Om stabiliteit in het hele beeldvorming zorgen, vervang dan de nylon raster over het preparaat zoals hierboven beschreven (zie punt 2.13).
- Met behulp van de twee-foton microscoop maakt optische opnames van spontanetane calcium activiteit in het sensorische epitheel (Figuur 7) met standaard beeldvormingsprotocollen 10-11.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De elektrofysiologische eigenschappen van vestibulaire haarcellen afhankelijk complex microarchitectuur waarin ze ingebed 7. Figuur 5 toont dat de semi-intacte vestibulaire epitheel preparaat kan worden gebruikt om onderscheid tussen type I haarcellen (figuur 5A), type II haarcellen (figuur 5B) en de kelk primaire afferente (figuur 5C) gebaseerd op eigenschappen gehele cel geleidingen. Deze kenmerken zijn een uitgesproken "sag" tijd...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De mechanismen die ten grondslag liggen aan onze evenwichtsgevoel hebben weinig aandacht gekregen in vergelijking met andere sensorische systemen, zoals de visuele en auditieve systemen. Van de studies die veranderingen in vestibulaire of balans functie hebben onderzocht, de meeste zijn gericht op gedragsmaatregelen waaronder de vestibulo-oculaire reflex, met onvolledige kennis van de fundamentele bouwstenen van de balans-de vestibulaire haarcellen zelf. De studies die hebben zich geconcentreerd op de haarcelle...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Financiering voor dit werk werd geleverd door een Garnett Passe en Rodney Williams Memorial Foundation Project subsidie aan R. Lim en AJ Kamp.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A |
Referenties
- Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
- Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).
- Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).
- Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).
- Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).
- Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
- Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
- Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
- Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
- Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
