Bouw van een hoge resolutie microscoop met conventionele en holografische optische Trapping Capabilities

Samenvatting

Het hierin beschreven systeem maakt een traditionele optische val en onafhankelijk holografische optische trapping lijn, staat het creëren en manipuleren van meerdere vallen. Dit zorgt voor de creatie van complexe geometrische arrangementen van refractieve deeltjes terwijl ook toelaat gelijktijdig met hoge snelheid, hoge-resolutie metingen van de activiteit van biologische enzymen.

Samenvatting

Hoge resolutie microscoop systemen met optische vallen zorgen voor nauwkeurige manipulatie van verschillende refractieve voorwerpen, zoals diëlektrische kralen ¹ of cellulaire organellen ^2,3, alsook voor hoge ruimtelijke en temporele resolutie uitlezen van hun positie ten opzichte van het centrum van de val. Het systeem beschreven in deze uitvinding heeft een dergelijke "traditionele" trap werkt bij 980 nm. Het verschaft bovendien een tweede optische opvangsysteem dat een commercieel beschikbare holografische pakket complex trapping patronen gelijktijdig maken en manipuleren in het gezichtsveld van de microscoop ^4,5 bij een golflengte van 1064 nm gebruikt. De combinatie van de twee systemen maakt de manipulatie van verschillende refractieve objecten tegelijk tegelijkertijd uitvoeren van hoge snelheid en hoge resolutie metingen van de beweging en kracht productie in nanometer en piconewton schaal.

Inleiding

Optisch vangen is een van de belangrijkste technieken in de biofysica ^6. Een cruciale vooruitgang in optische trapping is de ontwikkeling van holografische valkuilen die het mogelijk maken voor de oprichting van drie-dimensionale trapping patronen in plaats van conventionele punt vallen ^7. Dergelijke holografische vallen bezitten het voordeel van veelzijdigheid in positionering van refractieve objecten. Echter conventionele vallen kunnen gemakkelijk worden aangepast om meer symmetrisch dan commercieel verkrijgbare kits holografische. Ze laten ook voor een snelle nauwkeurige tracking van de ingesloten objecten. Hier beschrijven we een systeem (figuur 1) waarin de twee standpunten te vangen in een instrument en kan de gebruiker de voordelen van beide eventueel benutten.

De algemene overwegingen van de aanleg van optische vallen (op basis van een of meerdere laserstralen) worden in detail besproken elders ^8-10. Hier schetsen we de overwegingen die specifiek zijn voor onze setup en geven details van onze uitlijningsprocedure. Zo zijn twee systemen met optische trapping bundels eerder beschreven (bijv. ref. ^11), kenmerkend via een laserstraal voor het vangen van een refractieve object en met de andere (opzettelijk laag vermogen straal) ontkoppelde uitlezing van de positie van de gevangen object . Hier echter, beide laserstralen moeten krachtige (300 mW of hoger) omdat beide worden gebruikt voor vangst. Voor de metingen van biologische systemen, moeten de lasers gebruikt voor trapping optimaal binnen een specifieke NIR raam van golflengte vallen aan het licht geïnduceerde eiwitafbraak ¹ te minimaliseren. Hier hebben we gekozen voor 980 nm diode en 1064 nm DPSS lasers vanwege hun lage kosten, hoge beschikbaarheid en bedieningsgemak te gebruiken.

We hebben ook gekozen voor een ruimtelijke licht modulator (SLM) gebruiken om meerdere valkuilen tegelijk maken en manipuleren in real time ^4,5. Deze apparaten zijn in de handel verkrijgbaarMaar hun integratie in een complete opstelling presenteert unieke uitdagingen. Hier beschrijven we een praktische aanpak die deze potentiële problemen behandelt en zorgt voor een zeer veelzijdig instrument. We een uitdrukkelijke voorbeeld voor de specifieke opstelling beschreven die kunnen worden gebruikt als een gids voor gemodificeerde designs.

Protocol

1. Installatie van 980 nm golflengte Single Optische Trap

1. Optische trapping bij 980 nm golflengte is vaak optimaal voor biofysica experimenten en goedkope laserdiodes zijn direct beschikbaar met vermogen zo hoog als 300 mW. Bij voorkeur wordt een laser diode te pigtailed met polarisatie-bewarende single mode vezel met een bekende modevelddiameter. De vezel dient voldoende lang om als een mode filter te zijn en is typisch beëindigd met hetzij een FC / PC of FC / APC connector. Van deze, FC / APC is beter om terug te minimaliseren reflectie van licht en mogelijke feedback instabiliteiten.
2. Beveilig de 980 nm laser diode in een mount die het mogelijk maakt om de macht en temperatuurregeling. Het beste is om de houder te bevestigen aan een optische tafel direct naar passieve warmteafvoer te maximaliseren en daarmee het gevaar van diode niet te wijten aan een defect van de temperatuurregelaar te minimaliseren.
3. Monteer de PC / APC fiber connector op de balk optieksysteem. Het isessentieel om te verzekeren dat de gecollimeerde bundel een minimale divergentie dus instelbaar vezelhavens zijn het meest bruikbaar. Zorg ervoor dat de gekozen vezelhaven overeenkomt met het modevelddiameter van de diode pigtail vezel. Als de balk wordt gerasterd met akoestisch-optische deflectoren (AOD) of elektro-optische deflectoren (EOD) wordt de gecollimeerde laserbundel middel moet ook iets minder dan de grootte van de opening deflector.
4. Beveilig de collimerende adapter aan op de optische tafel op voldoende afstand van de microscoop om voor beam routing, expansie, en de plaatsing van andere gewenste componenten. Pas de fiber-poort om consistente bundel taille zorgen over afstanden vergelijkbaar met totale bundel pad naar de microscoop.
5. Installeer spiegels aangegeven in figuur 1. Verwijder de doelstelling van de microscoop en gebruik de spiegels aan de route van de bundel door de opening in het objectief montage podium. Indien gewenst, kan de plaatsing van de dichroïsche spiegels DM1 en DM3 worden weggelaten totdatlater. DM2 en DM3 zijn zowel shortpass en zenden zichtbaar licht en tegelijkertijd een afspiegeling nabije IR en hoger.
6. Het is nuttig om een ​​rode laser pointer in plaats van het doel, aangepast aan de optische as van de microscoop tijdelijk monteren. Een aangepaste mechanische adapter nodig om centrering van de laser pointer te verzekeren. Zichtbare straal van de laser pointer kan dan terug naar het midden van de apertuur van de vezel poort worden geleid en kan dan worden gebruikt om de lenzen (zie hieronder) te installeren.
7. Installeer de 980 nm straalexpander (L8 en L9) op een juiste afstand van de vezel-poort om toekomstige inbrengen van stuurinrichting onderdelen (AOD of EOD) toe als nodig is ^1. De uitgebreide bundel moet iets te veel in de rug focale diafragma van het objectief. (Hier, objectieven met een brandpuntsafstand van 125 mm en 60 mm zijn in een Kepler regeling om ongeveer het dubbele van de bundel taille). Gebruik zichtbare laserstraal (zie paragraaf 1.6) om de juiste lens plaatsing en ruwe uitlijning te garanderen.
8. Installerenl de 980 nm stuur lenzen (L2 en L3) in een telescoop opstelling zoals aangegeven (hier hebben beide 60 mm brandpuntsafstand) ^1. L3 is aangebracht in een vlak conjugaat aan de rug-brandvlak van het objectief. Mount L3 op een nauwkeurige XYZ positionering podium om voor bundelsturing. Het is nuttig voor de XYZ stadium digitale indicatoren zijn micrometer, waardoor herhaalbare positionering en herpositionering van de val. De 0.5 "bereik van reizen is meestal voldoende, kunnen evenwel langere reizen voor L3 positioneren langs de optische as nuttig zijn. Gebruik zichtbare laserstraal (zie paragraaf 1.6) om de juiste lens plaatsing en ruwe uitlijning te garanderen.

2. Installatie van Laser Detector

1. Installeer de dichroïsche spiegel DM3 boven de condensor zoals getoond in figuur 1. Een aangepaste mount is meestal vereist. Verzeker quadfotodiode (QPD) of een positiegevoelige detector (PSD) ⁸ aan de zijkant van de condensor montage en ensure dat de 980 nm laserstraal gereflecteerd door DM3 is het raken van het ruwweg op centrum. Bij het gebruik van QPD, ervoor zorgen dat het op een kleine XY podium is gemonteerd om te zorgen voor nauwkeurige centrering van de sensor op de laserstraal.
2. Installeer L1 (meestal een mm lens 30) tussen DM3 en de sensor. Positie L1 om de bundel te richten op een enkele plaats op de sensor.
3. Installeer het notch filter net voor L1 om de 1064 nm bundel alsmede eventuele verdwaalde zichtbare lichtreflecties te blokkeren van de insteeklamp en sfeerverlichting.

3. Installatie van 1.064 nm golflengte Holografische Trap

1. De holografische onderdeel van de installatie is gebouwd rond een commercieel verkrijgbare hardware / software pakket De holografische spiegels gebruikt in dit pakket zijn beoordeeld met een maximum incident vermogen van 5 of 10 W / cm ^2. Single mode TEM00 balken in dit vermogensbereik kan gemakkelijk worden afkomstig van een DPSS laser op 1064 nm golflengte.
2. Monteer de 1064 nm laser op een verhoogdeplatform om ruwweg overeen met de hoogte van de bundel pad voor de 980 lijn (zie hoofdstuk 1).
3. Wanneer deze niet rechtstreeks controleerbaar, kan laservermogen handmatig worden aangepast door het installeren van een halve golf plaat (HWP) en een polarisator (PBS) direct na de laser-uitgang diafragma. Het is nuttig om de polarisator monteren in een draaibaar platform kunnen holografische spiegel vereiste bundel polarisatie overeenkomen.
4. Installeer de 1064 nm straalexpander (L6 en L7). De laserstraal taille moet worden uitgebreid om de diagonaal van de holografische spiegel overeenkomen. Voor grote expansieverhoudingen (hierboven 10X) kan het een streven om de grootte van de expander klein te houden. (: 16 mm en 175 mm here) Aldus kan het gewenst zijn lenzen met ongebruikelijk kleine brandpuntsafstand gebruiken.
5. Installeer de andere spiegels, zoals aangegeven op de 1064 nm straal direct via de doelstelling.
   1. Secure DM1 dichroische (45 ° hoek van inval) in een kinematische mount en plaats de assemblage in de 980 nm stralengang, zodat het zorgt voor undiminished overdracht van die balk.
   2. Activeer laser pointer licht. De spiegel DM1 moet voldoende hoeveelheid zichtbaar licht weerspiegelen juiste positie de ruimtelijke lichtmodulator (SLM) in de weg van deze bundel. De SLM moet ook zo worden gedraaid dat de inkomende en uitgaande laserstralen zo dicht mogelijk bij normale inval. Maar de invalshoek moet voldoende groot zijn om ervoor te zorgen dat de laserstraal niet wordt afgekapt door de lens mounts en andere optische componenten. Een 5 ° hoek moet gemakkelijk haalbaar zijn en voldoende klein is. Tenslotte is de afstand tussen DM1 de SLM moet nauwkeurig worden gemeten, zodat het inbrengen van de lenzen L4 en L5 (zie 3.6) de SLM spiegelvlak en back-brandvlak van het objectief kan vervoegen.
   3. Installeer een spiegel om het licht direct vanaf 1.064 nm beam expander aan de SLM. Zorg ervoor dat de laser pointer licht raakt de bundelexpander diafragma op centrum.
6. Installeer lenzen L4 en L5 (hier: lenzen met 125 mm en 200 mm respectievelijk). Deze telescoop pair conjugeert de SLM spiegelvlak aan de achterkant brandvlak van het objectief en vermindert ook de bundel taille tot slechts iets te vol de achterkant diafragma van het objectief. We kozen voor objectieven met lange brandpuntsafstanden om ruimte de SLM weg van DM1. Dit wist niet alleen ruimte voor de tweede laser lijn, maar ook de neiging om de uitlijning te vergemakkelijken.
7. Verwijder de laserpointer. Laat de bevestiging adapter om te dienen als grove uitlijning diafragma.

4. Systeem Installatie en uitlijning Notes

1. Lens L3 en SLM moeten zo geplaatst worden dat zijn optisch geconjugeerd aan de achterkant brandvlak van het objectief. De gemeenschappelijke brandpunt van L4 en L5 is optisch geconjugeerd aan het monster vlak als de optische trapping balken worden geïnjecteerd in de oneindige ruimte van de microscoop.
2. zingen IR-kijker richt de 980 nm straal te gaan langs de middenas van de opening in de laserpointer adapter.
3. Gebruik IR-kaart to zorgen dat de 1064 nm straal raakt dezelfde plaats als de 980 nm straal op DM1, L2 en L3 en de 1.064 nm straal gaat langs de hartlijn van de opening in de laser pointer adapter.
4. Vervang de laser pointer montage-adapter met een doel. Hoge numerieke apertuur olie of water doelstelling is typerend.
5. Lijn de 980 nm val zoals beschreven in ⁹ door "lopen" van de laserstraal tot een radiaal symmetrisch interferentiepatroon wordt gezien op de camera.
6. Met de holografische spiegel uit (dat wil zeggen als een passieve spiegel) gebruiken SLM en DM1 om "lopen" de onafgebogen 1064 nm straal het 1064 nm val te lijnen.
7. De SLM vormt een belangrijke gediffracteerde bundel waardoor een sterke onbewegelijk laser val in het gezichtsveld. Dit is nuttig voor uitlijning maar ongewenst experimenten zijn. Om deze val blokkeren kan men een kleine ondoorzichtige object in te voegen in het pad van onafgebogen licht bij de locatie conjugaat aan het monster vlak (bv. the gemeenschappelijke brandpunt van L4 en L5). De maat van deze centrale plek blocker moet iets groter zijn dan de diameter van de Airy schijf voor het gerichte licht (blokker met 100-300 micrometer diameter voor het beschreven systeem).
8. djust 1064 nm bundel polarisatie met behulp van de polarisator te SLM oriëntatie passen. Draai het halvegolflengteplaat om het uitgangsvermogen van de lichtbundel naar wens instellen.
9. Indien gewenst, plaatst AOD of EOD bundelsturing elementen in de 980 nm laser lijn. Zorg voor een juiste vervoeging van deze elementen naar de back-brandvlak van het objectief en opnieuw uitlijnen van de val. Het is nuttig om het stuur elementen op een goniometrische podium monteren.

Resultaten

De samengestelde setup kan de operator meerdere refractieve objecten val in real time en plaats ze in alle drie dimensies binnen het gezichtsveld. We illustreren de holografische mogelijkheden van het instrument door vangen 11 microsferen (figuur 2). De val beperken elk object wordt handmatig opnieuw gepositioneerd op het vangen, zodat de uiteindelijke opstelling toont het logo van de Universiteit van Utah, waar dit experiment werd uitgevoerd. Een gecombineerde functie van holografische conventionele op...

Discussie

We hebben een instrument dat twee optische vallen van verschillende types (figuur 1) combineert afzonderlijke trapping faciliteiten voorzien objectmanipulatie en meting uitgevoerd. De "klassieke" optische val is gebouwd rond een 980 nm diodelaser. Deze bundel wordt uitgebreid, gestuurd en vervolgens geïnjecteerd in onze omgekeerde microscoop ("lichtrood" balk in figuur 1). De holografische optische val is opgebouwd rond een 1064 nm DPSS laser. De balk wordt uitgebrei...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Optical table	Newport corporation	ST-UT2-56-8	Irvine, CA
Microscope, Inverted, Eclipse Ti	Nikon USA	MEA53220	Melville, NY
Plan apo 100X oil objective (1.4 NA)	Nikon USA	MRD01901	Melville, NY
Oil condenser Lens 1.4 NA	Nikon USA	MEL41410	Melville, NY
EMCCD camera	Andor technology USA	Ixon DU897	South Windsor, CT
1/3" CCD IEEE1394 camera	NET USA Inc	Foculus FO124SC	Highland IN
Laser, TEM00, SLM, 1,064 nm wavelength	Klastech Laser Technologies	Senza-1064-1000	Dortmund; Germany
laser diode, TEM00, SLM, 980 nm	Axcel Photonics	BF-979-0300-P5A	Marlborough, MA
laser diode mount	ILX Lightwave	LDX-3545, LDT-5525, and LDM-4984	Bozeman, MT
adjustable fiber ports	Thorlabs	PAF-X-11-B	Newton, NJ
holographic system	Arryx	HOTKIT-ADV-1064	Chicago, IL
holographic mirror	Boulder Non-linear Systems	this is a part of HOTKIT-ADV-1064	Lafayette, CO
Calcite polarizer	Thorlabs	GL10-B	Newton, NJ
half-wave plate	Thorlabs	WPH05M-1064	Newton, NJ
Polarizer rotation mount	Thorlabs	PRM1	Newton, NJ
half-wave plate rotation mount	Thorlabs	RSP1	Newton, NJ
Shutter	Thorlabs	SH05	Newton, NJ
dichroic mirrors (DM2 & DM3); 45° AOI	Chroma Technology	t750spxrxt	Bellows Falls, VT
dichroic mirror (DM1); 45° AOI	Thorlabs	DMSP1000R	Newton, NJ
custom mechanical adapter	Thorlabs	SM1A11 and AD12F with enlarged inner bore	Newton, NJ
notch filter	Semrock	FF01-850/310-25	Rochester, NY
Acousto-Optic deflector (2-axis)	intraAction	DTD-584CA28	Bellwood, IL
goniometric stage	New Focus	9081	Santa Clara, CA
60 mm steering lenses	Thorlabs	LA1134-B	Newton, NJ
16 mm aspherical expander lens	Thorlabs	AC080-016-C	Newton, NJ
175 mm expander lens	Thorlabs	LA1229-C	Newton, NJ
Spot blocker (carbon-steel sphere)	Bal-Tec	0.0100" diameter	Los Angeles, CA
Microspheres (Carboxyl-polystyrene)	Spherotech	CP-45-10	Lake Forest, IL