$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Uitbreiding van Human NPCs (figuur 1)
- Herleven de bevroren voorraad menselijk NPCs uit foetale hersenen (Lonza, Walkersville, MD, USA) en cultuur ze in suspensie in de T-75 kolven als neurosferen (figuur 1A) in Neurobasal medium dat proliferatie supplementen, EGF (10 ng / ml) en FGF (10 ng / ml).
- Na 3 dagen kweken dragen de neurosferen een 15 ml buis en centrifugeer bij 500 rpm gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant met achterlating van ~ 100 ul medium boven de cel pellet en zetten in een Eppendorf buis. Een 100 pl celpellet voldoende te splitsen in 2 T-75 kolven. Indien minder, vermindering van het aantal flessen als neuroprogenitor cellen niet te woekeren als splitsen dun.
- Vermaal de pellet met 200 ul tip 50x terwijl de 200 ul tip tegen de bodem van de buis. Verdeel de celsuspensie even in twee delen en voeg ze toe aan 2 T-75 kolven (1-2 split), een voor voortgezetexpansie en andere voor differentiatie.
- Ga door met de cultuur van de neuroprogenitor cellen voor uitbreiding (eerste fles) door het veranderen van het medium om de 4-5 dagen tot de neurosferen bereiken hun oorspronkelijke formaat van 300-500 micrometer. Verander medium door centrifugeren (500 tpm, 5 min), gooi de oude medium en voeg nieuwe medium.
2. Differentiatie van Human NPCs in een Neuron-rijke cultuur (figuur 2)
- Voor differentiatie van neuroprogenitor cellen in een neuron rijke cultuur, plaats een enkel dekglaasje in elk putje van een 24-wells plaat en jas met 100 ug / ml van poly-L-lysine door het toevoegen van 500 pi in elk putje. Incubeer de gerechten voor 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het poly-L-lysine-oplossing en spoel de plaat met steriel water.
- Vervolgens vacht de putjes van de plaat met 500 ui 5 ug / ml muis laminine en incubeer gedurende 30 minuten. Na incubatie was de putjes met PBS.
- 4 dagen na splitting van de cellen (stap 1.4), breng de kleine neurosferen in de kolf de vermelding "For differentiatie 'in de gecoate gerechten in een dichtheid van ~ 500 neurosferen per putje van een 24-wells plaat.
- Na 6 uur, als de neurosferen hechten aan de schaal, verwijdert de proliferatie medium en voeg differentiatiemedium bestaande uit Neurobasal medium, B27 supplement, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), en retinoïnezuur (2 uM).
3. Immunofluorescentiekleuring van gedifferentieerde NPCs (figuur 3)
- Na kweek van neuroprogenitor cellen in neuronale differentiatie medium voor twee weken, is een neuron-rijke cultuur verkregen. Spoel de neuronen keer in PBS en vervolgens oplossen in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten. Eenmaal vastgesteld, spoel de cellen driemaal met PBS.
- Incubeer de cellen met permeabilisatie buffer (5% BSA en 0,2% Triton X-100 in PBS) bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten.
- Incubeer de gerechten O / N bij 4 ° C ina shaker met de volgende combinatie van polyklonale en monoklonale antilichamen in 3% BSA in PBS: NeuN (1:250) en synapsin (1:250); acetyl cholinesterase (1:500) en synaptofysine (1:250); BDNF (1 : 500) en GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) en GFAP (1:1000).
- Was de dekglaasjes driemaal met PBS en vervolgens geïncubeerd ze met anti-konijnen-Cy3 en anti-muis-FITC secundaire antilichamen bij kamertemperatuur in het donker gedurende 90 minuten. Na incubatie was de dekglaasjes driemaal met PBS.
- Plaats 10 ul van montage medium op een glasplaatje, neem de dekglaasje van de cultuur schotel met een tang, en plaats het ondersteboven op de montage medium. Zachtjes, veeg de overtollige montage medium en sluit de randen met nagellak.
- Onderzoek de immunostained neuronen in een fluorescentiemicroscoop.
4. Lasermicrodissectie van neuronen (figuur 4)
- Differentiëren NPCs in een neuron-rijke cultuur op PEN membraan dias bekleed met poly-L-lysine en muis laminine volgens de methode beschreven bij figuur 2 procedures.
- Voer alle daaropvolgende stappen onder RNAse-vrije omstandigheden.
- Vlekken op de culturen met behulp HistoGene Stain (Arcturus) om de cellen te visualiseren.
- Zoek het gebied van pure neuronale populaties verstoken van astrocyten met behulp van de routekaart beeld van de volledige dia met de Veritas LCM systeem. Markeer de neuronen met behulp van de tekengereedschappen.
- Voer laser capture van deze gebieden met computergestuurde precisie en automatisering in twee stappen. Eerste, IR (infrarood) wordt afgevuurd op meerdere plekken met een laservermogen instelling van 70 mW en een puls van 2500 usee om het membraan hechten aan de dop. Vervolgens wordt het gemarkeerde gebied uitgesneden met UV snijgereedschap op een laag niveau-instelling van 10 mV.
- Combinatie van deze processen selectief vangt de gemarkeerde gebieden van het PEN membraan op CapSure LCM macro caps. Wanneer de kap wordt opgetild, de membraan met de neurons houdt zich aan de dop.
- Isoleer totaal RNA van LCM monsters met behulp van een PicoPure RNA isolatie kit (Arcturus) en behandelen met DNase.
- Versterken de geïsoleerde RNA met behulp RiboAMP RNA amplificatie kit volgens de instructies van de kit.
- Voer Real time RT-PCR-analyse met TaqMan probes menselijk neurofilament zware keten (hNFHc) detecteren.
Afkortingen:
AD, ziekte van Alzheimer, BDNF, brain-derived neurotrophic factor, CREB, cyclisch AMP respons element bindend eiwit, DBC, dibutyryl cyclisch AMP, EGF, epidermale groeifactor, FGF, fibroblast groeifactor, GFAP, glia fibrillair zuur eiwit, LCM, laser vangen microdissection, NGF, Zenuwgroeifactor, NPC, neuroprogenitor cel, PEN, polyethyleennaftalaat.