Lasermicrodissectie van neuronen van Gedifferentieerd Human Neuroprogenitor Cellen in Cultuur

Summary

Menselijke neuroprogenitor cellen (NPC) werden uitgebreid onder uitdijende omstandigheden. NPCs werden gedifferentieerd in neuron-rijke culturen in aanwezigheid van een combinatie van neurotrofinen. Neuronale merkers werden gedetecteerd door immunofluorescentie kleuring. Om een ​​zuivere populatie van neuronen te isoleren, werden NPCs gedifferentieerd PEN membraan glijbanen en lasermicrodissectie werd uitgevoerd.

Abstract

Neuroprogenitor cellen (NPC) geïsoleerd uit de humane foetale hersenen werden onder proliferatieve aandoeningen uitgebreid in de aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en fibroblast groeifactor (FGF) een overvloedige toevoer van cellen. NPCs werden gedifferentieerd in de aanwezigheid van een nieuwe combinatie van zenuwgroeifactor (NGF), van hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) en retinoïnezuur op de vaat bekleed met poly-L-lysine en muis laminine te verkrijgen neuron -rijke culturen. NPCs werden gedifferentieerd in afwezigheid van neurotrofinen, DBC en retinoïnezuur en in aanwezigheid van ciliaire neurotrofe factor (CNTF) naar astrocyt-rijke culturen verkregen. Gedifferentieerde NPCs werden gekenmerkt door immunofluorescentiekleuring voor een panel van neuronale markers inclusief NeuN, synapsine, acetylcholinesterase, synaptofysine en GAP43. Gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en STAT3, astrocyten markers, werden gedetecteerd in 10-15% van de gedifferentieerde NPCs. Ter vergemakkelijkingceltype specifieke moleculaire karakterisering, werd lasermicrodissectie uitgevoerd om neuronen gekweekt op polyethyleennaftalaat (PEN) membraan dia's te isoleren. De in deze studie beschreven methoden leveren waardevolle instrumenten om ons begrip van de moleculaire mechanismen van neurodegeneratie te bevorderen.

Introduction

Permanente neurogenese is gekend om in subventriculaire zone van de laterale ventrikels en de subgranulaire laag van de dentate gyrus van de volwassen zoogdierhersenen ^1. Neuroprogenitor cellen (NPC's) die afkomstig zijn uit deze regio's zijn multipotente cellen die kunnen differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten ^2. NPCs hebben gegenereerd belang omdat zij kunnen worden getransplanteerd in patiënten met diverse neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, amyotrofische laterale sclerose, beroerte en ziekte (AD) ³ Alzheimer. Onderzoeken met NPC het algemeen gericht op deze transplantatie hoe....

Protocol

1. Uitbreiding van Human NPCs (figuur 1)

1. Herleven de bevroren voorraad menselijk NPCs uit foetale hersenen (Lonza, Walkersville, MD, USA) en cultuur ze in suspensie in de T-75 kolven als neurosferen (figuur 1A) in Neurobasal medium dat proliferatie supplementen, EGF (10 ng / ml) en FGF (10 ng / ml).
2. Na 3 dagen kweken dragen de neurosferen een 15 ml buis en centrifugeer bij 500 rpm gedurende 5 minuten.
3. Verwijder het supernatant met achterlating van ~ 100 ul medium boven de cel pellet en zetten in een Eppendorf buis. Een 100 pl celpellet voldoende te splitsen in 2 T-75 kolven. Indien minder, vermindering ....

Results

Uitbreiding van NPCs (figuur 1)

Wanneer neurospheres worden afgebroken om een ​​enkele celsuspensie door trituratie, de pipetpunt moet de bodem van de buis raakt zodat er enige weerstand wanneer de suspensie op en neer gepipetteerd. Het aantal malen trituratie variëren tussen individuen en moet worden beslist proefondervindelijk door onderzoek van de resulterende celsuspensie onder een microscoop. Het is cruciaal om voldoende dichtheid celsuspensie verschaffen omdat de prolifer.......

Discussion

Wij beschrijven in deze studie een neuron-rijke celcultuurmodel door differentiatie van zelf-vernieuwing neuroprogenitor menselijke cellen en een methode om een ​​zuivere populatie van neuronen isoleren laser capture microdissectie. We hebben een combinatie van NGF, BDNF, DBC en retinoïnezuur voor neuronale differentiatie van NPCs gebruikt. DBC wordt gebruikt om CREB een transcriptiefactor die neurogenese ¹² verbetert activeren. Retinoïnezuur induceert celcyclus verlaten en vermindert de gliale bevolking

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neuroprogenitor cells (NPCs)	Lonza	PT-2599
Neurocult NS-A human basal medium	Stem cell technology	5750
Neurocult NS-A Proliferation supplement	Stem cell technology	5753
Neurocult NS-A Differentiation supplement	Stem cell technology	5754
B-27 Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044
Human epidermal growth factor	Stem cell technology	2633
Fibroblast growth factor	Sigma	F0291
Brain Derived Neurotrophic Factor	Cell signaling	3897S
Nerve Growth Factor	Invitrogen	13257-019
Dibutyryl cyclic AMP	Sigma	D-0627
poly-L-lysine	Sigma	P-5899
Mouse laminin	Sigma	L-2020
Retinoic acid	Sigma	R-2625
STAT3 antibody	Cell signaling	9132
GFAP antibody	Cell signaling	3670
GAP43 antibody	Transduction laboratories	612262
BDNF antibody	Millipore	AB1534SP
Acetyl cholinesterase antibody	Santz cruz	Sc-11409
Synaptophysin antibody	Abcam	ab18008-50
NeuN antibody	Chemicon	MAB377
Synapsin antibody	Novus	NB300-104
Anti mouse FITC	Jackson Immuno	115-095-146
	Research Laboratories
Anti Rabbit Cy3	Jackson Immuno	711-165-152
	Research Laboratories
BSA	Sigma	A1653
Triton-X 100	Acros	21568-2500
Paraformaldehye	Fisher	4042
Coverslip (Big circle cover slip)	Fisherbrand	12-545-102
Mounting medium (Prolong Gold)	Invitrogen	P36930
Pen membrane	Applied biosystems	LCM0521
Histogene LCM frozen section staining kit	Applied biosystems	KIT0401
RiboAmp RNA Amplification kit	Applied biosystems	KIT0201
Picopure RNA Isolation kit	Applied biosystems	KIT0202
CapsureMacro LCM caps	Applied biosystems	LCM0211