Menselijke neuroprogenitor cellen (NPC) werden uitgebreid onder uitdijende omstandigheden. NPCs werden gedifferentieerd in neuron-rijke culturen in aanwezigheid van een combinatie van neurotrofinen. Neuronale merkers werden gedetecteerd door immunofluorescentie kleuring. Om een zuivere populatie van neuronen te isoleren, werden NPCs gedifferentieerd PEN membraan glijbanen en lasermicrodissectie werd uitgevoerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Lasermicrodissectie van neuronen van Gedifferentieerd Human Neuroprogenitor Cellen in Cultuur
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neuroprogenitor cellen (NPC) geïsoleerd uit de humane foetale hersenen werden onder proliferatieve aandoeningen uitgebreid in de aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en fibroblast groeifactor (FGF) een overvloedige toevoer van cellen. NPCs werden gedifferentieerd in de aanwezigheid van een nieuwe combinatie van zenuwgroeifactor (NGF), van hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) en retinoïnezuur op de vaat bekleed met poly-L-lysine en muis laminine te verkrijgen neuron -rijke culturen. NPCs werden gedifferentieerd in afwezigheid van neurotrofinen, DBC en retinoïnezuur en in aanwezigheid van ciliaire neurotrofe factor (CNTF) naar astrocyt-rijke culturen verkregen. Gedifferentieerde NPCs werden gekenmerkt door immunofluorescentiekleuring voor een panel van neuronale markers inclusief NeuN, synapsine, acetylcholinesterase, synaptofysine en GAP43. Gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en STAT3, astrocyten markers, werden gedetecteerd in 10-15% van de gedifferentieerde NPCs. Ter vergemakkelijkingceltype specifieke moleculaire karakterisering, werd lasermicrodissectie uitgevoerd om neuronen gekweekt op polyethyleennaftalaat (PEN) membraan dia's te isoleren. De in deze studie beschreven methoden leveren waardevolle instrumenten om ons begrip van de moleculaire mechanismen van neurodegeneratie te bevorderen.
Inleiding
Permanente neurogenese is gekend om in subventriculaire zone van de laterale ventrikels en de subgranulaire laag van de dentate gyrus van de volwassen zoogdierhersenen 1. Neuroprogenitor cellen (NPC's) die afkomstig zijn uit deze regio's zijn multipotente cellen die kunnen differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten 2. NPCs hebben gegenereerd belang omdat zij kunnen worden getransplanteerd in patiënten met diverse neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, amyotrofische laterale sclerose, beroerte en ziekte (AD) 3 Alzheimer. Onderzoeken met NPC het algemeen gericht op deze transplantatie hoe....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Uitbreiding van Human NPCs (figuur 1)
- Herleven de bevroren voorraad menselijk NPCs uit foetale hersenen (Lonza, Walkersville, MD, USA) en cultuur ze in suspensie in de T-75 kolven als neurosferen (figuur 1A) in Neurobasal medium dat proliferatie supplementen, EGF (10 ng / ml) en FGF (10 ng / ml).
- Na 3 dagen kweken dragen de neurosferen een 15 ml buis en centrifugeer bij 500 rpm gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant met achterlating van ~ 100 ul medium boven de cel pellet en zetten in een Eppendorf buis. Een 100 pl celpellet voldoende te splitsen in 2 T-75 kolven. Indien minder, vermindering ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Uitbreiding van NPCs (figuur 1)
Wanneer neurospheres worden afgebroken om een enkele celsuspensie door trituratie, de pipetpunt moet de bodem van de buis raakt zodat er enige weerstand wanneer de suspensie op en neer gepipetteerd. Het aantal malen trituratie variëren tussen individuen en moet worden beslist proefondervindelijk door onderzoek van de resulterende celsuspensie onder een microscoop. Het is cruciaal om voldoende dichtheid celsuspensie verschaffen omdat de prolifer.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wij beschrijven in deze studie een neuron-rijke celcultuurmodel door differentiatie van zelf-vernieuwing neuroprogenitor menselijke cellen en een methode om een zuivere populatie van neuronen isoleren laser capture microdissectie. We hebben een combinatie van NGF, BDNF, DBC en retinoïnezuur voor neuronale differentiatie van NPCs gebruikt. DBC wordt gebruikt om CREB een transcriptiefactor die neurogenese 12 verbetert activeren. Retinoïnezuur induceert celcyclus verlaten en vermindert de gliale bevolking
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten te verklaren.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door Merit Beoordeling subsidie (NEUD-004-07F) van de Veterans Administration (SP).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Neuroprogenitor cellen (NPC's) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A menselijk basaal medium | Stamcel technologie | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferatiesupplement | Stamcel technologie | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiatiesupplement | Stamcel technologie | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Humaan epidermale groeifactor | Stamcel technologie | 2633 | |
| Fibroblast groeifactor | Sigma | F0291 | |
| Hersengebonden neurotrofe factor | Celsignalering | 3897S | |
| Nervgroeifactor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclisch AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Muis laminine | Sigma | L-2020 | |
| Retinoïnezuur | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antilichaam | Celsignalering | 9132 | |
| GFAP antilichaam | Celsignalering | 3670 | |
| GAP43 antilichaam | Transductielaboratoria | 612262 | |
| BDNF antilichaam | Millipore | AB1534SP | |
| Acetylcholinesterase antilichaam | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptofysine antilichaam | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antilichaam | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsine antilichaam | Novus | NB300-104 | |
| Anti muis FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Onderzoekslaboratoria | |||
| Anti konijn Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Onderzoekslaboratoria | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Dekglas (Grote cirkeldekglas) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Montagemedium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membraan | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM bevroren sectiestainingkit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplificatiekit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolatiekit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
Referenties
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
