Method Article
De driedimensionale locaties van zwak-verstrooiende objecten kan uniek worden geïdentificeerd middels inline digitale holografische microscopie (Dihm), die een geringe wijziging betreft een standaard microscoop. De software gebruikt een eenvoudige weergave heuristische combinatie met Rayleigh-Sommerfeld back-overdracht naar de driedimensionale positie en geometrie van een microscopische fase-object verkregen.
Zwak-verstrooiing voorwerpen, zoals kleine colloïdale deeltjes en de meeste biologische cellen, vaak aangetroffen in microscopie. Inderdaad zijn een aantal technieken ontwikkeld om deze fase objecten beter visualiseren, fase contrast en DIC behoren tot de meest populaire methoden voor het verbeteren van contrast. Echter, het opnemen van positie en de vorm in de richting out-of-imaging-plane blijft uitdagend. Dit rapport introduceert een eenvoudige experimentele methode om nauwkeurig te bepalen van de locatie en de geometrie van objecten in drie dimensies, met behulp van digitale inline holografische microscopie (Dihm). In grote lijnen is de toegankelijke monstervolume bepaald door de grootte camerasensor in zijdelingse richting en de verlichting samenhang in de axiale richting. Typische monstervolumes variëren van 200 urn x 200 urn x 200 urn met LED-verlichting te5 mm x 5 mm x 5 mm of groter met laserbelichting. Deze verlichting licht is zodanig geconfigureerd dat vlakke golven zijn incident op het monster. Objecten in het monster volume dan licht verstrooien, die interfereert met de verstrooide licht om interferentie patronen vormen loodrecht op de verlichting richting. Dit beeld (het hologram) bevat de diepte informatie die voor driedimensionale reconstructie en kan worden vastgelegd op een standaard beeldvormingsinrichting zoals een CMOS of CCD-camera. De Rayleigh-Sommerfeld back vermeerderingsmethode toegepast om numeriek heroriënteren microscoop afbeeldingen en een eenvoudige weergave heuristische basis van de Gouy fase anomalie wordt gebruikt voor het identificeren verstrooiing objecten in het gereconstrueerde volume. Deze eenvoudige maar robuuste methode resulteert in een eenduidige, model-free meten van de locatie en vorm van objecten in microscopische monsters.
Digitale inline holografische microscopie (Dihm) maakt een snelle driedimensionale beeldvorming van microscopische monsters, zoals zwemmen micro-organismen 1,2 en zachte materie systemen 3,4, met een minimale wijziging van een standaard microscoop setup. In deze paper wordt een pedagogische demonstratie van Dihm wordt verstrekt, gecentreerd rond software ontwikkeld in ons lab. Dit document bevat een beschrijving van het instellen van de microscoop, het optimaliseren van data-acquisitie, en de opgenomen beelden tot drie-dimensionale data reconstrueren verwerken. De software (gedeeltelijk gebaseerd op software die is ontwikkeld door DG Grier en anderen 5) en bijvoorbeeld beelden zijn vrij beschikbaar op onze website. Een beschrijving wordt gegeven van de stappen die nodig zijn om de microscoop te configureren, te reconstrueren drie-dimensionale volumes van hologrammen en maken de resulterende volumes van belang gebruik van een gratis ray-tracing software pakket. Het document besluit met een bespreking van factoren die de kwaliteit van de wederopbouwEn een vergelijking van Dihm met concurrerende methoden.
Hoewel Dihm werd enige tijd geleden beschreven (voor een algemene herziening van haar principes en ontwikkeling, zie Kim 6), heeft de benodigde rekenkracht en beeldverwerking deskundigheid tot nu toe grotendeels beperkt het gebruik ervan tot gespecialiseerde onderzoeksgroepen met een focus op de ontwikkeling instrument. Deze situatie is aan het veranderen in het licht van recente ontwikkelingen in de computer-en cameratechnologie. Moderne desktop computers kan gemakkelijk omgaan met de verwerking en opslag van gegevens eisen, CCD-of CMOS-camera's aanwezig in de meeste microscopie labs zijn, en de benodigde software wordt gratis beschikbaar gesteld op het internet door groepen die tijd hebben geïnvesteerd in de ontwikkeling van de techniek.
Verschillende systemen zijn voorgesteld voor het afbeelden van de configuratie van microscopische objecten in een driedimensionale monstervolume. Veel van deze technieken scannen 7,8, waarbij een stapel van beelden opgenomen door mechanically vertalen van het beeldvlak door het monster. Scanning confocale fluorescentie microscopie is misschien wel het meest bekende voorbeeld. Meestal wordt een fluorescente kleurstof toegevoegd aan een fase-object om een aanvaardbaar monster contrast bereiken en confocale inrichting gebruikt om ruimtelijk lokaliseren fluorescente emissie. Deze werkwijze heeft tot significante vooruitgang, bijvoorbeeld colloïdale wetenschap waar zij de toegang tot de driedimensionale dynamica van druk systemen 9-11 is toegestaan. Het gebruik van etikettering is een belangrijk verschil tussen fluorescentie confocale microscopie en Dihm, maar andere kenmerken van de twee technieken zijn de moeite waard te vergelijken. Dihm een aanzienlijk snelheidsvoordeel dat de inrichting geen bewegende delen. De mechanische scanning spiegels confocale systemen plaats een bovengrens voor de data-acquisitie rate - meestal ongeveer 30 frames / sec beeld een 512 x 512 pixels. Een stapel van dergelijke beelden van verschillende beeldvlakken worden verkregen door fysisch translAting de monstertafel of objectieflens tussen frames, waardoor een uiteindelijke opnamesnelheid van ongeveer een volume per seconde voor een 30 lijst stapel. Ter vergelijking, kan een holografisch systeem gebaseerd op een moderne CMOS-camera 2000 beelden / sec vast te leggen op hetzelfde beeldformaat en de resolutie, elk frame is verwerkt `offline 'aan een onafhankelijke momentopname van het monster volume te geven. Nogmaals: fluorescerende monsters niet vereist voor Dihm, hoewel een systeem ontwikkeld dat holografische reconstructie van een fluorescerende onderwerp 12 uitvoert. Naast driedimensionaal volume informatie Dihm kan ook worden gebruikt om kwantitatief fasecontrast beelden 13 verschaffen, maar die buiten het bereik van de hier besproken.
Ruwe Dihm gegevens beelden zijn twee-dimensionaal, en in sommige opzichten er als standaard microscoop beelden, zij het onscherp. Het belangrijkste verschil tussen Dihm en standaard helderveld microscopie ligt in het afbuigende ringen die voorwerpen omringen in het gezichtsveld, dit zijn vanwege de aard van de verlichting. Dihm vereist een meer coherente bron dan helder veld - meestal een LED of laser. De diffractie ringen in het hologram bevatten de informatie die nodig is om een driedimensionaal beeld te reconstrueren. Er zijn twee belangrijke benaderingen van het interpreteren Dihm gegevens; directe montage en numerieke heroriëntatie. De eerste benadering is wanneer het wiskundige vorm van het diffractiepatroon vooraf 3,4 bekend toepassing; deze voorwaarde wordt voldaan door een klein aantal eenvoudige objecten zoals bollen, cilinders en halfvlak obstakels. Directe montage is ook in gevallen waarin axiale positie van het object bekend is van toepassing, en het beeld kan worden gemonteerd met behulp van een opzoektabel van beeldsjablonen 14.
De tweede benadering (numeriek heroriëntatie) is eerder algemeen en gebaseerd op het gebruik van de diffractie ringen beeld tweedimensionale hologram numeriek reconstrueren optische veldeen aantal (willekeurig verdeelde) brandvlakken door het monster volume. Verschillende verwante methoden bestaan om dit te doen 6; dit werk gebruikt de Rayleigh-Sommerfeld terug voortplanting techniek zoals beschreven door Lee en Grier 5. De uitkomst van deze procedure is een stack van beelden die het effect van de microscoop focal plane (vandaar de naam `numerieke heroriëntatie ') handmatig veranderen repliceren. Zodra een stapel van beelden is gegenereerd, moet de positie van het subject in het brandpunt volume verkregen. Een aantal beeldanalyse heuristiek, zoals lokale intensiteit variantie of ruimtelijke frequentie-inhoud, zijn voorgelegd aan de scherpte van de focus te kwantificeren op verschillende punten in de steekproef 15. Telkens wanneer een bepaald beeld gegeven wordt gemaximaliseerd (of geminimaliseerd), wordt het object beschouwd in focus.
In tegenstelling tot andere programma's die streven naar een bepaalde focal plane waar een object 'in focus' te identificeren, de methode in dit werk eruit pikt points dat in het object van belang liggen, die kan zich uitstrekken over een breed scala van focale vliegtuigen. Deze benadering is toepasbaar op een breed scala van onderwerpen en is bijzonder geschikt voor verlengd zwak verstrooiende monsters (fase voorwerpen), zoals staafvormige colloïden, ketens van bacteriën of eukaryote flagella. In deze monsters wijzigt het contrast wanneer het object door de focal plane passeert, een onscherpe beeld heeft een licht centrum als het object is aan de ene kant van de focal plane en een donker centrum als het op de andere. Zuivere fase objecten hebben weinig tot geen contrast wanneer ze liggen precies in het brandvlak. Dit fenomeen van contrast inversie is besproken door andere auteurs 16,17 en uiteindelijk door de Gouy fase anomalie 18. Dit is een meer rigoureuze voet in de context van holografie zetten elders waar de grenzen van de techniek worden geëvalueerd, de typische onzekerheid in positie is in de orde van 150 nm (ongeveer een pixel) in each richting 19. De Gouy fase anomalie methode is een van de weinige welomschreven Dihm's voor bepalen van de structuur van uitgebreide objecten in drie dimensies, maar toch sommige objecten problematisch te reconstrueren. Objecten die direct langs de optische as (wijzend naar de camera) liggen zijn moeilijk nauwkeurig te reconstrueren, onzekerheden in de lengte en de positie van het object worden groot. Deze beperking is voor een deel te wijten aan de beperkte bitdiepte van de pixels opnemen van het hologram (het aantal verschillende grijstinten die de camera kan opnemen). Een ander problematisch configuratie treedt op wanneer het object van belang is zeer dicht bij het brandvlak. In dit geval worden de reële en virtuele beelden van het object gereconstrueerd in de nabijheid, die tot ingewikkelde optische velden die moeilijk te interpreteren zijn. Een tweede, iets minder belangrijk zorg is hier dat de resulterende diffractie franjes nemen minder van de beeldsensor, en dit-grovere korrel informatie leidt tot een slechtere kwaliteit van de wederopbouw.
In de praktijk wordt een eenvoudige verloop filter toegepast driedimensionaal volume sterke tot inversies detecteren langs de belichting richting. Regio's waar de intensiteit verandert snel van licht naar donker, of vice versa, worden vervolgens gekoppeld aan verstrooiing regio. Zwak-verstrooiing objecten zijn goed beschreven als een noninteracting verzameling van dergelijke elementen 20, deze individuele bijdragen som aan de totale verstrooide veld die gemakkelijk wordt omgekeerd met behulp van de Rayleigh-Sommerfeld terug voortplanting methode. In dit artikel wordt de axiale intensiteit gradiënt techniek toegepast op een keten van Streptococcus cellen. De cellichamen zijn fase objecten (de soort E. coli heeft een brekingsindex gemeten 21 om 1,384 bij een golflengte λ = 589 nm, de Streptococcus stam waarschijnlijk vergelijkbaar zijn) en worden als een hoge-intensiteit keten van verbonden blobs in the monster volume na verloop filter is toegepast. Standaard drempel en feature extractie toegepaste deze gefilterde volume kan de extractie van volumetrische pixels (voxels) overeenkomt met het gebied binnen de cellen. Een bijzonder voordeel van deze werkwijze is dat het eenduidige reconstructie van de positie van een object in axiale richting. Vergelijkbare methoden (tenminste, die dat record hologrammen dicht bij het object, in beeld gebracht door middel van een microscoop objectief) last van het niet kunnen het teken van deze verplaatsing te bepalen. Hoewel de Rayleigh-Sommerfeld reconstructie methode is ook aanmelden onafhankelijk in die zin is de gradiënt werking stelt ons in staat om onderscheid te maken tussen zwakke fase objecten boven en onder het brandvlak.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
1. Setup and Data Acquisition
2. Reconstructie
De eerste stap van de verwerking gegevens numeriek heroriënteren een videoframe in een reeks van verschillende dieptes, waardoor een stapel afbeeldingen. Gebruiksvriendelijke software om dit te doen kan hier worden gevonden: http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html samen met bijvoorbeeld foto's (verkregen met behulp van een omgekeerde microscoop en een 60X olie-immersie objectief) en een scène bestand voor ray getraceerd rendering.
3. Weergave
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Om de mogelijkheden van Dihm tonen, werden experimenten uitgevoerd op een keten van Streptococcus bacteriën. De ketting zelf gemeten 10,5 mm lang en bestond uit 6-7 sfero-cilindrische cellen (twee van de cellen in de keten nabij delen) met een diameter in het traject 0,6-1 urn. Figuren 1a en 1b tonen de hoofdinterface van de wederopbouw en rendering software. Voorbeelden van numerieke heroriëntatie procedure worden gezien in figuur 2, waarbij een ruimtelijk ban...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
De belangrijkste stap in deze experimentele protocol is het nauwkeurig vastleggen van beelden van een stabiele experimentele opstelling. Met een slechte achtergrond data, high fidelity reconstructie is bijna onmogelijk. Het is ook belangrijk om objectieven vermijden intern fasecontrast element (zichtbaar als een donkere ring bij het kijken door de achterkant van het doel), omdat deze het gereconstrueerde beeld kunnen afbreken. Het doel van belang moeten ver genoeg van de focal plane dat een paar paren van diffractie fra...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
De auteurs danken Linda Turner voor hulp aan de microbiologische voorbereiding. RZ en LGW werden gefinancierd door het Instituut Rowland aan Harvard en CGB werd gefinancierd als geleerde een CAPES Foundation, Science without Borders Program, Brazilië (Process # 7340-11-7)
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Nikon Eclipse Ti-E omgekeerd microscoop | Nikon Corp. | ||
| LED | Thorlabs | M660L3 | emissiegolflengte λ=660 nm, lijnbreedte ongeveer 20 nm |
| LED-voeding | Thorlabs | LEDD1B | |
| Schroefdraadadapter | Thorlabs | SM2T2 | |
| Schroefdraadadapter | Thorlabs | SM1A2 | |
| Frame Grabber board | EPIX | PIXCI E4 | |
| High-Speed CMOS camera | Mikrotron | MC-1362 |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission