Trypsine Digest Protocol bij het netvlies Vasculature van een muismodel Analyseer

Samenvatting

Trypsine digest is een van de meest gebruikte methoden voor retinale vasculatuur analyseren. Dit manuscript beschrijft de methode in detail, met inbegrip van belangrijke wijzigingen aan de techniek te optimaliseren en te verwijderen van de niet-vaatweefsel met behoud van de algehele architectuur van de schepen.

Samenvatting

Trypsine digest is de gouden standaard methode voor het analyseren van de retinale vaatstelsel ^1-5. Het maakt visualisatie van het gehele netwerk van complexe driedimensionale retinale bloedvaten en haarvaten door een tweedimensionale platte bevestiging van de verbonden vasculaire kanalen na digestie van de niet-vasculaire componenten van de retina. Hierdoor kan men verschillende pathologische vasculaire veranderingen, zoals microaneurysms, capillaire degeneratie en abnormale endotheliale te pericyte verhoudingen bestuderen. De methode is technisch moeilijk, vooral muizen, die de meest beschikbare diermodel om retina studie vanwege het gemak van genetische manipulaties ^6,7 geworden. In de muis oog, is het bijzonder moeilijk de niet-vasculaire componenten volledig verwijderen terwijl de algehele architectuur van de retinale bloedvaten. Tot op heden is er een gebrek aan literatuur die de trypsine digest techniek beschrijft in detail in de muis. Dit manuscript bevat een gedetailleerde stap-voor-stap methode van de trypsine digest in muisretina, terwijl het ook tips over het oplossen van problemen moeilijke stappen.

Inleiding

Visualiseren van de vasculatuur van het netvlies is een zeer belangrijke aanpak de mechanismen van verschillende oogziekten zoals diabetische retinopathie ontleden. Het maakt het mogelijk om de vroegste vasculaire afwijkingen, waaronder microaneurysms, capillaire degeneratie, en pericyte verlies ^8,9 beoordelen. Tot op heden zijn er diverse technieken ontwikkeld om de retinale vasculatuur analyseren geweest. Perfusie van verschillende kleurstoffen is gebruikt om de schepen te markeren, maar ze hebben allemaal dezelfde beperkingen als gedeeld. Injectie zelden benadrukt het gehele retinale vasculatuur indien gegeven bij een hoge druk, welke risico scheuren en beschadiging van de vaten ^1. Immunokleuring van vasculaire endotheel met fluorofoor-gelabelde G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 geconjugeerd; I21413, Invitrogen, 1:100 verdunning) en retinale platte mounts kan de algemene architectuur van de schepen te markeren, maar zonder gedetailleerde visualisatie van haarvaten, basaalmembranen en pericytes . Het werd opgemerkt doorFriedenwald dat schepen door kleuring flatscreen-mounts van het netvlies met periodieke zuur-Schiff (PAS) of hematoxyline en eosine (H & E) kleuring ¹⁰ kan worden gemarkeerd. Echter, kleuring was niet specifiek voor de vaartuigen en wezen niet-vasculaire weefsels alsmede, waardoor het moeilijk om de schepen differentiëren. In de jaren 1960, en Cogan Kuwabara ontwikkelde de trypsine digestie techniek die het gemakkelijker gemaakt om de retinale vasculatuur visualiseren digereren de vasculaire componenten van de retina ^1. Sinds die tijd heeft het trypsine digest uitgegroeid tot de gouden standaard methode in het analyseren van het vaatstelsel van het netvlies ^2-5. Het is echter belangrijk op te merken dat andere alternatieve technieken voor de vasculatuur isoleren zijn beschreven. Het gebruik van osmotische lysis is gebruikt om de vasculatuur te isoleren en laat biochemische studies van het weefsel ^11,12, maar de procedure niet is gebruikt als een primaire methode voor anatomische studie. Het weefsel print-methode is geweestgebruikt om grote segmenten van capillairen isoleren en laat de mogelijkheid om de elektrotone architectuur van de vasculatuur ¹³ bestuderen. In theorie zou deze techniek ook gebruikt worden om anatomische veranderingen te bestuderen, aangezien de kwaliteit van de vaten hoog. Het is echter alleen in staat om delen van het gehele vaatstelsel netwerk isoleren. Hoewel deze methoden niet kan vervangen trypsine verteren, is het belangrijk op te merken dat ze verschillende voordelen en tekortkomingen en zijn complementair in dit verband.

De trypsine digest methode is technisch uitdagend en moeilijk om consequent ^6,7 voeren. Voorts is geconstateerd dat trypsine digestie bijzonder moeilijk een muismodel, vooral wanneer men wenst de algemene vasculaire architectuur van de retina ^6,7 bewaren. Uitdagingen omvatten (1) over-digestie van het netvlies dat het verlies van zowel de vasculatuur en niet-vasculair weefsel veroorzaakt, (2) onder-digestie, waarbijuitgebreide mechanische dissectie hetgeen weer leiden tot beschadiging van het membraan bed, (3) slechte scheiding van de niet-vasculair weefsel van het vaatstelsel leidt tot niet-specifieke kleuring. Verschillende handschriften hebben gewezen op deze uitdagingen, maar niemand heeft een gedetailleerde en consistente protocol om ze te overwinnen ^14,15. Dit manuscript zal een stap-voor-stap methode waarin de techniek om de trypsine digest uitvoeren op muizen en ratten netvliezen met concrete tips over het omgaan met de bijzonder moeilijke stappen te introduceren. Een schematisch overzicht in figuur 1.

Protocol

1. Retinale Voorbereiding

1. Ophelderen van de muis oog. Met een hand, opent de oogleden zodat het oog zichtbaar is. Bij de andere kant, met een gebogen pincet (gebogen naar boven), druk uitoefenen op superieure en inferieure aspecten van de baan tot de wereld uitsteekt. Sluit tang op het achterste deel van het oog en til in een continue beweging voor het oog ophelderen.
2. Bevestig oog met 10% neutraal gebufferde formaline gedurende tenminste 24 uur.
3. Plaats eye in PBS oplossing in een kleine petrischaal.
4. Ontleden netvlies zorgvuldig onder een microscoop, de zorg om te voorkomen dat het induceren grote tranen. Maak een eerste snede in het hoornvlies met dissectie schaar. Dan, terwijl de cut gebied met rechte tang, met een schaar te snijden langs de grens van het hoornvlies en sclera verwijderen van het hoornvlies. Met behulp van fijne gebogen en rechte pincet, zorgvuldig verwijderen van de sclera en choroidea weg van het netvlies naar de optische zenuw. Deze stap vereist geduld alssnel vrijmaken van het netvlies kan leiden tot scheuren. Verwijder de lens en de overmaat iris en vuil van de retina ^16.

2. Water Wast

1. Plaats netvlies in een 24-well schotel en bedek met water (ongeveer 500 pl, gefilterd met minstens een 45 um filter).
2. Verander water om de 30 min-1 uur, minstens 4-5 keer.
3. Laat een nacht in water met een zacht schudden bij kamertemperatuur.

Opmerking: De wasstappen zijn zeer belangrijk omdat zij scheid de neurale retina lagen van de bloedvaten.

3. Trypsine Digest

1. Verwijder water en incubeer retina in een oplossing van 3% trypsine (Difco 1:250) in 0,1 M Tris buffer (pH 7,8) bij 37 ° C onder zacht schudden om zonder. Trypsine digest wordt voltooid wanneer het weefsel begint tekenen van desintegratie (ongeveer 1,5 uur).
   Opmerking: Vermijd snelle schuddenomdat dit het vaatstelsel beschadigen.
   
2. Zorgvuldig, pipet uit trypsine in een aparte goed met behulp van een microscoop om te voorkomen dat het aanraken van het netvlies. Deze overmaat trypsine kan later worden gebruikt, bij het manipuleren van de schepen onder de microscoop, in stap 4.3.

4. Het scheiden van de Vasculatuur

1. Voeg gefilterd water aan de retina. Vervolgens proberen af ​​te pellen van de interne grensmembraan met een pincet, met een schaar indien nodig. Schud met mild roeren gedurende 5 minuten. Zorgvuldig, pipet uit het water onder de microscoop beschadiging van het netvlies te voorkomen.
2. Herhaal water wast (voor elke 5 min) om gratis het netwerk van schepen uit de adherente netvliesweefsel helpen. Water wast zijn voltooid wanneer er weinig tot geen vuil achterblijft in het water na het wassen.
3. Zorgvuldige manipulaties onder een dissectie microscoop zijn nu nodig om verder vrij te maken van het netwerk van de schepen. Hieronder zijn enkele nuttige technieken die kunnen worden gebruikt in sequentie of individually om het gewenste resultaat op basis van technische voorkeur te bereiken:
   1. Met behulp van een 200 ul pipet voorzichtig pipet water omhoog en omlaag naast schepen, blazen water op schepen, waardoor zacht schudden.
   2. Met behulp van 200 ul pipet, pipet de trypsine op en neer om te helpen jas wanden van de pipet. Dan voorzichtig pipet het gehele netwerk schip keer op en neer om te helpen af te breken niet-vasculair weefsel.
      Opmerking: centreren de pipetpunt in de oogzenuw plaats van de randen van het vasculaire netwerk kan ook voorkomen dat de vasculatuur plakken aan de tip.
      
   3. Til vaatstelsel met fijne tang uit het water om niet-vasculaire componenten verjagen.
   4. Als de bovenstaande stappen niet werken, voeg trypsine aan het netvlies te helpen het weefsel afbreken, en incubeer bij 37 ° C gedurende enkele minuten. Verwijder vervolgens trypsine en herhaal de stappen 4,1-4,3.

Opmerking: Zorg ervoor dat de vacht alle instrumenten die in contact met de schepen in trypsine (bv. pipet tip, tangen) zal komen. Zo voorkomt hechting van vasculatuur van de apparatuur.

5. Visualiseren van het vaatstelsel

1. Plaats een druppel water op een schoon objectglas. Met behulp van een 200 ul pipet of tang, overdracht van de verteerde schepen in het water. Zorg ervoor dat de vasculaire flat-mount is ontvouwd. De oppervlaktespanning van het water helpt om de nu doorschijnende vasculaire netwerk ontvouwen. Als het weefsel niet ontvouwen, voeg extra water en schud de dia te vergemakkelijken ontvouwen.
2. Verwijder overtollig water heel langzaam door pipetteren of met behulp van een papieren handdoek.
3. Laat dia's volledig drogen.
4. Vlek slides via geschikte protocol met ofwel PAS / hematoxylin of H & E kleuring.
   Opmerking: PAS / hematoxyline zijn nuttig om vaatwand celkernen, H & E is nuttig voor demonstration van RBC ook.
   
5. Uitdrogen en mount (Permount montage medium).

Resultaten

Het eindproduct van een succesvolle procedure is een platte montage van het gehele netwerk van de muis retinale vasculatuur, met de architectuur behouden, gekleurd met ofwel PAS / hematoxyline of H & E, zoals getoond in figuren 2-4. Duidelijke differentiatie van endotheliale cellen en pericyten te zien zoals weergegeven in figuur 3. In de retina, de kernen van endotheelcellen ovaal of langwerpig en liggen geheel binnen de vaatwand. Pericyte kernen zijn kleine, bolvormige, vlek dicht...

Discussie

Trypsine digest is een standaardmethode om de vasculatuur van het netvlies te beoordelen. Helaas, het is technisch uitdagend en kan leiden tot een hoge mate van specimen verlies indien niet correct uitgevoerd. Verder is de bijzonder moeilijk in muizen, waarin de toepassing van deze techniek in het algemeen gebruikte genetische diermodellen van oogziekten kunnen beperken. Dit document geeft richtlijnen over hoe de procedure doeltreffend en consequent uit te voeren in de muis ogen.

Er zijn een...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
REAGENTS
10% neutraal gebufferd formalin	Fischer Scientific	SF100-4
Trypsine (1:250)	Amresco	0458-50G	Maak 3% trypsine in 0,1 M Tris
TRIZMA base	Sigma	T1503-1KG	Maak 0,1 M Tris Buffer (pH 7,8 @ 37 °C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Steritop steriele vacuümfles	Millipore	SCGPS05RE	Maak gefilterd water
APPARATUUR
Dissectiemicroscoop			Elke microscoop die een goede visualisatie van de retina mogelijk maakt, is voldoende. (10x is voldoende met een werkafstand van 24 mm)
Rechte schaar	Fine Science Tools	15024-10	Snijrand: 8 mm; Tipdiameter: 0,2 mm; 10 cm
Rechte pincet (Inox)	Dumont #5	11252-20	Biologie tip; 0,05 x 0,02 mm; 11 cm
Gebogen pincet (Dumostar)	Dumont #7	11297-10	Biologie tip; 0,07 x 0,04 mm; 11,5 cm
Dubnoff Metabolische Shaker Incubator	Precision Scientific	BDG59442	Shaker optioneel
24-wells schaal	Falcon	353047
Microscoopglaasjes	VWR	82027-132