Karakterisering van inflammatoire reacties tijdens intranasale kolonisatie met Streptococcus pneumoniae

Samenvatting

Kolonisatie van de muriene nasopharynx met Streptococcus pneumoniae en de daaropvolgende extractie van aanhangende of gerekruteerde cellen wordt beschreven. Deze techniek omvat het spoelen van de nasopharynx en het opvangen van de vloeistof door de nares en is aanpasbaar voor verschillende uitlezingen, waaronder differentiële celkwantificering en analyse van mRNA-expressie in situ.

Samenvatting

Nasofaryngeale kolonisatie door Streptococcus pneumoniae is een voorwaarde voor invasie in de longen of bloedbaan¹. Dit organisme is in staat om het mucosale oppervlak van de nasopharynx te koloniseren, waar het kan verblijven, zich kan vermenigvuldigen en uiteindelijk gastheerverdediging kan overwinnen om andere weefsels van de gastheer binnen te dringen. Het vaststellen van een infectie in de normaal lagere luchtwegen resulteert in longontsteking. Als alternatief kunnen de bacteriën zich verspreiden in de bloedbaan die bacteriëmie veroorzaakt, wat gepaard gaat met hoge^{sterftecijfers 2}, of anders rechtstreeks leiden tot de ontwikkeling van pneumokokken meningitis. Het begrijpen van de kinetiek van en immuunresponsen op nasofaryngeale kolonisatie is een belangrijk aspect van S. pneumoniae-infectiemodellen.

Ons muismodel van intranasale kolonisatie is aangepast aan menselijke modellen³ en is gebruikt door meerdere onderzoeksgroepen in de studie van gastheer-pathogene reacties in de nasopharynx^4-7. In het eerste deel van het model gebruiken we een klinisch isolaat van S. pneumoniae om een zelfbeperkende bacteriële kolonisatie vast te stellen die vergelijkbaar is met vervoergebeurtenissen bij menselijke volwassenen. De hierin beschreven procedure omvat de bereiding van een bacterieel entmateriaal, gevolgd door de vaststelling van een kolonisatiegebeurtenis door levering van het entmateriaal via een intranasale toedieningsweg. Ingezeten macrofagen zijn het overheersende celtype in de nasopharynx tijdens de steady state. Meestal zijn er weinig lymfocyten aanwezig in niet-geïnfecteerde muizen⁸, maar mucosale kolonisatie zal leiden tot laag- tot hoogwaardige ontsteking (afhankelijk van de virulentie van de bacteriële soort en stam) die zal resulteren in een immuunrespons en de daaropvolgende rekrutering van gastheerimmuuncellen. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd door een lavage van de tracheale inhoud door de nares, en gecorreleerd met de dichtheid van kolonisatiebacteriën om de kinetiek van de infectie beter te begrijpen.

Protocol

Voordat u begint: alle stappen worden uitgevoerd in een Biohazard Level 2 (BSL2) Biological Safety Cabinet (BSC), tenzij anders vermeld. Zorg ervoor dat u de juiste Biohazard-goedkeuring hebt verkregen voor het gebruik van infectieuze bacteriële pathogenen volgens de institutionele richtlijnen voorafgaand aan de start van de experimenten. Zorg er bovendien voor dat u over alle materialen en reagentia beschikt die nodig zijn om de procedure vooraf uit te voeren. Muizen die in deze experimenten werden gebruikt, omvatten vrouwelijke C57BL/6-muizen van Jackson Laboratories, Charles River of Taconic en waren 10-14 weken oud (hoewel we geen genderafhankelijke significante verschillen hebben gevonden in kinetiek van nasale kolonisatieklaring of infectie). Alle muizen die in deze experimenten werden gebruikt, werden gefokt en onderhouden onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden en waren vrij van veel voorkomende virussen (LCMV, MNV, MPV, reovirus ECTV en andere) bacteriën(bijv. H. pylori)en parasieten(bijv. pinworm, ectoparasieten) door fecale monstertests en frequente anatomische beoordeling van schildwachtmuizen die in hun faciliteitsruimten waren ondergebracht. Bij het uitvoeren van deze experimenten raden we aan om controlemuizen te gebruiken die niet jonger zijn dan 10-12 weken en niet ouder zijn dan 6 maanden. Muizen jonger of ouder dan deze leeftijdscategorie zijn vatbaarder voor langere nasofaryngeale vervoersduur en verhoogde kans op verspreiding van infectie. Muisachtergrond is een andere belangrijke overweging die van invloed kan zijn op de resultaten van een kolonisatie-experiment, omdat verschillende groepen hebben aangetoond dat muizen met verschillende genetische achtergronden verschillende gevoeligheid hebben voor de S. pneumoniae D39 (serotype 2) stam^9,10. S. pneumoniae is geen natuurlijk voorkomende muriene ziekteverwekker en het enige natuurlijke reservoir is de menselijke nasopharynx. Overdracht vindt plaats via ademhalingsdruppels en omdat muizen geen respiratoire afscheidingen produceren, kunnen individuele muizen de bacterie niet overbrengen op andere muizen, dus er is geen bezorgdheid over overdracht van muis naar muis¹¹. Voor een visueel overzicht van de procedures die in dit manuscript worden beschreven, verwijzen wij u naar figuur 1.

1. Voorbereiding van S. pneumoniae Cultuur

1. Ent 5 ml tryptische soja-agar in voor de suspensiegroei van Streptococcus pneumoniae.
2. Kweek onder statische omstandigheden bij 37 °C in 5% CO₂ totdat het bacteriële entmateriaal de groei van de logfase bereikt met een overeenkomstige vloeistofdichtheid van 10⁸ KVE/ml zoals bepaald door een kilometerteller ingesteld op 600 nm. De exacte meting die overeenkomt met deze KVE zal verschillen afhankelijk van de specifieke geselecteerde bacteriestam; voor de meeste stammen van S. pneumoniae komt dit overeen met een OD₆₀₀ bereik van 0,45-0,55. Meestal zullen S. pneumoniae stammen in vloeibare cultuur groeien tot deze dichtheid binnen 1,5-2,5 uur onder de aanbevolen omstandigheden, zonder subculturing. De cultuur mag niet overgroeien (verder dan een OD-waarde van 0,75), omdat dit het punt vertegenwoordigt waarop de bacteriën niet langer in de groeifase van de logfase zijn en uitgebreide autolyse ondergaan.
3. Elke muis wordt ingeënt met ongeveer 10⁷ bacteriën. Daarom, voor elke 9 muizen die gekoloniseerd moeten worden, pipetteer 1 ml entmateriaal in een Eppendorf-buis en draai gedurende 1 minuut op 15.000 x g. Een witachtige pellet moet zichtbaar zijn. Verwijder het supernatant, zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort en resuspend de bacteriën in 100 μl fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), waardoor de concentratie wordt verhoogd tot 10⁹ KVE/ml. In dit stadium moeten de bacteriën levensvatbaar blijven, maar zullen ze zich niet gemakkelijk repliceren.
4. Als u meerdere aliquots gebruikt, combineer dan in één buis om te controleren op kleine variaties in de bacteriële dichtheid tussen de monsters.
5. Houd bacteriën op ijs tot ze klaar zijn voor inenting, gedurende maximaal 1 uur.
6. Om een exact bacterieel aantal te verkrijgen, voert u log-wise seriële verdunningsreeksen uit die beginnen met net bacteriële entmateriaal. Verdun serieel 10-voudig en voeg 10 μl steriel PBS toe tot 90 μl.
7. Plaat uit 3 druppels van 10 μl monsters van verdunningen 10^-5 - 10^-9, plus een PBS-only contaminatie controle, op afzonderlijk gelabelde secties van tryptic soja agar (TSA) plaat aangevuld met 5% schapenbloed (Figuur 2). Zorg ervoor dat pipettips voor elke stap worden verdunnen van een hogere CFU-concentratie naar een lagere CFU-concentratie om te voorkomen dat overtollige bacteriën worden overgedragen en de variabiliteit van de resultaten toeneemt. Human blood agar (HBA) platen kunnen ook worden gebruikt in plaats van TSA. Aangezien veel stammen van S. pneumoniae resistent zijn tegen neomycine (van 5-20 μg/ml), kan dit antibioticum ook worden toegevoegd aan het agarmedium naar keuze tijdens de plaatvoorbereidingsfase. Dit vergemakkelijkt de opsomming omdat het niet-resistente bacteriën elimineert. De gevoeligheid van antibiotica voor elke stam moet vooraf worden getest om de optimale concentratie antibiotica te bepalen die voor elke bacteriële stam moet worden gebruikt.
8. Laat 15-30 minuten onbedekt drogen, dek vervolgens platen af en plaats ondersteboven in bacteriële incubator ingesteld op 37 °C en 5% CO₂. Groei bacteriële kolonies op plaat voor 24 uur.
9. Bepaal het aantal kolonievormende eenheden en hun overeenkomstige concentratie. Op basis van de bepaling van de OD_600-waarde moet de concentratie binnen het bereik van 1-4 x 10⁹ KVE/ml liggen. S. pneumoniae-kolonies moeten verschijnen als kleine, cirkelvormige kolonies met een geelachtig beige kleur, met een kleine depressie in het midden waardoor ze een donutachtig uiterlijk krijgen (Figuur 3).

2. Murine Intranasale Kolonisatie

1. Houd muizen vast door ze in een muisremapparaat te plaatsen (een gemodificeerde Falcon-buis van 50 ml met de punt afgesneden om een opening te creëren) en ze met de duim aan de basis van hun lichaam vast te zetten, zodat hun neuzen gewoon uit het taps toelopende uiteinde van het beveiligingsapparaat komen (Figuur 4). Het gebruik van dit apparaat maakt immobilisatie van het hoofd van de muis en segregatie van zijn nares mogelijk op een manier die beweging minimaliseert en pogingen van het dier belemmert om de pipetpunt te mastiekeren, waardoor de entbuis volledig kan worden geleverd. Als alternatief kunnen muizen worden geïmmobiliseerd door schuren in de nek en handmatige terughoudendheid. We raden anesthesie van de dieren niet aan voorafgaand aan intranasale inenting. Het beheer van het entmateriaal aan dieren onder narcose resulteert in een deel van het entmateriaal dat zich naar de longen verspreidt^12,13.
2. Gebruik een P10- of P20-pipet ent elke muis in door 10 μl van de bereide cultuur af te zetten en gelijkmatig over beide nares te verdelen (laat het entmateriaal in de neus druppelen door de inenting geleidelijk te pulseren, waardoor muizen de tijd nemen om in entmateriaal in te ademen). Om volledige levering van het entmateriaal te bereiken, pauzeer de toediening op elk moment dat de muis zijn neus overmatig begint te bewegen. Het hele entmateriaal mag niet in de nares worden geïnjecteerd, omdat de muizen tijdens de uitademing sommige door de neus kunnen verdrijven; omdat de verdreven hoeveelheid echter de neiging heeft minuscuul te zijn en het entmateriaal een extreem hoge hoeveelheid bacteriën bevat, heeft dit geen significante invloed op de koloniserende bacteriële belasting. Bovendien is het oppervlak dat beschikbaar is voor kolonisatie in het nasofaryngeale slijmvlies beperkt en daarom hebben wij en anderen ontdekt dat de aanbevolen dosis van 10⁷ voldoende is om consistente niveaus van bacteriën bij alle muizen te verkrijgen, wat resulteert in minimale variabiliteit in initiële hoeveelheden koloniserende bacteriën^14,15 .
3. Weeg muizen als u gewichtsindicatoren gebruikt als onderdeel van uw eindpuntbewaking. Bewaak muizen elke 12-24 uur op klinische symptomen, waaronder lethargie, ruches en gewichtsverlies. Muizen zullen meestal pas 3-5 dagen na kolonisatie symptomen van ziekte vertonen, en deze zullen worden voorafgegaan door gewichtsverlies, wat gemiddeld ongeveer 5% van het totale lichaamsgewicht per dag kan bedragen. Naarmate de muizen steeds zieker worden, zullen ze gebochelde houdingen aannemen en verminderde activiteit en verminderde reactie op stimulatie vertonen, inclusief behandeling. In dit stadium is ziekte meestal indicatief voor sepsis en/of longontsteking en zal waarschijnlijk terminaal zijn, hoewel muizen dagelijks met 1 ml onderhuidse zoutoplossing kunnen worden behandeld om de resultaten te verbeteren. Overlevende muizen zouden na dag 7 na kolonisatie verbetering moeten vertonen, zoals blijkt uit stabilisatie van het gewicht gevolgd door gewichtstoename, hoewel verschillende stammen van S. pneumoniae sneller ziekte kunnen veroorzaken en kunnen resulteren in progressie van klinische symptomen langs een andere tijdslijn. Zie figuur 5 voor een representatief resultaat van het gewicht dat wordt bijgehouden bij muizen die gekoloniseerd zijn met de P1547-stam.

3. Nasale Lavage Sample Collection

Voor aanvang: bereid gekanuleerde naalden met 1 ml spuiten afgedekt met 26 3/8 G afgeschuinde naalden. Snijd 2,5 cm stukken PE20 polyethyleen buizen met een binnendiameter van 0,38 mm, zodat elk uiteinde een afgeschuinde punt heeft. Schuif met een tang een 2,5 cm lang stuk PE20 polyethyleen slang (binnendiameter 0,38 mm) op de naaldpunt, om te voorkomen dat de buiszijde wordt doorboord. Gekneneerde naalden kunnen tot het nodig is in 70% ethanol worden bewaard.

1. Euthanaseer experimentele muizen. Aangezien cervicale dislocatie de luchtpijp kan beschadigen, moet deze methode van euthanasie worden vermeden. Onze voorkeursmethode is isofluraan anesthesie gevolgd door exsanguinatie, maar zorg ervoor dat u de institutionele richtlijnen volgt bij het selecteren van de wijze van euthanasie.
2. Steriliseer met 70% waterige ethanol de superoanteriorbont van het dier, met name de nek, en zorg ervoor dat ethanol geen toegang krijgt tot de nares.
3. Maak een enkele longitudinale snede langs de middellijn van de nek van het dier en twee horizontale sneden aan beide uiteinden, waardoor een opening ontstaat om de luchtpijp voor te stellen.
4. Pel de huid voorzichtig naar beide kanten terug en laat het nekweefsel eronder zien.
5. Luchtpijp moet zichtbaar zijn, omgeven door longitudinale spieren aan weerszijden. Knip deze zorgvuldig door om een duidelijk zicht op de luchtpijp zelf te geven en zorg ervoor dat de omliggende vasculatuur niet wordt doorsnijden.
6. Als de vasculatuur is doorgesneden en er bloed aanwezig is, laat het bloeden dan stoppen voordat u doorgaat, en reinig het gebied vervolgens meerdere keren door steriel PBS te doseren en steriel gaas te gebruiken om overtollig vocht in het gebied voorzichtig op te nemen.
7. Zodra de luchtpijp goed is blootgesteld, maakt u een dwarse, semilunar sneed in de luchtpijp ongeveer halverwege (Figuur 6).
8. Maak 1.000 μl gesteriliseerde PBS in eerder bereide cannulated naald.
9. Steek de canule in de luchtpijp naar de neus toe, waarbij de afgeschuinde rand naar beneden wordt gericht voor het inbrengen (figuur 7). Zodra de naald op zijn plaats zit, draait u deze 180° en sondet u voorzichtig naar boven totdat u lichtbestendigheid voelt.
10. Plaats Eppendorf aangewezen voor monsterverzameling net onder de neus van de muis.
11. Test de juiste plaatsing van de naald door een minimale (~ 20 μl) hoeveelheid PBS-lavagevloeistof te doseren - er moet een druppel vloeistof rond de nares van de muis ontstaan; als dit het geval is, gaat u verder met stap 3.13).
12. Als test PBS rechtstreeks uit de mond van het dier komt, trek dan de canule naar achteren en herpositioneer door opnieuw voorzichtig naar voren te tasten totdat een zeer lichte weerstand wordt gevoeld - zorg ervoor dat u de canule niet te ver voorbij deze weerstand duwt, omdat u deze langs het neusgehemelte en door naar de mondholte beweegt.
13. Doseer de inhoud van de naald snel om te helpen verplaatsen en verzamel maximale hoeveelheid cellen - de inhoud moet door de nares van de muis en in de verzamelbuis stromen. Plaats het monster onmiddellijk op ijs.
14. Herhaal stap 3.8-3.13) met een gekantelde naald met 500 μl RNA-lysisbuffer op dezelfde muis om monsters te verzamelen voor RNA-analyse. Hierdoor kan een lysaatmonster worden verzameld uit de resterende celpopulaties, grotendeels samengesteld uit het nasofaryngeale mucosale epitheel, omdat niet-adherente cellen hadden moeten worden verwijderd na de eerste PBS-lavage. Houd er rekening mee dat de RNA-lysisbuffer het epitheel zal denude en het omliggende weefsel zal vernietigen, dus zorg ervoor dat contact met organen zoals de longen wordt vermeden, als het behoud van deze weefsels gewenst is. Eenmaal verzameld, plaatst u het monster in de RNA-lysisbuffer direct op droog ijs om te bevriezen. Eenmaal in de lysisbuffer kunnen monsters worden opgeslagen volgens de instructies van de fabrikant en zijn ze gedurende enkele maanden stabiel bij -70 °C.

4. Bepaling van bacteriële belasting in de Nasopharynx

1. Kwantificeer bacteriën door een seriële verdunningsreeks voor elk murien neusspoelingsmonster voor te bereiden. Over het algemeen kan worden verwacht dat de bacteriële belasting tussen 0-10⁴ KVE zal zijn, en daarom drie 10-voudige seriële verdunningen uitvoeren. Voeg 10 μl van het nette neusspoelingsmonster (100 KVE/ml) toe aan de eerste buis tot een concentratie van 10^-1 KVE/ml. Vortex grondig.
2. Verdeel de bacteriologische plaat in kwadranten en labelkwadranten met elk een lid van de verdunningsreeks (10⁰-10^-3 KVE/ml). Plaat uit 3 druppels van 10 μl monsters van de 3 verdunningen en het nette monster op tryptische soja agar platen aangevuld met 5% schapenbloed, zoals in figuur 2.
3. Laat 15-30 minuten onbedekt drogen, dek vervolgens platen af en plaats ondersteboven in bacteriële incubator met optimale omstandigheden voor bacteriegroei (meestal 37 °C en 5% CO₂).
4. Groei bacteriële kolonies op plaat voor 18-24 uur.
5. Bepaal het aantal koloniserende bacteriën door de kolonies die voor elke verdunning op de plaat zijn gevormd, te gemiddelden (figuur 3). Figuur 8 toont bacteriële dichtheid tijdens verschillende tijdspunten, zoals bepaald door de cultuur van neusspoeling, bij muizen gekoloniseerd met 3 verschillende stammen van S. pneumoniae gedurende maximaal 21 dagen.

5. Voorbereiding van monsters voor flowcytometery

Voor aanvang: Bereid een mix van antilichamen voor. Voor kwantificering van leukocytenpopulaties raden we de volgende mix aan bij de gespecificeerde verdunningen: PE-Ly6G (kloon 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (kloon AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (kloon 30-F11, 2,67 μg/ml), APC-F4/80 (kloon PM8 0,67 μg/ml), PerCP-Cy5,5-CD11c (kloon N418 RUO, 0,5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (kloon M1/70, 0,33 μg/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (kloon 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 Houd er rekening mee dat deze mix 2x in concentratie is (zie stap 5.5). Alle antilichamen moeten worden verdund in FACs Wash buffer (0,5% foetale kalfsserum, 2mM EDTA, 0,1% natrium azide in PBS) die ook vooraf moet worden bereid. In een mengsel van isotypegematchte controleantistoffen, idealiter van dezelfde leverancier als de gelabelde antilichamen en in dezelfde concentraties als de specifieke antilichamen, moet worden bereid. De monsters die met de isotypecontroleantistoffen worden behandeld, zullen als negatieve controle fungeren. Eventuele fluorescentie die wordt waargenomen in de monsters die met de isotypecontroleantistoffen worden behandeld, moet als achtergrond worden beschouwd.

1. Prechill een centrifuge die 1,5 ml Eppendorf-buizen tot 4 °C kan draaien.
2. Centrifugeer neusspoelingsmonsters bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Pipetteer supernatant voorzichtig uit en reserveer. Opmerking: vanwege de kleine hoeveelheid cellen in de nasopharynx zal de celkorrel niet zichtbaar zijn tenzij er ongewenste rode bloedcelverontreiniging is, die rood zal zijn. Als dit wordt gezien, moet het monster worden weggegooid.
3. Resuspend monster in 50 μl Fc? RIIb/CD16-2 (2.4G2) antilichaam (dat Fc-receptoren bindt en niet-specifieke antilichaambinding vermindert) in FACs Wash Buffer bij een concentratie van 4 μg/ml.
4. Incubeer het monster gedurende 30 minuten op ijs.
5. Voeg 50 μl voorgeprepareerde 2x geconcentreerde fluorescerende antilichaammix toe aan het monster. Zet een representatief monster van elke experimentele groep opzij om als isotypecontrole te fungeren. Voeg de isotype antilichaammix toe aan dit monster in plaats van de vlekmix.
6. Incubeer monster op ijs gedurende 1 uur.
7. Centrifugeer monsters bij 2.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Gooi supernatant en resuspend weg in 200 μl PBS.
8. Herhaal stap 5.7.
9. Na de tweede wasbeurt opnieuw centrifugeermonsters bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
10. Resuspend in PBS (indien onmiddellijk lopend monster) of 2% paraformaldehyde (bij lopende monsters 1-3 dagen na de kleuring).
11. Verzamel bij het uitvoeren van flowcytometrie de maximale hoeveelheid gebeurtenissen per monster of totdat het hele monster is aangezogen. Bij niet-geïnfecteerde, gezonde, jonge muizen zal dit slechts 1.000-2.000 totale gebeurtenissen zijn; Tijdens een bacteriële kolonisatiegebeurtenis kan dit aantal meer dan 2 tot 5 keer toenemen, afhankelijk van de ziektestatus bij dieren en factoren zoals leeftijd en genetische achtergrond. Figuur 9 toont representatieve flow cytometrie resultaten verzameld van een 3-laser Becton Dickenson LSRII flow cytometer met behulp van een Forward Scatter van 450 en Side Scatter van 300, hoewel we raden aan om parameters te optimaliseren voor de specifieke flow cytometer die u van plan bent te gebruiken voorafgaand aan het verzamelen van monsters. Opmerking: als een monster zelfs sporen van bloedverontreiniging bevat, zullen de totale verzamelde gebeurtenissen aanzienlijk hoger zijn dan verwacht en moet het monster worden verdisconteerd uit de analyse.

6. Kwantitatieve PCR (qPCR) Analyse van Nasale Lavages

1. Ontdooicel lyseert vanaf stap 3.14 kamertemperatuur.
2. Volg het aanbevolen protocol dat bij de gewenste RNA-extractie naar keuze wordt geleverd.
3. Na voltooiing van de RNA-extractieprocedure zoals geïnstrueerd, kwantificeer u de hoeveelheid RNA met behulp van een spectrofotometer of elektroforesemethode (figuur 10). We verkrijgen routinematig tussen 975 en 3.250 ng totaal RNA per monster met een 260/280 nm verhouding van >1,7 of een RNA integriteitsgetal (RIN) rond, 8,1±0,13.
4. Transcriber cDNA met behulp van de M-MULV Reverse Transcriptase volgens het protocol van de fabrikant met 1.000 ng RNA (maximaal 13 μl).
5. Verdun de resulterende cDNA-monsters 8x en aliquot gelijkmatig in 4 afzonderlijke buizen voor langdurige opslag bij -20 of -80 °C.
6. Om genexpressie door qPCR te meten, bereidt u 25 μl monstersreacties voor in drievoud op ijs of koud blok met: 12,5 μl 2x qPCR mastermix uit qPCR-kit naar keuze, 0,25 μl referentiekleurstof, 2 μl verdund cDNA (stap 7,5), 1 μl gemengde voorwaartse en omgekeerde primers (400 nM-finale), 2 μl verdund cDNA (stap 7,5), 1 μl gemengde voorwaartse en omgekeerde primers (400 nM-finale), 9 Dit protocol is een aanpassing van eerder gepubliceerde methoden¹⁶.
7. Over het algemeen vinden we dat een qPCR-versterking in twee stappen ( 95 °C gedurende 10 minuten gevolgd door maximaal 40 cycli x [95 °C x 15 sec, 60 °C x 1 min]) effectief is (figuur 11a); elk primerpaar moet echter worden geoptimaliseerd. Dissociatiecurven moeten na versterking worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er geen niet-specifieke versterking optreedt. versterking (figuur 11b)
8. We voeren routinematig standaardcurves uit voor elk geanalyseerd gen, evenals een standaardkalibrator (afgeleid van long- of milthomogenaat) voor elke geanalyseerde 96-putplaat. Relatieve transcripthoeveelheden worden verkregen door eerst de grenswaarden voor de ruwe cyclusdrempel (Ct) te normaliseren door de referentiekleurstof en de resulterende waarden door de respectieve standaardcurve te transformeren. Deze relatieve hoeveelheden worden vervolgens genormaliseerd naar de standaard kalibrator en een huishoudelijk gen, indien van toepassing.

Resultaten

Figuur 1 geeft een overzichtsschema weer met een samenvatting van de belangrijkste stappen van het protocol. De figuren 2-3 geven een visualisatie van de microbiologische methodologie die inherent is aan de hierin beschreven protocollen. Figuur 4 staat voor een juiste positionering van een muis om een intranasale kolonisatie uit te voeren, terwijl figuur 5 typisch veranderingen in gewicht weergeeft van muizen gekoloniseerd met S. pneumoniae stam...

Discussie

In deze studie presenteerden we gedetailleerde methoden voor de intranasale kolonisatie van muizen met behulp van een klinische isolaatstam van Streptococcus pneumoniae en de daaropvolgende isolatie en karakterisering van de immuuncellen die als reactie op de bacteriën worden gerekruteerd voor nasopharynx. We hebben aangetoond hoe een bacterieel entmateriaal kan worden gekweekt in voedingsrijke media en kan worden gebruikt om een kolonisatiegebeurtenis bij muizen vast te stellen, die aanvankelijk beperkt is tot ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-Mouse Ly6C FITC	BD Pharmingen	553104
Anti-Mouse Ly6G PE	BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450	eBioscience	48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC	eBioscience	17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7	eBioscience	25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC	eBioscience	93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20	Becton Dickinson	427406
BD 1 ml Syringe	Becton Dickinson	309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel	Becton Dickinson	305110
Buffer RLT Lysis Buffer	Qiagen	79216
Difco Tryptic Soy Agar	Becton Dickinson	236950
Defibrinated Sheep Blood	PML Microbiologicals	A0404
RNAqueous-Micro Kit	Ambion	AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0253L
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001