Methodenartikel

Bepaling van de toelaatbare vetzuren en Cholera toxine Concentraties behulp Human Intestinal epitheelcellen en BALB / c muis macrofagen

9.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50491

⸱

30 mei 2013

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Kingsborough Community College, 2Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas at Austin, 3New Jersey Center for Science, Technology and Mathematics, Kean University

In dit artikel

Samenvatting

We stellen om aanvaardbare concentraties van drie vetzuren (oliezuur, linolzuur en linoleenzuur) en cholera toxine dat niet significant en negatief effect hadden op overleving van de cel door oplossen van de vetzuren en de toxine en het gebruik ervan in de overleving van de cel assays bepalen.

Samenvatting

De positieve rol van vetzuren in de preventie en verlichting van non-humane en humane ziekten werden en uitgebreid gedocumenteerd. Deze rollen zijn invloeden op infectieuze en niet-infectieuze ziekten, zoals het voorkomen van ontsteking en mucosale immuniteit tegen infectieziekten. Cholera is een acute intestinale ziekte veroorzaakt door de bacterie Vibrio cholerae. Het komt voor in ontwikkelingslanden en indien onbehandeld, kan leiden tot de dood. Terwijl voor cholera vaccins bestaan, zijn ze niet altijd effectief en andere preventieve methoden nodig. We stellen om aanvaardbare concentraties van drie vetzuren (oliezuur, linolzuur en linoleenzuur) en cholera toxine met de muis BALB / C macrofagen en humane intestinale epitheelcellen, respectievelijk bepalen. We oplosbaar bovengenoemde vetzuren en gebruikt celproliferatie assays om de concentratie trajecten en specifieke concentraties van de vetzuren die niet vastt schadelijk voor de menselijke intestinale epitheliale cellevensvatbaarheid. We oplosbaar choleratoxine en gebruikt in een test om de concentratie trajecten en specifieke concentraties van choleratoxine die statistisch cellevensvatbaarheid doen afnemen in BALB / C macrofagen bepalen.

We vonden de optimale vetzuur concentraties tussen 1,5 ng / ul, en die van cholera toxine <30 ng per behandeling. Deze gegevens kunnen toekomstige studies die tot doel hebben een beschermende mucosale rol van vetzuren in de preventie of verlichting van cholera infecties te helpen.

Inleiding

De gezondheidsvoordelen van vetzuren, zoals oliezuur, linolzuur en linoleenzuur werden en worden gedocumenteerd. Bijvoorbeeld, oliezuur helpt penetratie van lipofiele geneesmiddelen in het lichaam 1,2 vergemakkelijken vermindert coronaire hartziekte met 24% wanneer gelezen verzadigde vetzuren 3 en wordt gebruikt om metabolische ziekten zoals Adrenoleukodystrophy 4 is een X-gebonden behandelen erfelijke aandoening van vetzuurmetabolisme. . Terwijl een noodzakelijke voorloper arachidonzuur in zoogdieren, linolzuur (in tegenstelling oliezuur) niet wordt gesynthetiseerd door het lichaam en moet door externe bronnen zoals lijnzaad consumptie door 5 Studies geven verschillende gezondheidsvoordelen van linolzuur zoals: anti-aging eigenschappen voor de huid; 6 anti-inflammatoire eigenschappen; 7 verminderde proliferatie van colorectale en prostaatkanker cellen; 8 en de mogelijkheid om obesitas te bestrijden en promotie of cardiovasculaire gezondheid. 9 linoleenzuur speelt een rol bij het ​​verminderen van periodontale ontsteking, 10 en moduleren tromboxaan en prostacycline biosynthese. 11

Arpita 12 onderzocht de invloed van gal vetzuren en cholesterol op V. cholerae 's expressie van virulentiefactoren en de beweeglijkheid. Yamasaki 13 aangegeven dat methanol extract van rode chili pepers, en andere natuurlijk gewonnen verbindingen, cholera toxine productie potentieel kunnen verlagen. Het is denkbaar om het gebruik van voedingsmiddelen die rijk zijn in de bovenstaande vetzuren (zoals lijnzaad) bij de preventie en verlichting van infectieziekten zoals cholera door het verstrekken van mucosale immuniteit onderzocht. We onderzoeken verricht om vetzuren te solubiliseren en zou op basis van celproliferatie assays, de maximale concentratie van vetzuren die menselijke intestinale epitheliale cellen kan verdragen zonder nadelige gevolgen cell levensvatbaarheid. We veronderstelden dat oliezuur, linolzuur en linoleenzuur verschaffen een gunstig effect op de levensvatbaarheid van cellen bij lagere concentraties, maar bij hogere concentraties zij toxisch voor de cellen is. Ook oplosbaar choleratoxine en bepaald de maximale concentratie van cholera toxine dat BALB / C muizen macrofagen kan verdragen zonder significant in cellevensvatbaarheid. Onze hypothese is een toxisch effect van cholera toxine op levensvatbaarheid van de cellen, zelfs bij zeer lage niveau. Werkwijze solubiliseren een cholera toxine en te gebruiken om de maximale hoeveelheid van het toxine dat de cellen kunnen tolereren zonder significant in overlevingsvermogen bepalen een voordeel voor toekomstige studies. Bijvoorbeeld kan een combinatie van de bovenstaande methoden worden bepaald of vetzuren cellen te voorzien van mucosale immuniteit tegen cholera infecties. Om het beste van onze kennis, is dit rationeel en methodiek niet onderzocht.

Wij discuss hoe onze voorlopige gegevens kunnen worden gebruikt in latere onderzoeken om te bepalen of oliezuur, linolzuur en linoleenzuur cellen te voorzien van mucosale immuniteit tegen cholera-infectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Tissue Culture

  1. Gebruik Mus musculus macrofagen (BALB / c muizen) voor cholera toxine bepalingen. Aanvankelijk cultuur al M. musculus cellen volgens de instructies van leverancier.
  2. Propageren BALB / c muizen cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's Medium met L-glutamine aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% antibioticum / antimycoticum of RPMI 1640 basismedium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 5% L-glutamine en 1 % antibiotische / antimycotische reagens.
  3. Groeien cellen in 75 cm2 flessen met corning ontluchtingsdoppen bij 37 ° C, 95% lucht en 5% CO2.
  4. Brengen humane intestinale epitheelcellen binnen 24 uur na levering volgens de instructies van de fabrikant voor de bepaling van vetzuren vaststellingen.
  5. Propageren humane intestinale epitheel cellen in 75 cm2 flessen met corning ontluchtingsdoppen in HybriCare media aangevuld met 10% FBS en 30 ng / ml menselijk EGF bij 37 ° C. Gebruik geen antibiotica/ Antimycoticum reagentia volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Split alle cellen (01:03) bij ongeveer 70% confluentie.
  7. Bevriezen en brengen alle cellen gedurende het onderzoek met behulp van standaard protocollen vriespunt.
  8. Opmerking: Voor grotere schaal concentratiebepaling van vetzuren, met de sneller groeiende, makkelijker te onderhouden, muis macrofagen aanvankelijk. Voor fijne schaal vetzuurconcentratie bepaling, gebruiken menselijke epitheelcellen. Gebruik de muis macrofagen voor alle cholera toxine behandelingen (zie bespreking).

2. Fatty Acid en Cholera toxine Behandelingen

  1. Overdracht van oliezuur, linolzuur en linoleenzuur van bedrijf-mits glazen ampullen met gesteriliseerde glazen flesjes.
  2. Overdracht vetzuurpercentage een afzonderlijk gesteriliseerde Eppendorf buis en los het eerst in 100% ethanol bij een verdunning van 1:06, en vervolgens in RPMI 1640 compleet media voor een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ul.
  3. Vortex elke oplossing en transferer aan glazen flessen voor opslag in de diepvries (-20 ° C).
  4. Cellaag bij 2.500 cellen / putje in 96 putjes weefselkweekplaten.
  5. Voeg de juiste compleet medium aan de totale goed volume 200 ul voor de behandeling van cellen met vetzuren in voorbereiding MTT assays brengen.
  6. Na een uur wildgroei periode 24, verwijder het papier en vervang het door vers medium.
  7. Voeg de juiste concentratie van elk vetzuur te testen aan de putjes (zie resultaten). Voeg complete media aan het totaal goed volumes tot 200 ui te brengen.
  8. Incubeer de behandelde platen gedurende 24 uren voordat de MTT assay.
  9. Los het choleratoxine in PBS bij een concentratie van 1 mg / ml en de hoeveelheid oplossing in cryovials en bewaar de cryobuisjes bij 2-8 ° C.
  10. Voor celbehandelingen verdunnen toxine 1:100 hetzij gesteriliseerde PBS (pH 7,4) of onvolledige DMEM voor een uiteindelijke werkende concentratie van 1 ng / ul.
  11. Om cellen te behandelen met cholera toxine invoorbereiding MTT assays plaat cellen zoals hierboven beschreven.
  12. Na een uur wildgroei periode van 24, voeg de juiste concentraties van cholera toxine (voor onze concentratie, zie resultaten) worden getest om de putten na het gebruikt in vetzuur toepassingen (hierboven) procedures.
  13. Incubeer de behandelde platen gedurende 24 uren voordat de MTT assay.
  14. Als positieve (c positieve gehele papier) en negatieve controle (negatief c), zowel vetzuur en cholera toxine behandelingen, incubeer cellen met compleet medium en 70% ethanol, respectievelijk.
  15. Voor alle monsters en behandelingen gebruik minimaal drie replicaties (n = 3), met meer replicaties voor positieve controle (n = 6 in deze studie).

3. MTT assay

  1. Wordt MTT stockoplossing aan een concentratie van 2,5 mg / ml.
  2. Verwijder de oplossing in elk putje van de plaat met 96 putjes te testen en vervangen door 200 gl vers compleet medium oplossing.
  3. Advertentied 10 ul van de MTT oplossing in elk putje.
  4. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 3-4 uur.
  5. Gooi de media oplossing en voeg 100 ul van 0,04 M HCI in isopropanol aan elke well.
  6. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.
  7. De oplossing wordt uit elk putje naar een nieuwe centrifugebuis.
  8. Centrifugeer bij 20.000 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 min., of totdat een neerslag werd gevormd.
  9. Overdracht tussen 20-40 pi van elk monster een microplaataflezer.
  10. Lees absorptie bij 570 nm met een spectrofotometer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bepaling van de optimale concentratie van Fatty Acids

De optimale concentratie van vetzuren wordt gedefinieerd als de maximale concentratie waarbij de celgroei is vergelijkbaar met of groter dan die van de controle cellen met relatief lage variabiliteit in resultaten. Om de optimale concentratie van oliezuur bepalen werden linolzuur en linoleenzuur cellen aanvankelijk behandeld met verschillende concentraties van elk vetzuur in grote stappen en later met kleinere stappen. Figuur 1

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Suggestie van de concentratie van vetzuren en Cholera toxine

Hoewel het exacte mechanisme hoe de vetzuren mucosale immuniteit bekend, hebben verschillende studies geprobeerd om de positieve effecten te onderzoeken. Onze studie beoogt methode aan de maximale concentratie van vetzuren die cellen evenals de maximale concentratie van cholera toxine kan tolereren cellen kunnen verdragen zonder een significante invloed op celoverleving te bepalen.

Om de concentratie van d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs van deze studie geen financieel belang van de resultaten van dit onderzoek. Financiering voor deze studie werd aan FT verstrekt door Kean University, maar FT is momenteel een medewerker op Kingsborough Community College.

Dankbetuigingen

Wij danken Paula Cobos en Dr Evros Vassiliou voor lab bijstand en het verstrekken van de muis macrofagen, respectievelijk. We ons lab manager Richard Criasia danken ook voor begeleiding en hulp met materialen. Tot slot, de auteurs danken Ramanpreet Kaur voor hulp bij videoproductie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cellen/Reagens
Mus musculus macrofagenATCCATCC RAW 264.7
Dulbecco's Modified Eagle's MediumATCC30-2002
L-glutamineATCC30-2115
Fetaal bovien serum Bio-westS0250
Antibioticum/antimyoticum HycloneSV3007901
Menselijke intestinale epitheliale cellen ATCCATCC CCL-241
HybriCare media ATCC46-X
OleaanzuurSigma-AldrichO1008
LinolzuurSigma-AldrichL-1376
LinolenzuurSigma-AldrichL-2376
Cholera toxineSigma-AldrichC8052
Apparatuur
BD Falcon 96-Well Cell Culture PlatesBD Biosciences351172
Spectrofotometer met Dynex Revelations 4.22 softwareDynex91000101

Referenties

  1. Franceur, M. L., Golden, G. M., Potts, R. O. Oleic Acid: Its effects on stratum corneum in relation to (trans) dermal drug delivery. Pharm Res. 7 (6), 621-627 (1990).
  2. Tandon, P., et al. X-ray diffraction and spectroscopic studies of oleic acid-sodium acetate. Chem. Phys. Lipids. 109 (1), 37-45 (1990).
  3. Kris-Etherton, P. M. The debate about n-6 polyunsaturated fatty acid recommendations for cardiovascular health. Journal of the American Diabetic Association. 110 (2), 201-204 (2010).
  4. Rizzo, W. B., Phillips, M. W., et al. Adrenoleukodystrophy: dietary oleic acid lowers hexacosanoate levels. Annals of Neurology. 21 (3), 232-239 (1987).
  5. Bozan, B., Temelli, F. Chemical composition and oxidative stability of flax, safflower and poppy seed and seed oil. Bioresource Tech. 99, 6354-6359 (2005).
  6. Krein, S., Meldurm, H., Hawkins, S., Foy, V. Clinical benefits of conjugated linoleic acid to 3-dimensional wrinkle morphology. J. American Academy of Dermatology. 60 (3), AB30(2009).
  7. Yu, Y., Correll, P. H., Heuvel, P. J. Conjugated linoleic acid decreases production of pro-inflammatory products in macrophages: Evidence for a PPARy dependent mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1581 (3), 89-99 (2002).
  8. Palombo, J., Ganguly, A., Bistrian, B., Menard, M. The anti-proliferative effects of biologically active isomers of conjugated linoleic acid on human colorectal and prostatic cancer cells. Cancer Letters. 177, 163-172 (2002).
  9. Granda, M., Sinclair, A. J. Fatty acids and obesity. Current Pharm. Design. 15 (36), 4117-4125 (2009).
  10. Rosenstein, E., Kushner, L., Kramer, N., Kazandjian, G. Pilot study of dietary fatty acid supplementation in the treatment of adult periodontitis. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential F.A. 68 (3), 213-218 (2003).
  11. Ferretti, A., Flanagan, V. Antithromboxane activity of dietary alpha-linolenic acid: a pilot study. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 54 (6), 451-455 (1995).
  12. Arpita, C., Pradeep, K. D., Chowdhury, R. Effect of Fatty Acids and Cholesterol Present in Bile on Expression of Virulence Factors and Motility of Vibrio cholera. Infection and Immunity. 75 (4), 1946-1953 (2007).
  13. Yamasaki, S., Asakura, M., Neogi, S. B., Hinenoya, A., Iwaoka, E., Aoki, S. Inhibition of virulence potential of Vibrio cholerae by natural compounds. Indian J. Med. Res. 133 (2), 232-239 (2011).
  14. WHO | Efforts must be intensified to control Zimbabwe cholera outbreak [WHO PRESS RELEASE] [Internet]. , World Health Organization. Available from: http://www.who.int/csr/don/2009_01_30/en/ (2010).
  15. Hendriksen, R. S., Price, L. B., et al. Population Genetics of Vibrio cholerae from Nepal in 2010: Evidence on the origin of the Haitian outbreak. mBio. 2 (4), 1-6 (2011).
  16. Schaeffler, A., Gross, P., et al. Fatty acid-induced induction of Toll-like receptor-4/nuclear factor-kappa B pathway in adipocytes links nutritional signaling with innate immunity. Immunology. 126 (2), 233-245 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

VetzuurtolerantieCholeratoxineconcentratieMTT assayCelproliferatieVetzuuroplosbaarheidToxineverdunningsprotocolCelviabiliteitstestenOptimaal concentratiebereik

Gerelateerde artikelen