Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Metabole Labeling van leucine rich repeat Kinasen 1 en 2 met radioactieve fosfaat

9.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50523

⸱

18 september 2013

 ,  , 
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

In dit artikel

Samenvatting

Leucine rich repeat kinases 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn multidomain eiwitten die zowel GTPase en kinase domeinen coderen en die gefosforyleerd zijn in cellen. Hier presenteren we een protocol om LRRK1 en LRRK2 label in cellen met 32p orthofosfaat, waardoor een middel om hun algemene cellulaire fosforylering te meten.

Samenvatting

Leucine rich repeat kinases 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn paralogen die eenzelfde domein organisatie delen, waaronder een serine-threonine kinase domein, een Ras van complexe eiwitten domein (ROC), een C-terminale domein van ROC (COR), en leucine-rijke en ankyrine-achtige herhalingen in de N-terminus. De precieze cellulaire rol van LRRK2 LRRK1 en moeten nog worden opgehelderd, maar LRRK1 is betrokken bij tyrosine kinase receptor signalisatie 1,2, terwijl LRRK2 is betrokken bij de pathogenese van de ziekte van Parkinson 3,4. In dit rapport presenteren we een protocol bij de LRRK1 en LRRK2 eiwitten te labelen in cellen met 32p orthofosfaat, waardoor een middel om de algemene fosforylering niveaus van deze 2 eiwitten in cellen te meten. Kortom, affiniteit gelabeld LRRK eiwitten worden uitgedrukt in HEK293T cellen die zijn blootgesteld aan medium met 32P-orthofosfaat. De 32P-orthofosfaat wordt opgenomen door de cellen na enkeleuur incubatie en alle moleculen in de cel met fosfaten daardoor radioactief gelabeld. Via de affiniteit tag (3xflag) de LRRK eiwitten worden geïsoleerd van andere cellulaire componenten door immunoprecipitatie. Immunoprecipitaten worden dan gescheiden via SDS-PAGE, geblot op PVDF membranen en analyse van de opgenomen fosfaten wordt uitgevoerd door autoradiografie (32 P-signaal) en Western detectie (eiwit-signaal) van de eiwitten op de blots. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan fosforylering van andere eiwitten die tot expressie worden gebracht in cellen en geïsoleerd door immunoprecipitatie controleren.

Inleiding

Leucine rich repeat kinasen 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn multidomein paralogen die een soortgelijke domeinnaam organisatie delen. Beide eiwitten coderen een GTPase sequentie verwant aan de familie van Ras GTPases (Ras van complexe eiwitten, of ROC) en een C-terminale domein van ROC (COR), effectief classificeren beide eiwitten aan de ROCO eiwitfamilie 5,6. N-terminus van de ROC-COR domein tandem, beide eiwitten coderen een leucine-rich repeat domein en een ankyrine-achtige domein, terwijl slechts LRRK2 codeert extra armadillo domein 6-8. C-terminus van ROC-COR, beide eiwitten delen een serine-threonine kinase domein terwijl slechts LRRK2 codeert voor een WD40 domein in het C-terminale gebied 8. De precieze cellulaire rol van LRRK2 LRRK1 en moeten nog worden opgehelderd, maar LRRK1 is betrokken bij tyrosine kinase receptor signalisatie 1,2, terwijl genetische gegevens wijzen op een rol voor LRRK2 in de pathogenese van de ziekte van Parkinson 3,4.

De fosforylering van eiwitten is een gemeenschappelijk mechanisme in cellen. Bijvoorbeeld kan fosforylatie van essentieel belang voor de activering van enzymen of de werving van eiwitten aan een signaleringscomplex. De cellulaire fosforylering van LRRK2 is uitgebreid gekarakteriseerd en phosphosite mapping is gebleken dat een meerderheid van de cellulaire fosforylatieplaatsen te komen in een cluster tussen de ankyrin repeat en leucine rich repeat domeinen 9-11. Hoewel LRRK1 cellulaire fosforyleringsplaatsen zijn nog niet in kaart gebracht, gegevens uit studies met fosfoproteïne kleuring van blots van immunologisch LRRK1 eiwit van COS7 cellen suggereert dat LRRK1 eiwit is gefosforyleerd in cellen 12.

Dit document biedt een fundamentele protocol voor het testen van algemene fosforylering niveau van LRRK1 en LRRK2 in cellijnen met behulp van metabole labeling met 32 P-orthofosfaat. De algemene strategie is eenvoudig. Affiniteit tagged LRRK proteins worden uitgedrukt in HEK293T cellen die blootgesteld aan medium met 32P-orthofosfaat. De 32P-orthofosfaat wordt opgenomen door de cellen na enkele uren incubatie en alle moleculen in de cel met fosfaten daardoor radioactief gelabeld. De affiniteit tag (3xflag) wordt vervolgens gebruikt om de LRRK eiwitten van andere cellulaire componenten te isoleren door immunoprecipitatie. Immunoprecipitaten worden dan gescheiden via SDS-PAGE, geblot op PVDF membranen en analyse van de opgenomen fosfaten wordt uitgevoerd door autoradiografie (32 P-signaal) en Western detectie (eiwit-signaal) van de eiwitten op de blots.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het huidige protocol gebruikt radioactieve 32P gemerkt orthofosfaat om cellulaire fosforylering van LRRK2 volgen. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat alle handelingen met radioactieve reagentia moeten worden uitgevoerd met behulp van adequate beschermende maatregelen om blootstelling van radioactieve straling aan de exploitant en het milieu te minimaliseren. Verbindingen die isotopen die ioniserende straling uitzenden kan schadelijk zijn voor de menselijke gezondheid en strenge regels van toestemming en regelgeving op institutioneel en nationaal niveau controle het gebruik ervan. De experimenten in dit protocol werden uitgevoerd na een opleiding in de open gebruik stralingsbron aan de Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven) en na de goede richtlijnen van de gezondheid, veiligheid en milieu-afdeling van het universitair laboratorium praktijk. Verschillende stappen in ons protocol worden op grote schaal ingezet, zoals celkweek, SDS-PAGE, western blotting en gezien hier zijn de details van het protocol zoals toegepast in ons laboratorium. Het ishould worden opgemerkt dat de precieze experimentele omstandigheden variëren van laboratorium tot laboratorium, daarom specifieke maatregelen om de correcte afhandeling van de radioactieve stof moeten worden aangepast aan elke nieuwe laboratorium setting.

Gebruik van open source-straling is de voorafgaande goedkeuring van de regelgevende instantie die verantwoordelijk is voor open source-straling in het laboratorium onderzoek varieert van land tot land. Gebruikers moeten hun institutionele straling veiligheidsfunctionaris te raadplegen om ervoor te zorgen dat de procedure voldoen aan de plaatselijke regels en voorschriften. Informatie over regelgevende instanties kan worden gevonden: in België, het Federaal Agentschap voor Nucleaire Controle ( http://www.fanc.fgov.be , website in het Frans of Nederlands), in het Verenigd Koninkrijk, de Health and Safety Executive ( http: / / www.hse.gov.uk / straling / ioniserende / index.htm ), in de Verenigde Staten de NucLear Regulatory Commission ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), in Canada de Canadese Commissie voor nucleaire veiligheid ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), en in Duitsland Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Veiligheidsmaatregelen om dit protocol relevant zijn opgemerkt in de tekst gemarkeerd met de radioactieve klaversymbool ( figure-protocol-1 ).

1. Metabole Labeling van Cellen

  1. Bereid cellen voor etikettering.
    1. Cultuur HEK293T cellijnen volgens standaard kweekcondities (37 ° C, 5% CO2) in DMEM met 8% foetaal kalfsserum en gentamycine.
    2. Expand cellen voldoende omverkrijgen van ten minste 1 x 10 6 cellen per monster te testen.
    3. Trypsinize cellen en plaat uit in 6 well platen (35 mm diameter) op 10 6 cellen / well.
    4. 24 uur na plating cellen, brengen 3xflag-LRRK2 eiwit via transfectie of lentivirale vector bemiddelde transductie.
      1. Voor transfectie mix per monster 4 ug DNA (pCHMWS-3xflag-LRRK2 plasmide 13-15 of pCHMWS-3xflag-LRRK1 plasmide 15) en 8 pi lineair polyethyleenimine (PEI lineair, 1 mg / ml) in 80 pl DMEM (zonder toevoegingen ). Laat complexe 15-30 min voeg complex aan cellen door goed mengen in medium aanwezig.
      2. Voor lentivirale vector bemiddelde transductie, verdunnen lentivirale vector die codeert 3xflag-LRRK1 of -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, als vuistregel, transduceren met twee keer zoveel overdrachtselement eenheden, dwz het aantal functionele vector deeltjes, van lentivector aangezien er cellen) in het kweekmedium. Een beschrijving van het product ion van LV-3xflag-LRRK1 / 2 is eerder beschreven 15.
    5. Wanneer cellen 80-100% confluent (ongeveer 48 uur na transfectie of transductie), spoel cellen met voorverwarmde (37 ° C) DMEM zonder fosfaten.
  2. Label cellen met 32P-ortho-fosfaat.
    1. Houd in gedachten algemene beginselen van de veiligheid bij het werken met straling.
      1. figure-protocol-2 Voer alle handelingen met 32p in een aangewezen gebied straling.
      2. figure-protocol-3 Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen te worden gedragen - onder standaard procedure in ons laboratorium omvatten deze laboratoriumjas, dubbele handschoenen en een veiligheidsbril.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Alle werkzaamheden met 32P moet worden afgeschermd van gebruikers met 6 mm Perspex schermen om blootstelling te minimaliseren.
      4. figure-protocol-4 Persoonlijke monitoring devices moet altijd worden gebruikt - binnen KUL alle gecertificeerde open source straling gebruiker een film badge bevestigd aan de borstzak van de laboratoriumjas aan blootstelling aan straling te controleren tijdens experimenten draagt.
      5. figure-protocol-5 Alle experimentele oppervlakken worden gecontroleerd op radioactiviteit voor en na gebruik met een geigerteller.
      6. figure-protocol-6 Alle mogelijk besmet verbruiksartikelen dienen te worden vernietigd in strikte naleving van de institutionele richtlijnen voor ratief afval.
    2. Onder een laminaire stroming, bereid een Falcon buis met 2,1 ml DMEM zonder fosfaten (voorverwarmd tot 37 ° C) per 6-wells plaat van cellen te labelen.
      1. Bijvoorbeeld, om label cellen in ieder putje van een 6-well plaat, bereiden 12,6 ml medium (= 6 x 2.1). Dit is te voorzien in 2 ml medium wordt gebruikt per 6-wells plaat putje van cellen met een overmaat 5% in volume.
    3. figure-protocol-7 Bereid de bank waarmee de experimenten met ioniserende straling worden uitgevoerd. De werkruimte wordt gedekt door een lekkage mat waarop een beschermende voering van absorberend materiaal wordt geplaatst. In het geval u gebruik maakt van een liner met een waterdicht oppervlak, te plaatsen met de absorberende kant naar boven.
    4. figure-protocol-8 Ook voorzien ineen Perspex pot op de werkruimte en plaats de binnenband van fosfaatvrije medium in.
    5. figure-protocol-9 Neem de leiding gevoerd container met de flacon van 32 P gelabelde orthofosfaat uit de koelkast en breng het naar de radioactiviteit bank. Bewaken van de container voor uitwendige radioactieve besmetting met behulp van een geigerteller.
    6. figure-protocol-10 Verdun 32 P gemerkt orthofosfaat in de buis DMEM zonder fosfaat bij een concentratie van 24 uCi / ml.
      1. Opmerking: bij 2 ml per 6-wells plaat putje van cellen, komt dit overeen met 5 uCi 32P gemerkt orthofosfaat / cm2 van gekweekte cellen.
      2. figure-protocol-11 Houdende buis in de Perspex pot.
    7. figure-protocol-12 Sluit de kolf met de rest van de 32 gemerkte orthofosfaat en vervangen in de koelkast.
    8. figure-protocol-13 De 6-well platen met cellen uit de incubator en plaats op de radioactiviteit bank te worden aangebracht.
    9. figure-protocol-14 Verwijder medium supernatant af en gooi. Voeg 2 ml fosfaatvrije medium dat 32 P gemerkt orthofosfaat / putje.
    10. figure-protocol-15 Plaats de cultuur platen in een plexiglas doos vervolgens de container fo bewakenr uitwendige radioactieve besmetting met behulp van een geigerteller.
    11. figure-protocol-16 Breng de perspex doos met cellen van een eukaryotische cel incubator gewijd aan isotopische metabolisch merken.
    12. figure-protocol-17 Incubeer gedurende 1-20 uur bij 37 ° C in 5% CO2.
      1. In het algemeen wordt een opname van 3 uur of meer geadviseerd. De optimale incubatietijd kan worden beoordeeld door de tijd natuurlijk experimenten voor elke specifieke eiwit zoals gewenst.
    13. figure-protocol-18 Optioneel: cellen te behandelen met verbinding.
      1. In experimenten met behandeling met verbinding (bijvoorbeeld een kinase remmer), is een verbinding behandelingsstap opgenomen, na eenvrijwaart de oorspronkelijke incubatietijd zonder verbinding te houden met de etikettering. Na de gewenste incubatietijd, het vak Perspex met de kweekplaten worden uit de incubator verwijderd en de radioactiviteit bank gebracht.
      2. figure-protocol-19 Labeling medium verwijderd en vervangen door voorverwarmd fosfaat vrij medium waarin de verbinding wordt verdund tot de gewenste concentratie. Gooi medium in een 50 ml buis voor afvalinzameling die wordt geplaatst in de Perspex pot.
      3. figure-protocol-20 Cellen worden vervangen in het vak perspex en geplaatst in de cel incubator voor de gewenste contacttijd.
  3. figure-protocol-21 Verzamel lysaten van Labeled cellen.
    1. figure-protocol-22 Verwijder medium uit cellen en gooi in de afvalinzameling buis die is geplaatst in de Perspex pot.
    2. figure-protocol-23 Rinse cellen 2x met ijskoude TBS (Tris 50 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4, 2 ml / spoelen), waarbij spoeling oplossing in een verzameling afval buis in de Perspex pot.
    3. figure-protocol-24 Voeg 0,5 ml ijskoud immunoprecipitatie (IP) lysebuffer aan elk putje en verzamel lysaat door pipetteren lysaat op en neer om alle gelyseerde cellen los te maken.
      1. Bereid de vereiste volume IP lysebuffer (0,5 ml / monster plus 5% overmaat) van tevoren, het toevoegen van de proteaseremmercocktail en fosfataseremmer cocktail verse vlak voor gebruik.
      2. De samenstelling van de lysis buffer Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton 1%, glycerol 10%, proteaseremmer cocktail en fosfatase-inhibitor cocktail.
    4. figure-protocol-25 Breng het lysaat naar een microcentrifugebuis en incubeer op ijs gedurende ten minste 10 minuten.
    5. figure-protocol-26 Centrifugeer de lysaten in een microcentrifuge bij> 5000 xg gedurende 10 minuten.
    6. figure-protocol-27 Afvoeren van radioactief afval in daarvoor bestemde bakken die achter plexiglas schilden worden opgeslagen.

2. Analyseer Labeling van eiwitten van belang

  1. figure-protocol-28 Isoleer eiwit van belang door immuunzuivering (IP).
    1. figure-protocol-29 Breng de microcentrifugebuizen met gecentrifugeerd lysaten terug naar ijs en pipet de bovenstaande vloeistof in een microcentrifugebuis met 10 pl bed volume van evenwicht gebracht vlag-M2 agaroseparels.
      1. Bereid de buizen met geëquilibreerde vlag-M2 agaroseparels van tevoren.
      2. Hiervoor pipet een volume van vlag-M2 agarose slurry overeenkomt met 10 pl bed volume per monster plus een overmaat van 5%.
        1. Algemeen een 10 gl bedvolume van parels overeen met 20 pl suspensie. Raadpleeg de product data sheet voor meer informatie.
      3. Equilibreer de kralen door spoelen 3x in 10 volumes (ten opzichte van bed volume) van IP lysebuffer.
      4. Verdeel in evenwicht kralen gelijkmatig op 10 pl bed volume / buis in evenveel buizen als er monsters. Label de buizen met een identifier voor elk monster.
    2. figure-protocol-30 Breng de microcentrifugebuizen tot 50 ml buizen (ongeveer 6 microcentrifugebuisje tubes/50 ml tube) gelabeld met een radioactieve klaversymbool en blijf op ijs.
    3. figure-protocol-31 Transfer monsters naar een roterend apparaat achter een perspex schild in het aangewezen gebied van een koude ruimte voor over de kop mengen bij 4 ° C gedurende 1-20 uur.
    4. figure-protocol-32 Breng de monsters naar een aangewezen werkruimte op ijs.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Spin down van het eiwit gebonden vlag-M2 agaroseparels in een microcentrifuge (1000 xg, 1 min) en de bovenstaande vloeistof in een verzameling afval buis.
    6. figure-protocol-33 Was de eiwitgebonden vlag-M2 agaroseparels door resuspenderen in 1 ml IP wasbuffer.
      1. Samenstelling van IP wasbuffer: Tris 25 mM pH 7,5, NaCl 400 mM, Triton 1%. Aanbevolen wordt ook protease en fosfatase remmers omvatten in wasbuffer voor eiwitten gevoelig zijn voor afbraak door proteasen medezuiverende of defosforylering door medezuiverende fosfatasen.
      2. figure-protocol-34 Spin down de eiwitgebonden vlag-M2 agaroseparels in een microcentrifuge (1000 xg, 1 min) en de bovenstaande vloeistof in een verspilling collectietie buis.
      3. figure-protocol-35 Herhaal de wasstap 3x.
    7. figure-protocol-36 Na het wassen, resuspendeer de kralen in 1 ml IP spoelbuffer (Tris 25 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM dithiothreitol (DTT) 2 mM, Triton 0.02%, beta-glycerofosfaat 5 mM, Na VO 3 4 0,1 mM).
    8. figure-protocol-37 Spin down het eiwit gebonden vlag-M2 agaroseparels in een microcentrifuge (1000 xg, 1 min) en de bovenstaande vloeistof in een verzameling afval buis. Verwijder alle overtollige buffer.
    9. figure-protocol-38 Resuspendeer kralen in 40 & mU, l IP monster SDS laadbuffer (Tris-HCl 160 mM pH 6,8, 2% SDS, 0,2 M DTT, 40% glycerol, broomfenolblauw 2 mg / ml).
      1. Monsters kunnen direct worden geanalyseerd of opgeslagen in een -20 ° C vriezer gedurende latere analyse.
        1. figure-protocol-39 Voor de opslag van monsters bij -20 ° C, plaats monsters buishouders of dozen in een perspex doos in een radioactief gemerkte klaversymbool diepvriezer bestemd voor opslag van radioactieve monsters.
    10. figure-protocol-40 Afvoeren van radioactief afval in daarvoor bestemde bakken die achter plexiglas schilden worden opgeslagen.
  2. figure-protocol-41 Resolve IP monsters via SDS-PAGE en blot op PVDF membraan.
    1. figure-protocol-42 Warmte monsters laadbuffer tot 95 ° C gedurende 2 minuten en centrifugeer gedurende 1 minuut bij> 1000 xg om de kralen pellet.
    2. figure-protocol-43 Bereid de eiwit gelelektroforese module op de radioactiviteit bankje achter een perspex scherm.
    3. figure-protocol-44 Samples op een 3-8% tris-acetaat SDS-PAGE gels.
      1. Dit type gel geschikt voor het oplossen van hoog molecuulgewicht (HMW) eiwitten. Andere gel vormen kunnen eveneens geschikt, zoals een 4-20% Bis-Tricine gel of Tris-glycine 4-20% gels.
      2. Voeg een molecuulgewicht merker die geschikt is om de grootte van HMW proteïnen herkennen.
    4. figure-protocol-45 Voer elektroforese bij 150 V gedurende 1 uur.
    5. figure-protocol-46 Na elektroforese, verwijdert u de gel uit de plastic behuizing en breng de gel om een ​​container met Western blotting overdracht buffer.
      1. Samenstelling van Western blotting overdracht buffer: Tris 50 mM, 40 mM glycine, 0,04% SDS, 20% methanol.
      2. figure-protocol-47 Knip de delen van de gel die uitsteken zoals ook scheiders en onderste gedeelte van de gel die uitsteekt.
    6. Bereid een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan per gel door dompelen in methanol gedurende 1 min, daarna in transferbuffer.
      1. Membranen worden gesneden om de s ame grootte als de gel plus een marge van 3 mm.
    7. Plaats een semi-droge blotting module op de radioactiviteit bank en verwijder het deksel en de bovenste elektrode plaat.
    8. figure-protocol-48 Bereid de blotting sandwich op het oppervlak van de semi-droge blotting module.
      1. Bevochtig een extra dik (2,5 mm dik, 7,5 x 10 cm groot) deppen filter in overdrachtbuffer en plaats op bodemplaat van de blotting module.
      2. figure-protocol-49 Plaats het pre-natte PVDF membraan aan de blotting filter.
      3. figure-protocol-50 Plaats voorzichtig de gel op de PVDF-membraan en verwijder eventuele luchtbellen.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Maak de vlek sandwich door het bevochtigen van een extra dikke blotting filter in overdrachtbuffer en plaats op de bodemplaat van de blotting module. Verwijder alle lucht bubbels uiteindelijk in de blotting sandwich.
        Merk op dat de hier gegeven beschrijving is verenigbaar met de BioRad trans-blot SD systeem waarbij elektroden zodanig dat eiwitten migreren naar beneden op het membraan. Andere blotting systemen zijn ook compatibel met deze stappen met kleine aanpassingen zoals die uiteindelijk nodig om rekening te houden met andere blotting richting of, bij tank blotting, extra vloeibaar afval worden verwijderd op dezelfde wijze als de elektroforese buffer kiezen.
    9. figure-protocol-51 Verwijder alle overtollige buffer met een absorberende tissue en plaats de bovenplaat en de cover van de semi-d ry blotting module.
    10. figure-protocol-52 Transfer eiwitgehalte bij 15 V gedurende 1-2 uur.
    11. figure-protocol-53 Gedurende deze tijd, het schoonmaken van de elektroforese-module.
      1. figure-protocol-54 Afvoeren van radioactief afval in daarvoor bestemde bakken die achter plexiglas schilden worden opgeslagen.
      2. figure-protocol-55 Spoel de elektroforese-module met gedestilleerd water (AD) en het spoelwater weggooien in de vloeibaar radioactief afval container.
    12. 0523/50523rad1.jpg "/> Na overdracht, verwijder het PVDF membraan met geblotte eiwitten uit de blotting module.
    13. figure-protocol-56 Optioneel: voer een Ponceau S kleuring van uitgewist eiwitten om eiwitten te visualiseren.
      1. figure-protocol-57 Breng de vlek naar een ondiepe vlek incubatie vat met Ponceau S oplossing en incubeer gedurende 5 minuten.
      2. figure-protocol-58 Snel spoelen 2x in het jaar.
    14. figure-protocol-59 Droog het membraan.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Uitvoeren autoradiografie.
    1. figure-protocol-60 Expose de membraan een fosforescentie plaat voor 1-5 dagen.
    2. figure-protocol-61 Lees de 32P off van de blootgestelde fosforescentie plaat met behulp van een Storm 840 fosforescentie scanner of gelijkwaardig en het beeld opslaan als een hoge resolutie tiff.
  4. figure-protocol-62 Detecteren eiwit niveaus via immunodetectie.
    1. figure-protocol-63 Rehydrateren de membranen door dompelen ze kort in methanol en vervolgens over te dragen aan een ondiepe vlek incubatievaatje met PBS.
    2. figure-protocol-64 Blokkeer de membranen in PBS-T (PBS met 0,1% Triton) met 5% melk.
    3. figure-protocol-65 Incubeer de blots met anti-LRRK2 antilichaam 13,16 of anti vlag antilichaam en proces verder met de juiste wassen stappen en secundair antilichaam incubatie.
    4. figure-protocol-66 Voer chemiluminescentie detectie om de relatieve eiwitniveaus van LRRK2 bevestigen.
  5. Kwantificeren incorporatie van 32P in LRRK2.
    1. Voer densitometrische analyse van de banden op de vlek autoradiogrammen en immunologische met behulp van geschikte software zoals ImageJ software, een freeware programma beschikbaar op de National Instnotulen van Volksgezondheid website ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Bereken fosfaatgehalte oprichting als de verhouding van de autoradiografische signaal over de immunologische niveau.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de algemene fosforylering niveaus van LRRK1 en LRRK2 vergelijken in cellen, 3xflag gelabeld LRRK1 en LRRK2 werden uitgedrukt in HEK293T cellen 15. Cellen werden gekweekt in 6-well platen en gemerkt met 32P en geanalyseerd zoals hiervoor in de tekst beschreven protocol. Figuur 1 geeft representatieve resultaten voor metabolisch merken van LRRK1 en LRRK2 in HEK293T cellen. Radioactief fosfaat opname wordt waargenomen voor zowel LRRK1 en LRRK2. Bij kwantificering van de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit document biedt een fundamentele protocol voor het testen van algemene fosforylering niveau van LRRK1 en LRRK2 in cellijnen met behulp van metabole labeling met 32 P-orthofosfaat. De algemene strategie is eenvoudig. Affinity LRRK tagged eiwitten worden uitgedrukt in HEK293T cellen die zijn blootgesteld aan medium met 32P-orthofosfaat. De 32P-orthofosfaat wordt opgenomen door de cellen na enkele uren incubatie en alle moleculen in de cel met fosfaten daardoor radioactief gelabeld. De a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zijn ook dankbaar voor de Michael J. Fox Foundation ter ondersteuning van deze studie. Wij danken het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen FWO (FWO-project G.0666.09, senior onderzoeker fellowship aan JMT), het IWT SBO/80020 project Neuro-TARGET, de KU Leuven (OT/08/052A en IOF-KP/07 / 001) voor hun steun. Dit onderzoek werd mede ondersteund door het Fonds Druwe-Eerdekens beheerd door de Koning Boudewijnstichting om JMT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fosfor-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer dinatriumfosfaat in 1 ml waterPerkin ElmerNEX011001MC
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle Medium (D-MEM) (1X), vloeibaar (hoge glucose)Invitrogen11971-025Dit medium bevat geen fosfaten
Anti Flag M2 affiniteit gelSigmaA2220Voor een gelijkwaardig product met rood gekleurde gel (handig om de kralen gemakkelijker te visualiseren), gebruik cat. Nr. F2426.
Extra dikke blotting filterBio-Rad1703965
Ponceau S-oplossingSigmaP7170

Referenties

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158(2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472(2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16(2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153(2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

LRRK1 LRRK2ImmunoprecipitatieSDS-PAGEAutoradiografieWestern blotHEK293T-cellenFosforyleringsanalyseRadioisotoopdetectie
Metabole Labeling van leucine rich repeat Kinasen 1 en 2 met radioactieve fosfaat
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.